Questo lavoro è stato finanziato da NEURON-ERANET scoprire (BMBF 01EW1003) per CK e JPH, DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) per CKVB è supportata da una concessione del Forschungskommission della Facoltà di Medicina dell&#39;Università di Düsseldorf.

1. Preparazione di cellule del donatore aggresome: trasfezione di monomerico proteina fluorescente rossa (MRFP) o Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP)-tagged Figura umana intera (FL) DISC1 <ol><li> Seed 1,5 x 10 6/10 cm parabola umana neuroblastoma NLF (FLN; Children Hospital di Philadelphia, Philadelphia, PA), le cellule in dieci 10 piatti cm e crescere durante la notte. NLF cellule vengono coltivate in mezzo RPMI-1640 integrato con 10% FBS, penicillina / Strepomycin, L-glutammina. Il giorno successivo, le cellule devono essere al 70-80% di confluenza. </li><li> Transitoriamente transfettare ogni piatto 10 cm con 15 pg di DNA plasmidico e reagenti di trasfezione Metafectene (Biontex, Martinsried, Germania). In breve, per un piatto 10 cm, 15 pg di DNA plasmidico e 30 Metafectene microlitri sono stati aggiunti a 750 pl Opti-MEM, miscelate e incubate a temperatura ambiente per 20 min. 5 piatti sono state trasfettate con pcDNA3.1 MRFP / eGFP-tagged umane (FL) DISC1 e 5 piatti con il eGFP-plasmide solo. </li></ol> 2. AggresomePurificazione di cellule del donatore trasfettate Il protocollo qui descritto è una combinazione di un metodo per purificare Lewy-Body da tessuto cerebrale 13 e un protocollo per isolare grandi aggregati e aggresomes 14. Poiché i metodi già esistenti sono basati sull&#39;uso di detergenti, l&#39;isolamento di detersivo privo di proteine ​​per l&#39;applicazione in cella-invasività saggi è critica. <ol><li> 48 ore dopo la trasfezione, monitorare l&#39;espressione di eGFP e mRFP/eGFP-DISC1 e confermare la formazione del aggresomes sotto un microscopio a fluorescenza (Figura 1). </li><li> Lavare le cellule con PBS pH 7.4, raschiare con 400 microlitri di PBS ciascuna, aggiungere 1X cocktail di inibitori delle proteasi (Roche, Indianapolis, IN) e distruggere le cellule utilizzando un omogeneizzatore Precellys24 (tecnologie di Bertin, Francia). In breve, aggiungere 1 ml di sospensione cellulare in una provetta di lisi 2 ml e aggiungere 10 perle di ceramica. Lisare le cellule con 3 x 60 impulsi al secondo. La forza meccanica del processo puòaumentare la temperatura all&#39;interno del campione superiore a 37 ° C quindi occorre prestare attenzione per raffreddare il campione nel ghiaccio dopo la procedura di lisi. </li><li> Raffreddare le celle su ghiaccio e aggiungere 10 mM MgCl 2, 40 U / ml DNasi A e incubare per 60 min a 37 ° C </li><li> Preparare soluzioni di 80%, 50%, 20% saccarosio (w / v) in PBS pH 7,4 (10 ml ciascuna). </li><li> Preparare il gradiente di saccarosio in una provetta da 15 ml falcon, partendo con 2 ml di saccarosio 80%, seguito da 50% e 20%. Versare il gradiente lentamente e fare attenzione a non disturbare i livelli già versato. Strato il lisato digerito sopra il gradiente e centrifugare per 15 min a 1000 xga 4 ° C. </li><li> Raccogliere accuratamente l&#39;interfase tra lo strato di saccarosio del 50-80% con una pipetta e mescolare con 5 volumi di PBS pH 7,4. Centrifugare per 15 min a 1000 xga 4 ° C. Ripetere il lavaggio altre due volte. In questa interfase, aggresomes sono fluorescenti e possono essere visualizzati in un microscopio a luce UV. </li><li> Eliminare il supernatante erisospendere il pellet in 250-500 microlitri di PBS pH 7.4. Questo pellet contiene il aggresomes purificata (Figura 2). </li></ol> 3. Trattamento dei destinatari cellule SH-SY5Y con mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes <ol><li> Sementi 5 x 10 4 destinatario SH-SY5Y neuroblastoma umano esprimono costitutivamente