Ce travail a été financé par NEURON-ERANET DISCover (BMBF 01EW1003) à CK et JPH, DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) à CKVB est soutenu par une subvention de l&#39;Forschungskommission de la Faculté de médecine de l&#39;Université de Düsseldorf.

1. Préparation des cellules donateurs Aggresome: Transfection de monomère Red Fluorescent Protein (mRFP) ou Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP)-Longueur étiqueté humain complet (FL) DISC1 <ol><li> Graine de 1,5 x 10 6/10 cm neuroblastome humain plat NLF (NLF; Hôpital pour enfants de Philadelphie, Philadelphie, PA) des cellules dans dix boîtes de 10 cm et se développer durant la nuit. Cellules du FLN sont cultivées dans du RPMI-1640 supplémenté avec 10% de FBS, pénicilline / Strepomycin, L-glutamine. Le lendemain, les cellules doivent être à 70-80% de confluence. </li><li> Transfecter de manière transitoire chaque plat 10 cm avec 15 pg d&#39;ADN plasmidique et réactif de transfection Metafectene (Biontex, Martinsried, Allemagne). En bref, pour un plat de 10 cm, 15 ug d&#39;ADN plasmidique et 30 Metafectene ul ont été ajoutés à 750 ul d&#39;Opti-MEM, mélangés et incubés à température ambiante pendant 20 min. 5 plats ont été transfectées avec pcDNA3.1 mRFP / eGFP-étiquette de l&#39;homme (FL) DISC1 et 5 plats avec le seul eGFP-plasmide. </li></ol> 2. AggresomePurification à partir de cellules transfectées donateurs Le protocole décrit ici est une combinaison d&#39;une méthode pour purifier Lewy-organismes à partir du 13 tissu cérébral et un protocole pour isoler gros agrégats et aggresomes 14. Puisque les méthodes existantes sont basées sur l&#39;utilisation de détergents, l&#39;isolement des sans détergent protéines pour l&#39;application dans la cellule-invasif des tests est cruciale. <ol><li> 48 heures après la transfection, contrôler l&#39;expression de eGFP et mRFP/eGFP-DISC1 et confirmer la formation de aggresomes sous un microscope à fluorescence (Figure 1). </li><li> Laver les cellules avec du PBS pH 7,4, gratter avec 400 ul de PBS chacun, ajouter 1X cocktail inhibiteur de la protéase (Roche, Indianapolis, IN) et de perturber les cellules en utilisant un homogénéisateur Precellys24 (Bertin Technologies, France). En bref, ajouter 1 ml de suspension cellulaire à un tube de 2 ml lyse et ajouter 10 billes de céramique. Lyse des cellules avec 3 impulsions x 60 sec. La force mécanique du processus peutaugmenter la température à l&#39;intérieur de l&#39;échantillon supérieure à 37 ° C si les soins doivent être prises pour refroidir l&#39;échantillon sur la glace après la procédure de lyse. </li><li> Refroidir les cellules sur de la glace et ajouter 10 mM MgCl 2, 40 U / ml de DNase A et incuber pendant 60 min à 37 ° C </li><li> Préparer des solutions de 80%, 50%, de saccharose 20% (p / v) dans du PBS pH 7,4 (10 ml de chaque). </li><li> Préparer le gradient de saccharose dans un tube Falcon de 15 ml à partir de 2 ml de saccharose à 80%, puis 50% et 20%. Verser lentement la pente et faire attention à ne pas déranger les couches déjà versé. Le lysat digéré couche au-dessus de la pente et centrifuger pendant 15 min à 1000 xg à 4 ° C. </li><li> Recueillir soigneusement l&#39;interphase entre la couche de saccharose 50-80% avec une pipette et mélanger avec 5 volumes de PBS pH 7,4. Centrifuger pendant 15 minutes à 1000 xg à 4 ° C. Répétez laver deux fois de plus. Dans cette interphase, aggresomes sont fluorescentes et peuvent être visualisées au microscope sous lumière UV. </li><li> Jeter le surnageant etremettre en suspension le culot dans du PBS pH 250-500 ul 7.4. Ce culot contient le aggresomes purifiée (Figure 2). </li></ol> 3. Traitement des bénéficiaires cellules SH-SY5Y avec mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes <ol><li> Graine 5 x 10 4 bénéficiaires SH-SY5Y cellules de neuroblastome humain exprimant de manière constitutive la