GFP-DISC1 (598-854) su vetrini sterili in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. SH-SY5Y cellule sono coltivate in DMEM/F-12 terreno supplementato con penicillina / streptomicina, aminoacidi non essenziali (NEAA) e 10% di FBS. </li><li> 24 ore più tardi, aggiungere 10 microlitri in ciascun pozzetto e incubare per 48-72 ore. </li><li> Lavare le cellule 3 x con PBS pH 7.4 e spegnere fluorescenza extracellulare con 0,04% Trypan Blue per 5 min. </li><li> Fissare le cellule con 4% PFA in PBS pH 7.4 per 10 min in ghiaccio, lavare una volta con sterile H 2 O e montare i coprioggetti su vetrini con prolungare oro con DAPI montaggio medio (Invitrogen, USA). </li><li> Confermare l&#39;assorbimento /invasione di esogenamente aggresomes applicati dalla colocalizzazione con proteine ​​assunti espresse da cellule riceventi in Z-stack immagini. </li></ol> Eppure, assorbimento / invasione proteina esogena non potrebbe essere rilevata sostanzialmente in parallelo con l&#39;assunzione di proteine ​​della cellula ospite. Nel nostro esempio MRFP-tagged DISC1 aggresomes recluta solubile GFP-tagged DISC1 (598-854) proteina espressa dalla cellula ospite (vedi Figura 3). Foto sono state scattate in un confocale Zeiss LSM 510 o di un microscopio Zeiss AxioVision Apotome2. 4. Generazione di DISC1 ricombinante (598-785) In una pubblicazione precedente abbiamo analizzato la capacità di vari DISC1 frammenti proteici di auto-interazione basata sulla presenza di auto-associazione domini. Tra tutte le proteine ​​frammenta testato DISC1 umano (598-785) visualizzata la forte propensione multimerizzazione 4 (Figura 4). Pertanto, DISC1 umano (598-785) è stato clonato in pET15b (nvagen, Madison, Wisconsin) contenente un 6-istidina N-terminale, espressa in E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, USA), e purificato in condizioni denaturanti a 8 mol / l urea come descritto 4. In breve, il protocollo è descritto di seguito. <ol><li> BL21-(IDE3) Rosetta E. coli sono state coltivate in 2 x 500 ml 2YT contenente 5 mM-arginina-HCl, 5 mM MgSO4, 100 pg / ml carbencillin, 35 mg / ml di cloramfenicolo fino ad una OD 600: 0,6-0,8 e DISC1 (598-785) è stata indotta l&#39;espressione con 1 mM IPTG. </li><li> DISC1 (598-785) è stata espressa per 4 ore a 37 ° C, l&#39;espressione è stata terminata per raccogliere i batteri mediante centrifugazione. </li><li> Il pellet batterico è stato risospeso in 50 ml di tampone TE (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) più 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml lisozima, 20 mM MgCl 2 e 400 ml U/50 DNasi I. Per garantire la completa lisi, la reazione è stata incubata per 30 min a temperatura ambiente con delicata agitazione. </li><li> Aggiungere 10 mM β-mercaptoethanol (ME) e 500 mM NaCl e incubare per altri 30 min. </li><li> Spin down corpi di inclusione batterici a 20,000 g per 30 min a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet in 50 ml di tampone di estrazione contenente 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM di imidazolo, 500 mM NaCl, urea 8 M e 10 mM β-ME e rimuovere detriti mediante centrifugazione a 20,000 g per 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavare il Ni-NTA agarosio matrice con tampone di estrazione. Incubare la risospeso, estratto precleared proteina con Ni-NTA matrice per 2 ore a RT. </li><li> Lavare il Ni-NTA matrice con tampone di estrazione contenente 12 mM imidazolo. </li><li> Eluire la proteina lentamente con 15 ml di tampone di eluizione contenente 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazolo, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA e 10 mM β-ME. </li><li> Dializza la proteina graduale di PBS pH 7,4 contenente 10 mM β-ME. </li></ol> Dal 1 ° L cultura batterica di partenza, è possibile isolare fino a 50 mg di ricombinante DISC1 (598-785) protein. α-sinucleina ripiegamento Per esperimenti con α-sinucleina, 500 microgrammi della proteina ricombinante (Sigma-Aldrich, USA) è stato sciolto in PBS ad una concentrazione di 1 mg / ml. Per ottenere oligomeri, ripiegatura è stata eseguita la notte a 37 ° C, come descritto in una pubblicazione precedente 10. 5. Etichettatura di DISC1 ricombinante (598-785) con DyLight594 <ol><li> Prima del processo di etichettatura successivo, DISC1 (598-785) proteina ha la essere liberato dalla β-ME. Pertanto, la proteina viene dializzato 3 volte al PBS pH 7,4 ad una diluizione di 1:2000. </li><li> Etichetta 1 mg DISC1 (598-785) con DyLight 594 maleimide (Thermo Scientific, USA) secondo le istruzioni del produttore. In breve, sciogliere 1 mg / ml di proteina in PBS pH 7,4 e si aggiungono 5 TCEP mM di recuperare liberi gruppi tiolici. Aggiungere 20 ml di DMF colorante disciolto nella reazione e incubare per 2 ore a RT. </li><li> 3 x dializza la proteina di PBS pH7,4 con un rapporto di 1:2000 per 2 h ciascuna. </li></ol> Per aumentare ulteriormente la purezza della proteina etichettata una sua 6-etichettato affinità basata-purificazione su una colonna di Ni-NTA viene eseguita. <ol start="4"><li> Lavare 1 ml Ni-NTA matrice (Qiagen, Germania) con 10 ml di PBS pH 7,4. </li><li> Applicare l&#39;etichetta, proteine ​​dializzato alla colonna e farlo funzionare sulla colonna lentamente. </li><li> Lavare la proteina con 3 x 20 ml di PBS pH 7,4 </li><li> Eluire la proteina con PBS pH 7,4, 500 mM imidazolo gocce monitorando la banda colorata sulla colonna Ni-NTA per ridurre il volume eluato. </li><li> Dializza l&#39;eluato a 3 x 10 mM pH 7,4 napi ad una diluizione di 1:2000 per 2 h ciascuna. </li><li> Utilizzare una siringa sterile 0,45 micron filtro per filtrare l&#39;eluato, aliquota in 5 x 100 campioni ul e congelare in azoto liquido a scatto. La quantità totale di proteine ​​dovrebbe essere di 0,5-1 mg / ml in ciascuna aliquota 100 ul. </li></ol> opzionale Concentrazionezione passo <ol start="10"><li> Per iniezioni stereotactical ratto, la proteina è stata concentrata 10 volte in una velocità-vac (Concentratore Eppendorf 5301). La condizione di buffer finale era di 100 Napi mM. </li></ol> α-sinucleina Etichettatura L&#39;etichettatura e purificazione (Ni-NTA colonna) ricombinante della α-sinucleina è stata eseguita in parallelo DISC1 (598-785). Il materiale di partenza è stato totale 500 mg invece di 1 mg per DISC1 (598-785). 6. Trattamento dei destinatari cellule SH-SY5Y con etichetta ricombinante DISC1 (598-785) Proteine <ol><li> Seme 5x10 4 destinatario SH-SY5Y neuroblastoma umano costitutivamente esprimono GFP-DISC1 (598-854) su vetrini sterili in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. </li><li> Aggiungi proteina marcata al mezzo di coltura cellulare ad una concentrazione di 5-10 mg / ml ed incubare per 48-72 hr. </li><li> Lavare le cellule 3 x con PBS pH 7.4 e dissetare estrazionefluorescenza ellular con il 0,04% Trypan Blue per 5 min. </li><li> Fissare le cellule con 4% PFA in PBS pH 7.4 per 10 min in ghiaccio, lavare una volta con sterile H 2 O e montare i coprioggetti su vetrini con prolungare oro con DAPI montaggio medio (Invitrogen, USA). </li><li> Confermare l&#39;assorbimento / invasione di proteina ricombinante esogena applicata da colocalizzazione con proteine ​​assunti espresse da cellule riceventi in Z-stack immagini generate da scansione laser microscopia confocale. Eppure, assunzione di proteina endogena potrebbe non essere rilevata sostanzialmente in parallelo con invasione di proteine ​​della cellula ospite, Z-stack immagini possono ancora confermare la natura invasiva della proteina. </li></ol> Nel nostro esempio, rec. DISC1 (598-785) * almeno in parte solubile reclute