GFP-DISC1 (598-854) sur des lamelles de verre stériles dans chaque puits d&#39;une plaque à 24 puits. SH-SY5Y cellules sont cultivées dans un milieu supplémenté avec DMEM/F-12 pénicilline / streptomycine, non-acides aminés essentiels (AANE) et 10% de FBS. </li><li> 24 heures plus tard, ajouter 10 ul à chaque puits et incuber pendant 48-72 h. </li><li> Laver les cellules avec du PBS 3 x pH 7,4 et éteindre la fluorescence extracellulaire avec 0,04% bleu trypan pendant 5 min. </li><li> Fixer les cellules avec 4% de PFA dans du PBS pH 7,4 pendant 10 min sur la glace, laver une fois avec H 2 O stérile et monter les lamelles sur des lames de verre avec ProLong or avec DAPI milieu de montage (Invitrogen, USA). </li><li> Confirmer l&#39;absorption /invasion de manière exogène aggresomes appliquées par colocalisation avec des protéines exprimées par des cellules recrutées bénéficiaires à Z-stack images. </li></ol> Pourtant, l&#39;adoption / l&#39;invasion de la protéine exogène peut ne pas être détecté essentiellement en parallèle avec le recrutement de protéine de cellule hôte. Dans notre exemple mRFP-étiqueté DISC1 aggresomes recrue soluble GFP-étiqueté DISC1 (598-854) protéine exprimée par la cellule hôte (voir figure 3). Les photos ont été prises sur une confocal Zeiss LSM 510 ou un microscope Zeiss AxioVision Apotome2. 4. Génération de DISC1 recombinant (598-785) Dans une publication précédente, nous avons analysé la capacité de divers fragments de protéine DISC1 à l&#39;auto-interaction basée sur la présence d&#39;auto-association domaines. Parmi toutes les protéines humaines fragments testés DISC1 (598-785) affiché la plus forte propension à la multimérisation 4 (figure 4). Par conséquent, l&#39;homme DISC1 (598-785) a été cloné dans pET15b (Nonvagen, Madison, Wisconsin) contenant un tag 6-histidine N-terminale, exprimé dans E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, États-Unis), et purifiée dans des conditions dénaturantes à 8 mol / l d&#39;urée, comme décrit 4. En bref, le protocole est décrit ci-dessous. <ol><li> BL21-(IDE3) Rosetta E. coli ont été cultivées dans 2 x 500 ml 2YT contenant 5 mM-arginine-HCl, 5 mM MgSO4, 100 pg / ml carbénicilline, 35 pg / ml de chloramphénicol jusqu&#39;à une DO 600: 0.6-0.8 et DISC1 (598-785) l&#39;expression a été induite avec 1 mM d&#39;IPTG. </li><li> DISC1 (598-785) a été exprimé pendant 4 heures à 37 ° C, l&#39;expression a pris fin en récoltant les bactéries par centrifugation. </li><li> Le culot bactérien est remis en suspension dans 50 ml de tampon TE (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) et 2 mM de PMSF, 1% de TX-100, 250 pg / ml de lysozyme, 20 mM de MgCl2 et 400 U/50 ml DNase I. Pour assurer une lyse complète, la réaction a été incubée pendant 30 min à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Ajouter 10 mM β-mercaptooethanol (ME) et 500 mM de NaCl et incuber pendant 30 min supplémentaires. </li><li> Isoler des corps d&#39;inclusion bactériens à 20.000 g pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Resuspendre le culot dans 50 ml de tampon d&#39;extraction contenant 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM d&#39;imidazole, 500 mM de NaCl, 8 M d&#39;urée et 10 mM β-ME et enlever les débris par centrifugation à 20,000 g pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Laver le Ni-NTA agarose matrice avec un tampon d&#39;extraction. Incuber la suspension d&#39;, extrait de protéine précontrôlés avec matrice Ni-NTA pendant 2 heures à température ambiante. </li><li> Laver la matrice Ni-NTA avec un tampon d&#39;extraction contenant 12 mM d&#39;imidazole. </li><li> Éluer la protéine lentement avec 15 ml de tampon d&#39;élution contenant 50 mM de Tris, 500 mM NaCl, 300 mM d&#39;imidazole, urée 8 M, PMSF 1 mM, 5 mM d&#39;EDTA et 10 mM de β-ME. </li><li> Dialyser la protéine par étapes pour PBS pH 7,4 contenant 10 mM de β-ME. </li></ol> De 1 L de culture bactérienne de départ, il est possible d&#39;isoler jusqu&#39;à 50 mg de recombinaison DISC1 (598-785) protein. α-synucléine repliement Pour les expériences avec α-synucléine, 500 ug de la protéine recombinante (Sigma-Aldrich, USA) a été dissous dans du PBS à une concentration de 1 mg / ml. Pour obtenir des oligomères, repliement a été effectuée durant la nuit à 37 ° C comme décrit dans une publication précédente 10. 