GFP-tagged DISC1 (598-854) proteina espressa dalla cellula ospite (vedi Figura 5A). Per ricombinante α-sinucleina invasione, ma non il reclutamento viene mostrato (Figura 5B). Le foto sono state presesu un confocale Zeiss LSM-510 o un microscopio Zeiss AxioVision Apotome2. L&#39;iniezione del concentrato (ca. 4 pl di 2,5 mg / mL), etichettati DISC1 (598-785) * nei risultati mPFC nella diffusione della proteina intorno al sito di iniezione, che può essere rilevato anche dopo perfusione dell&#39;animale con 4% PFA in PBS pH 7,4 con una filterset rodamina. Nel nostro esempio DISC1 (598-785) è occupata da una serie distinte di neuroni e può essere monitorato con Z-stack di immagini (Figura 6). In generale, l&#39;iniezione di altre proteine ​​poi quelle qui utilizzato non comportano necessariamente invasione cellulare. L&#39;evento invasione dipende essenzialmente dalla natura della proteina, tuttavia una purificazione pulita è un prerequisito per ulteriori analisi. 7. Risultati rappresentativi Aggresomes costituiti ricombinante DISC1-eGFP FL purificato da cellule NLF invaso destinatario SH-SY5Y ceLLS a bassa efficienza (circa 0.3% 5), come visto da colocalizzazione con microscopia confocale (Figura 3). Come precedentemente segnalato, DISC1 (598-785) espressa e purificata da E. coli formano multimeri 4 erano ugualmente cellula-invasiva ad un&#39;efficienza di circa il 20% 5 (figura 5A), simile a quella di α-sinucleina che è stato utilizzato in parallelo come controllo positivo (Figura 5B). Labeled DISC1 ricombinante (598-785) espressa e purificata da E. coli è stato anche cellule invasive ai neuroni in vivo quando la proteina è stata multimerico stereotassica iniettato nella corteccia prefrontale mediale di un topo (figura 6; Pum, Bader, Huston, Korth, non pubblicato). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Cellule di neuroblastoma NLF transitoriamente esprimere FP-DISC1 (rosso). Red aggresomes fluorescenti possono essere deteCTED all&#39;interno delle cellule. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Purificata MRFP-tagged DISC1 aggresomes dopo la purificazione in un gradiente di saccarosio. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Immagine fluorescente di aggresomes invaso. MRFP-tagged flDISC1 aggresomes sono stati purificati e incubate con cellule SH-SY5Y neuroblastoma overexpressing solubile GFP-tagged DISC1 (598-854). La presa di una aggresomes etichettati è monitorata da Z-stack immagini su un Laser-Scan microscopio (Zeiss LSM 510). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. SEC-profilo di rec. DISC1 (598-785) contenente la S704 e C704 polimorfismi a singolo nucleotide (SNP). Entrambe le varianti mostrano una perturbazione di oligomerizzazione ordinata e la formazione di alto peso molecolare multemporizzatori (freccia rossa). Questa immagine è modificata rispetto alla pubblicazione di Leliveld et al., Biochimica 2009. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Fluorescente Z-pila di foto di invasivo DyLight marcato DISC1 ricombinante (598-785). SH-SY5Y neuroblastoma esprimenti GFP-solubile DISC1 (598-854) sono state incubate con etichettati, proteina ricombinante ad una concentrazione di 5 mg / ml. (A) aggregati rossa mostra l&#39;invasione di rec. DISC1 (598-785), proteine ​​e punti gialli indicano una assunzione di solubile GFP-DISC1 (598-854) in aggregati. (B) ricombinante α-sinucleina (rosso) invade le cellule senza assunzione con una frequenza di circa il 20%. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Immagine di immunofluorescenzal&#39;etichetta iniettato, DISC1 ricombinante (598-785) della proteina. Z-stack immagini conferma la presenza di rec. DISC1 (598-785) proteina in neuroni corticali di ratto colorate con un anticorpo contro nuclei neuronali (NeuN, verde).