5. L&#39;étiquetage des DISC1 recombinant (598-785) avec DyLight594 <ol><li> Avant le processus de repérage ultérieur, DISC1 (598-785) protéine a être libéré de la β-ME. Par conséquent, la protéine est dialysée 3 fois au PBS pH 7,4 à une dilution de 1:2000. </li><li> Étiquette 1 mg DISC1 (598-785) avec DyLight 594 maléimide (Thermo Scientific, USA) selon les instructions du fabricant. En bref, dissoudre 1 mg / ml de protéine dans du PBS pH 7,4 et ajouter 5 PTCE mM de récupérer des groupes thiols libres. Ajouter 20 ul du colorant DMF dissous à la réaction et incuber pendant 2 heures à température ambiante. </li><li> Dialyser la protéine 3 x à PBS pH7,4 dans un rapport de 1:2000 à 2 heures chacune. </li></ol> Pour augmenter encore la pureté de la protéine marquée d&#39;une étiquette 6-Son affinité basée sur la purification sur une colonne de Ni-NTA est effectuée. <ol start="4"><li> Lavez 1 ml matrice Ni-NTA (Qiagen, Allemagne) avec 10 ml de PBS pH 7,4. </li><li> Appliquer l&#39;étiquette, protéine dialysée à la colonne et le laisser tourner au-dessus de la colonne lentement. </li><li> Laver la protéine avec 3 x 20 ml de PBS pH 7,4 </li><li> Éluer la protéine avec du PBS pH 7,4, 500 mM d&#39;imidazole, goutte à goutte, tout en surveillant la bande de couleur sur la colonne Ni-NTA à réduire le volume de l&#39;éluat. </li><li> Dialyser l&#39;éluat de 3 x à 10 mM NaPi pH 7,4 à une dilution de 1:2000 pendant 2 heures chacune. </li><li> Utiliser une seringue stérile 0,45 um filtre pour filtrer l&#39;éluat, aliquote de 5 x 100 pi des échantillons et congeler pression dans l&#39;azote liquide. Le montant total des protéines doit être de 0,5 à 1 mg / ml dans chaque aliquote de 100 ul. </li></ol> option concentrtion étape <ol start="10"><li> Pour les injections stéréotaxiques rat, la protéine a été concentrée 10 fois dans un speed-vac (Concentrateur Eppendorf 5301). L&#39;état tampon final était de 100 NaPi mM. </li></ol> α-synucléine étiquetage Le marquage et de purification (colonne Ni-NTA) de la α-synucléine recombinante a été réalisée en parallèle à DISC1 (598-785). Le total du matériau de départ était 500 pg au lieu de 1 mg pour DISC1 (598-785). 6. Traitement des bénéficiaires cellules SH-SY5Y avec marqué DISC1 recombinant (598-785) Protéine <ol><li> Semences 5x10 4 bénéficiaires SH-SY5Y cellules de neuroblastome humain exprimant de manière constitutive la GFP-DISC1 (598-854) sur des lamelles de verre stériles dans chaque puits d&#39;une plaque à 24 puits. </li><li> Ajouter protéine marquée au milieu de culture cellulaire à une concentration de 5-10 pg / ml et incuber pendant 48-72 h. </li><li> Laver les cellules avec du PBS 3 x pH 7,4 et étancher extractionfluorescence ellular avec 0,04% bleu trypan pendant 5 min. </li><li> Fixer les cellules avec 4% de PFA dans du PBS pH 7,4 pendant 10 min sur la glace, laver une fois avec H 2 O stérile et monter les lamelles sur des lames de verre avec ProLong or avec DAPI milieu de montage (Invitrogen, USA). </li><li> Confirmer l&#39;adoption / l&#39;invasion de manière exogène appliquée protéine recombinante par colocalisation avec des protéines exprimées par des cellules recrutées bénéficiaires à Z-stack images générées par microscopie confocale à balayage laser. Pourtant, le recrutement de protéine endogène peut pas être détectée essentiellement en parallèle avec l&#39;invasion de protéine de cellule hôte, Z-stack images peut encore confirmer le