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo studio si descrive la purificazione di mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes da una linea cellulare di neuroblastoma trasfettate, la preparazione e l&#39;etichettatura di una specie di proteine ​​ricombinanti DISC1 e la loro applicazione in cella-invasione delle cellule riceventi esperimenti in vitro e in vivo. La purificazione di nativi mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes stato sviluppato da protocolli per isolare Lewy corpo come le strutture e grandi aggregati 13, 14, ma modificato per evitare l&#39;uso di detergenti e per minimizzare il rischio di falsi positivi invasione cellulare che potrebbe verificarsi a causa di detergenti facilitato la penetrazione della membrana. Un miglioramento futuro possibile potrebbe essere la per aumentare ulteriormente la purezza delle aggresomes per sonicazione per membrane completamente separati rimanenti citoscheletro e dalle aggresomes. Aumentando purezza globale, il numero di eventi di invasione totali registrati per grandi aggresomes mAy essere aumentata 5. Se la definizione limitata della nostra suggerito 3-fase saccarosio è sufficiente per aggresomes di specie altra proteina deve essere testato, in questo senso il protocollo descritto qui dovrebbe essere considerato come un punto di partenza per l&#39;ottimizzazione individuale. Le aggresomes purificati dimostrato di essere molto robusta nelle nostre mani, fasi di lavaggio supplementari (senza detergente) per eliminare le tracce di saccarosio non ridurre in modo significativo il rendimento complessivo. In una pubblicazione precedente abbiamo descritto che l&#39;assemblaggio di oligomero DISC1 dipende multimerizzazione domini distinti del C-terminale 4 (Figura 4). Abbiamo scelto questo frammento solubile di espressione ricombinante in E. coli e successive e Ni-NTA depurazione. Per monitorare la sua multimerizzazione e di confrontare la sua invasività cellulare con un cellulare descritto invasiva proteine ​​come α-sinucleina, abbiamo etichettato DISC1 (598-785) con il colorante fluorescente DyLight594, e rispetto la suacell-invasività con quella altrettanto marcato α-sinucleina. La cella invasività della ricombinante DISC1 frammento è stato notevolmente aumentata rispetto a quella dei nativi, lunghezza DISC1 aggresomes, probabilmente a causa della sua piccola dimensione e purezza molto superiore. Anche in questo caso, la purezza sembra giocare un ruolo decisivo nella cella-invasività. Nel nostro esempio i aggresomes invasive reclutati proteina solubile omologo della linea cellulare ricombinante bersaglio che è stato espresso in una solubile, cioè cellule disperse forma. L&#39;espressione di una proteina fluorescente (GFP o RFP ad esempio) nella linea cellulare del destinatario è un vantaggio in quanto permette la colocalizzazione di aggresomes invasive e proteine ​​ricombinanti nel termine cellula ricevente tramite Z-stack imaging. Cellule invasive aggresomes DISC1 e frammenti multimerici espressa e purificata da E. coli potrebbe essere una caratteristica che definisce una malattia conformazionali proteiche relative alla DISC1, DISC1opathies 15. Risoluzione dei problemi: Bassa resa aggresome dopo purificazione gradiente di saccarosio: Il gradiente di saccarosio introdotto in questo protocollo funziona bene con eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes. Aggresomes costituiti da altre proteine ​​possono essere di dimensioni variabili, pertanto le concentrazioni di saccarosio deve essere ottimizzata da altri utenti. Insufficiente purificazione di proteine ​​ricombinanti: Eventuali contaminanti batterici nel processo di purificazione della proteina ricombinante sarà anche essere etichettati in fasi successive del protocollo. Per evitare contaminazioni, eseguire la proteina su una SDS-PAGE e confermare che la proteina ricombinante è almeno del 95% mediante colorazione con Coomassie-blu. Per garantire la massima qualità e resa, il protocollo deve essere ottimizzata per ciascuna singola proteina. Basso etichettatura efcienza di proteine ​​ricombinanti: Eventuali contaminazioni che contengono gruppi sulfidrilici liberi diminuirà etichettatura efficiente della proteina. Pertanto, dialisi estensiva e Ni-NTA purificazione basato è obbligatoria.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> Media dipende dalla linea cellulare ospite. La linea cellulare ricevente ottimale deve essere determinato dall&#39;utente. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> Media dipende dalla linea cellulare ricevente. La linea cellulare ricevente ottimale deve essere determinato dall&#39;utente. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> Reagenti di trasfezione altri potrebbero funzionare bene, ma non sono stati testati con il nostro protocollo. </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarosio </td><td> Qiagen </td><td> 30210 &lt;/ Td&gt; <td> Gli esperimenti sono stati fatti con Ni_NTA agarosio da Qiagen, altri fornitori dovrebbero funzionare bene. </td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> Non vi è alcuna necessità di DNasi RNasi libero nel processo di purificazione aggresomes. </td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> Terreno privo di siero funziona così </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> Supplemento per SH-SY5Y e NLF medie </td></tr><tr><td> Non-essenziale-aminoacidi (NEAA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> Supplemento per SH-SY5Y medio </td></tr><tr><td> Trypan Blue 0,4% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td> Reagente tossico </td></tr><tr><td> DyLight 594 Maleimide </td><td> Thermo Fisher Scientific- </td><td> 46608 </td><td> Ridotto colorante reattivo cisteina per formare legami stabili tioetere. Disponibile anche in altri colori. </td></tr><tr><td> Prolungare oro con DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> Questo mezzo di montaggio liquido antifade ha dato risultati superiori nelle nostre mani. </td></tr><tr><td> Inibitore della proteasi cocktail </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Sciogliere 1 tavolo in 500 microlitri H 2 O per soluzione 100X. </td></tr><tr><td> Sintetico a-sinucleina </td><td> Sigma </td><td> S7820 </td><td> Ripiega come descritto nel testo. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella di reagenti specifici. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin Technologies </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> Non abbiamo testato altri omogenea meccanicanizers diversi da questo. Altro metodo di omogeneizzazione detersivi potrebbe funzionare altrettanto bene, ma non sono stati testati per questo protocollo. </td></tr><tr><td> 5301 Concentrator (SpeedVac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> Necessaria solo se proteina deve essere concentrato. </td></tr><tr><td> LSM 510 e AxioVision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> Vedi catalogo produttori </td><td> Entrambi i microscopi porto la capacità di eseguire Z-stack immagini. Questo è un prerequisito per la valutazione solida e seria di eventi invasione. </td></tr><tr><td> Coltura cellulare materiale plastico </td><td> Nunc </td><td> 10 piatti cm # 172958, piastre da 24 pozzetti # 142475 </td><td> L&#39;uso di diverse materie plastiche possa influenzare l&#39;interazione di proteine ​​ricombinanti o aggresomes e le superfici di plastica. Non abbiamo testato materiali diversi da quelli qui descritti. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella di materiale e attrezzature specifiche. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Numero </td><td> Buffer nome </td><td> contenuto </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Crescita media batterica </td><td> 16 g / l Bacto Tryptone, 10 g / l Bacto estratto di lievito, 5 g / l NaCl, 5 mM-arginina-HCl, 5 mM MgSO4, 100 pg / ml carbencillin, 35 mg / ml di cloramfenicolo </td><td> Crescere batteri di OD 600: 0,6-0,8 indurre l&#39;espressione con 1 mM IPTG. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Risospensione tampone batterica </td><td> 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 mM di PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml lisozima, 20 mM MgCl 2 e 400 U/50 ml DNasi I </td><td> Resupend pellet batterico da 1 L ovecultura rnight in 50 ml di tampone di risospensione. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Proteine ​​estrazione del buffer </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM di imidazolo, 500 mM NaCl, urea 8 M e 10 mM b-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> Ni-NTA colonna di tampone di lavaggio </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM di imidazolo, 500 mM NaCl, urea 8 M e 10 mM b-ME, 12 mM imidazolo </td><td> Tampone di estrazione modificato con 12 mM imidazolo aggiunto. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Ni-NTA colonna di tampone di eluizione </td><td> 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazolo, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA e 10 mM b-ME </td><td> Il tampone di eluizione contiene 10 mm B-ME, che è dializzato in seguito. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8 g / l NaCl, 0,2 g / l KCl, 1,44 g / l Na 2 HPO 4, 0,24 g / l KH 2 PO 4, regolare a pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> Etichettatura del buffer </td><td> PBS contenente 5 mM TCEP </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tabella ricette. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species