caractère invasif de la protéine. </li></ol> Dans notre exemple, rec. DISC1 (598-785) * au moins en partie soluble recrues GFP-étiqueté DISC1 (598-854) protéine exprimée par la cellule hôte (voir figure 5A). Pour recombinant invasion α-synucléine, mais aucun recrutement est montré (figure 5B). Les photos ont été prisessur un Zeiss LSM 510 confocal Zeiss ou un microscope AxioVision Apotome2. L&#39;injection du concentré (environ 4 pi de 2,5 pg / pl), étiqueté DISC1 (598-785) * dans les résultats Mpfc dans la diffusion de la protéine autour du site d&#39;injection qui peut être détecté même après la perfusion de l&#39;animal avec 4% dans du PBS pH 7,4 PFA avec un filterset rhodamine. Dans notre exemple DISC1 (598-785) est repris par un nombre distinct de neurones et peut être contrôlé avec Z-stack d&#39;imagerie (figure 6). En général, l&#39;injection de protéines autres que celles utilisées ici ne conduisent pas nécessairement à la cellule-invasion. L&#39;événement invasion dépend essentiellement de la nature de la protéine néanmoins une purification propre est une condition préalable à une analyse plus approfondie. 7. Les résultats représentatifs Aggresomes consistant recombinant FL DISC1-eGFP purifiée à partir de cellules du FLN a envahi destinataire SH-SY5Y CElls à faible rendement (environ 0,3% 5) comme on le voit par la colocalisation en microscopie confocale (figure 3). Comme indiqué précédemment, DISC1 (598-785) exprimée et purifiée à partir de E. coli formée multimères 4 sont également des cellules invasives dans un rendement d&#39;environ 20% 5 (figure 5A) similaire à celui de α-synucléine qui a été utilisé en parallèle comme contrôle positif (figure 5B). Étiquetés DISC1 recombinant (598-785) exprimée et purifiée à partir de E. coli a également été cellulaire invasive pour les neurones in vivo lorsque la protéine multimérique a été stéréotaxique injecté dans le cortex médial préfrontal de rat (figure 6; Pum, Bader, Huston, Korth, non publié). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Cellules de neuroblastome FNL exprimant de manière transitoire FP-DISC1 (rouge). Red aggresomes fluorescents peuvent être detela Direction exécutive dans les cellules. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Purifiée mRFP-marqué DISC1 aggresomes après la purification dans un gradient de saccharose. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Fluorescent image de aggresomes envahies. mRFP-étiquette flDISC1 aggresomes ont été purifiées et incubées avec des cellules de neuroblastome SH-SY5Y surexprimant GFP soluble étiquetée DISC1 (598-854). Un apport de aggresomes étiquetés est contrôlée par Z-stack imagerie sur un microscope à balayage laser (Zeiss LSM 510). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. SEC profil de rec. DISC1 (598-785) contenant le S704 et C704 les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP). Les deux variantes montrent une perturbation d&#39;oligomérisation commandé et la formation de mult haut poids moléculaireIMERS (flèche rouge). Cette image est modifié à partir de la publication de Leliveld et al., Biochemistry 2009. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Fluorescent Z-stack image de DyLight marqué invasive DISC1 recombinant (598-785). Les cellules de neuroblastome SH-SY5Y exprimant la GFP-DISC1 soluble (598-854) ont été incubées avec étiquette, la protéine recombinante à une concentration de 5 pg / ml. (A) des agrégats Rouge montre l&#39;invasion de rec. DISC1 (598-785) des protéines et des points jaunes indiquent un recrutement de GFP-DISC1 soluble (598-854) en agrégats. (B) recombinante α-synucléine (rouge) envahit les cellules sans recrutement avec une fréquence d&#39;environ 20%. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6. Image immunofluorescence del&#39;injection marqué, DISC1 recombinant (598-785) de protéine. Z-stack imagerie confirme la présence de rec. DISC1 (598-785) des protéines dans les neurones corticaux de rat tachés avec un anticorps contre les noyaux des neurones (NeuN, vert).

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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+aggresomes+and+other+large+aggregates.">Isolation of aggresomes and other large aggregates.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).</li><li>Korth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DISCopathies:+brain+disorders+related+to+dysfunctional+DISC1.">DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1.</a> Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans cette étude, nous décrivons la purification de mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes à partir d&#39;une lignée cellulaire de neuroblastome transfectée, la préparation et l&#39;étiquetage d&#39;un DISC1 espèces de protéines recombinantes et leur application dans la cellule à l&#39;invasion de cellules réceptrices des expériences in vitro et in vivo. La purification des indigènes mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes a été développé à partir de protocoles d&#39;isoler le corps de Lewy-comme les structures et les grands agrégats 13, 14, mais modifié pour éviter l&#39;utilisation de détergents et de minimiser le risque de faux positif cellulaire invasion qui pourrait se produire due à la pénétration de la membrane détergent facilitée. Une amélioration future possible pourrait être la pour augmenter encore la pureté des aggresomes par sonication de séparer complètement les membranes restantes et du cytosquelette des aggresomes. Par la pureté générale à la hausse, le nombre d&#39;événements d&#39;invasion totale à celui enregistré pour les grandes aggresomes may être augmenté de 5. Que la définition limitée de notre suggère 3-phase de saccharose est suffisante pour aggresomes d&#39;espèces autres protéines doit être testé, en ce sens, le protocole décrit ici doit être considérée comme un point de départ pour l&#39;optimisation individuelle. Les aggresomes purifiés s&#39;est avéré très robuste dans nos mains, les étapes de lavage supplémentaires (sans détergent) pour éliminer les traces de saccharose n&#39;a pas réduit significativement le rendement global. Dans une publication précédente, nous avons décrit cette assemblée oligomère de DISC1 dépend domaines de multimérisation distinctes dans l&#39;extrémité C-terminale 4 (figure 4). Nous avons choisi ce fragment pour l&#39;expression recombinante soluble dans E. coli et ultérieures et Ni-NTA purification. Pour surveiller son multimérisation et de comparer son caractère invasif de cellules avec un cellulaire invasive décrite comme la protéine α-synucléine, nous avons appelé DISC1 (598-785) avec le colorant fluorescent DyLight594, et ont comparé soncellules envahissant avec celle de tout aussi marqué α-synucléine. La cellule-invasif de la recombinaison DISC1 fragment a été considérablement augmenté par rapport à celui des indigènes, pleine longueur DISC1 aggresomes, probablement en raison de sa petite taille et la pureté beaucoup plus élevé. Encore une fois, la pureté semble jouer un rôle décisif dans la cellule-invasif. Dans notre exemple, les aggresomes invasives recruté protéine homologue soluble de la lignée cellulaire cible qui a été exprimée sous forme recombinante soluble dans un, c&#39;est à dire des cellules sous forme dispersée. L&#39;expression d&#39;une protéine fluorescente (GFP ou RFP, par exemple) dans la ligne de cellule receveuse est un avantage, car il permet la co-localisation de aggresomes invasives et de protéines recombinantes à l&#39;intérieur de la limite de cellule receveuse par Z-pile imagerie. Aggresomes DISC1 cellules invasives et des fragments multimères exprimée et purifiée à partir de E. coli pourrait être un élément déterminant de la protéine de conformation d&#39;une des maladies