Aggregazione proteica è visto come una caratteristica generale croniche, condizioni degenerative del cervello, come, per esempio, nelle malattie neurodegenerative malattia di Alzheimer (Ap, tau), morbo di Parkinson (α-sinucleina), malattia di Huntington (polyglutamine, huntingtina), e altri. L&#39;aggregazione delle proteine ​​è pensato per verificarsi a causa di proteostasis disturbato, cioè lo squilibrio tra il sorgere e degradazione delle proteine ​​mal ripiegate. Da notare che le stesse proteine ​​si trovano aggregati in forme sporadiche di queste malattie che sono mutante in rare varianti di forme familiari. La schizofrenia è una malattia cronica progressiva del cervello che in molti casi va di pari passo con un deficit cognitivo permanente e irreversibile. In un approccio del gene candidato, abbiamo studiato se turbativa-in-1 schizofrenia (DISC1), un gene clonato in una famiglia scozzese con concatenamento a cronica malattia mentale 1, 2, potrebbe essere trovato come aggregati insolubili in brain di casi sporadici di schizofrenia 3. Utilizzando il CC SMRI, abbiamo identificato in circa il 20% dei casi con CMD, ma non controlli normali o in pazienti con malattie neurodegenerative sarcosile insolubile immunoreattività DISC1 dopo frazionamento biochimica. Successivi studi in vitro hanno rivelato che la propensione aggregazione di DISC1 stata influenzata dalla malattia associata polimorfismo S704C 4, e che DISC1 aggresomes generati in vitro cellule erano invasivo 5, simile a quello che era stato mostrato per Ap 6, tau 7-9, α -sinucleina 10, polyglutamine 11, o SOD1 aggregati 12. Questi risultati ci hanno spinto a proporre che almeno un sottoinsieme di casi con CMD, quelli con DISC1 aggregato potrebbe essere disordini conformazionali proteiche. Qui si descrive il modo in cui generare DISC1 aggresomes in cellule di mammifero, purificarle su un gradiente di saccarosio e li usa per cellula-invasività studies. Allo stesso modo, si descrive il modo in cui generare un esclusivo multimerico C-terminale DISC1 frammento, etichetta e purificarlo per gli studi di invasività delle cellule. Utilizzando i multimeri ricombinanti di DISC1 otteniamo l&#39;invasività delle cellule simili come per una simile etichetta sintetico α-sinucleina frammento. Abbiamo anche dimostrato che questo frammento è ripreso in vivo quando stereotassica iniettato nel cervello di animali recipienti.

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Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Invasione La generazione, la purificazione e la cellula del intracellulari, aggresomes citoplasmatici pieno di proteine ​​DISC1 lunghezza da colture cellulari e di una etichetta, multimerico DISC1 frammento di proteina ricombinante in<em&gt; E. coli</em&gt; Sono descritti. Invasività cella è indicato per cellule riceventi in coltura cellulare e per i neuroni<em&gt; In vivo</em&gt; Dopo l&#39;inoculazione del cervello stereotactical.

Generazione, purificazione e caratterizzazione di specie DISC1 Cell-invasive Protein

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

generation-purification-characterization-cell-invasive-disc1-protein

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Views.  Medical School Düsseldorf, Germany. Invasione La generazione, la purificazione e la cellula del intracellulari, aggresomes citoplasmatici pieno di proteine ​​DISC1 lunghezza da colture cellulari e di una etichetta, multimerico DISC1 frammento di proteina ricombinante in E. coli Sono descritti. Invasività cella è indicato per cellule riceventi in coltura cellulare e per i neuroni In vivo Dopo l'inoculazione del cervello stereotactical.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Ricerca

Biologia

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purificazione della M. magneticum Strain AMB-1 proteina Magnetosome Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Una tecnica non invasiva di campionamento dei capelli per ottenere DNA di alta qualità da Elusive piccoli mammiferi

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Purificazione di Hsp104, una proteina Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Individuazione di partner proteine ​​interagenti mediante Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identificazione e caratterizzazione di glicosilazione delle proteine ​​con specifiche endo-e exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Espressione e purificazione della proteina transmembrana cistica regolatore fibrosi conduttanza in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Individuare, visualizzare e quantificare la generazione di specie reattive dell&#39;ossigeno in un modello di sistema di Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identificare proteina-proteina interazione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult capi di Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...