liées à DISC1, DISC1opathies 15. Inconvénients et remèdes: Faible rendement aggresome après purification sur gradient de saccharose: Le gradient de saccharose introduit dans ce protocole fonctionne bien avec eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes. Aggresomes comprenant d&#39;autres protéines peuvent être de dimensions variables par conséquent, les concentrations en saccharose doit être optimisée par d&#39;autres utilisateurs. Purification insuffisante de protéines recombinantes: Des contaminants bactériens dans le procédé de purification de la protéine recombinante est également marqué dans les étapes ultérieures du protocole. Pour éviter les contaminations, exécutez la protéine sur une SDS-PAGE et confirmer que la protéine recombinante est d&#39;au moins 95% de pureté par coloration de Coomassie-Bleu. Pour assurer la meilleure qualité et le rendement, le protocole doit être optimisée pour chaque protéine individuelle. Faible étiquetage efcacité de protéines recombinantes: Des contaminations qui contiennent les groupes SH libres diminue marquage efficace de la protéine. Par conséquent, une dialyse extensive et Ni-NTA de purification à base est obligatoire.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> Milieu est fonction de la lignée cellulaire hôte. La ligne du destinataire optimale cellule doit être déterminée par l&#39;utilisateur. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> Milieu est fonction de la ligne de cellule receveuse. La ligne du destinataire optimale cellule doit être déterminée par l&#39;utilisateur. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> D&#39;autres réactifs de transfection pourrait fonctionner aussi bien mais n&#39;ont pas été testés avec notre protocole. </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30210 &lt;/ Td&gt; <td> Les expériences ont été faites avec Ni_NTA agarose de Qiagen, d&#39;autres fournisseurs devrait fonctionner aussi bien. </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> Il n&#39;est pas nécessaire de DNase RNase dans le processus de purification aggresomes. </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> Milieu sans sérum fonctionne aussi bien </td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> Supplément pour SH-SY5Y et moyennes NLF </td></tr><tr><td> Non essentielle-amino-acides (NEAA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> Supplément pour SH-SY5Y moyen </td></tr><tr><td> Bleu trypan 0,4% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td> Réactif toxique </td></tr><tr><td> DyLight 594 Maleimide </td><td> Thermo Fisher Scientific- </td><td> 46608 </td><td> Réduction de colorant réactif cystéine pour former des liaisons thioéther stables. Egalement disponible dans d&#39;autres couleurs. </td></tr><tr><td> ProLong or avec DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> Ce milieu de montage liquide antifade a donné des résultats supérieurs à nos mains. </td></tr><tr><td> Cocktail inhibiteur de la protéase </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Dissoudre 1 table dans 500 pl H 2 O pour solution 100X. </td></tr><tr><td> Synthétique a-synucléine </td><td> Sigma </td><td> S7820 </td><td> Replier comme décrit dans le texte. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Table de réactifs spécifiques. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin Technologies </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> Nous n&#39;avons pas testé les autres homo mécaniquenizers autres que cela. Autre méthode d&#39;homogénéisation sans détergent pourrait fonctionner aussi bien, mais n&#39;ont pas été testés pour ce protocole. </td></tr><tr><td> 5301 Concentrateur (speedvac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> Uniquement nécessaire si la protéine doit être concentré. </td></tr><tr><td> LSM 510 et AxioVision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> Consultez le catalogue des fabricants </td><td> Les deux microscopes abriter la possibilité d&#39;effectuer Z-stack imagerie. Il s&#39;agit d&#39;une condition préalable pour l&#39;évaluation solide et sérieuse des événements d&#39;invasion. </td></tr><tr><td> Matière plastique de culture cellulaire </td><td> Nunc </td><td> Boîtes de 10 cm # 172958, plaques à 24 puits # 142475 </td><td> L&#39;utilisation d&#39;une matière plastique différente pourrait influencer l&#39;interaction de protéines recombinantes ou aggresomes et les surfaces en plastique. Nous n&#39;avons pas testé d&#39;autres matériaux que ceux décrits ici. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Table des matières spécifiques et des équipements. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Nom du tampon </td><td> teneur </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Milieu de croissance bactérienne </td><td> 16 g / l de Bacto Tryptone, 10 g / l d&#39;extrait de levure Bacto, 5 g / l de NaCl, 5 mM-arginine-HCl, 5 mM MgSO4, 100 pg / ml carbénicilline, 35 pg / ml de chloramphénicol </td><td> Cultiver des bactéries à DO 600: 0.6-0.8 induire l&#39;expression avec 1 mM d&#39;IPTG. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Tampon de resuspension bactérienne </td><td> 50 mM Tris-HCl pH 8,0, EDTA 5 mM, 2 mM de PMSF, 1% de TX-100, 250 pg / ml de lysozyme, 20 mM de MgCl2 et 400 U/50 ml de DNase I </td><td> Resupend culot bactérien de 1 L overnight culture dans 50 ml de tampon de remise en suspension. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Tampon d&#39;extraction des protéines </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM d&#39;imidazole, 500 mM de NaCl, 8 M d&#39;urée et 10 mM b-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> Ni-NTA colonne de tampon de lavage </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM d&#39;imidazole, 500 mM de NaCl, 8 M d&#39;urée et 10 mM b-ME, 12 mM imidazole </td><td> Tampon d&#39;extraction de modification avec 12 mM d&#39;imidazole ajouté. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Ni-NTA tampon d&#39;élution colonne </td><td> Tris 50 mM, NaCl 500 mM, 300 mM imidazole, urée 8 M, PMSF 1 mM, EDTA 5 mM et 10 mM de b-ME </td><td> Le tampon d&#39;élution contient 10 mM b-ME, qui est dialysée par la suite. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8 g / l de NaCl, 0,2 g / l de KCl, 1,44 g / l de Na 2 HPO 4, 0,24 g / l de KH 2 PO 4, ajuster le pH à 7,4 </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> Étiquetage tampon </td><td> PBS contenant 5 mM PTCE </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Table des recettes. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species

L&#39;agrégation des protéines est considérée comme une caractéristique générale des affections chroniques dégénératives du cerveau comme, par exemple, dans les maladies neurodégénératives maladie d&#39;Alzheimer (Aß, tau), la maladie de Parkinson (α-synucléine), la maladie de Huntington (polyglutamine, la huntingtine), et d&#39;autres. L&#39;agrégation des protéines est supposée se produire en raison de protéostasie perturbé, c&#39;est à dire le déséquilibre entre l&#39;apparition et la dégradation des protéines mal repliées. Fait à noter, ces mêmes protéines agrégées trouvé dans les formes sporadiques de ces maladies qui sont mutant dans des variantes rares formes familiales. La schizophrénie est une maladie cérébrale chronique progressive qui dans de nombreux cas va de pair avec un déficit cognitif permanent et irréversible. Dans une approche gène candidat, nous avons examiné si Disrupted en schizophrénie 1 (DISC1), un gène cloné dans une famille écossaise avec une liaison à une maladie mentale chronique 1, 2, n&#39;a pu être trouvée sous forme d&#39;agrégats insolubles dans le brain des cas sporadiques de schizophrénie 3. Utilisation du CC SMRI, nous avons identifié chez environ 20% des cas avec CMD mais pas des contrôles normaux ou des patients atteints de maladies neurodégénératives immunoréactivité DISC1 sarkosyl insoluble dans l&#39;après fractionnement biochimique. Des études ultérieures ont révélé in vitro que la propension agrégation des DISC1 a été influencé par la maladie associée au polymorphisme S704C 4, et que DISC1 aggresomes générées in vitro étaient cellulaire invasive 5, similaire à ce qui avait été montré pour Aß 6, tau 7-9, α -synucléine 10, polyglutamine 11 ou SOD1 agrégats 12. Ces résultats nous ont incités à proposer au moins un sous-ensemble des cas de CMD, ceux qui DISC1 agrégée peut-être des troubles de protéines de conformation. Ici, nous décrivons comment nous générons DISC1 aggresomes dans les cellules de mammifères, les purifier sur un gradient de saccharose et de les utiliser pour la cellule-invasif studies. De même, nous décrivons comment nous générons une exclusivité multimérique C-terminale DISC1 fragment, l&#39;étiquette et le purifier pour les études invasif des cellules. Utilisation des multimères recombinés de DISC1 nous atteignons invasion cellulaire similaire à celle d&#39;une dénomination semblable synthétique α-synucléine fragment. Nous montrons également que ce fragment est repris in vivo lorsque stéréotaxique injecté dans le cerveau des animaux receveurs.

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Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

L&#39;invasion de la génération, de la purification et de la cellule de cytoplasmiques intracellulaires, aggresomes protéine pleine longueur DISC1 de cultures de cellules et d&#39;une étiquette, multimérique recombinante DISC1 fragment de protéine dans<em&gt; E. coli</em&gt; Sont décrits. Invasivité de cellules est indiquée pour les cellules réceptrices en culture cellulaire et pour les neurones<em&gt; In vivo</em&gt; Après l&#39;inoculation stéréotaxique du cerveau.

Production, de conditionnement, et la caractérisation des cellules invasives Espèces protéine DISC1

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

generation-purification-characterization-cell-invasive-disc1-protein

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13.6K vues.  Medical School Düsseldorf, Germany. L'invasion de la génération, de la purification et de la cellule de cytoplasmiques intracellulaires, aggresomes protéine pleine longueur DISC1 de cultures de cellules et d'une étiquette, multimérique recombinante DISC1 fragment de protéine dans E. coli Sont décrits. Invasivité de cellules est indiquée pour les cellules réceptrices en culture cellulaire et pour les neurones In vivo Après l'inoculation stéréotaxique du ...

Vidéo: Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Recherche

Biologie

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification de la M. magneticum Strain AMB-1 Protein magnétosome Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Une technique non invasive cheveux d&#39;échantillonnage pour obtenir l&#39;ADN de haute qualité provenant Elusive petits mammifères

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Purification de Hsp104, une protéine Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identification des partenaires protéine interagissant Utilisation Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identification et caractérisation des glycosylation des protéines spécifiques en utilisant des endo-et exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Détection, visualisation et la quantification de la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène dans un système modèle Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identifier les interactions protéine-protéine dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Têtes de Tandem Affinity Purification adultes (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...