Este trabajo fue apoyado por becas de los NIH a FZ (R01NS064288) y la Fundación Craig H. Neilsen.

1. Preparación de cubreobjetos, medio de cultivo, y las enzimas de digestión <ol><li> La ronda 12-mm # 1 cubreobjetos de vidrio se utilizan para el cultivo neuronal. Los cubreobjetos se limpian con HCl al 10% durante la noche seguido por lavado ultrasónico con agua destilada y desionizada durante 3 veces (20 minutos / hora). Los cubreobjetos limpios se almacena en 70% de etanol para uso futuro. Antes de cada experimentos, los cubreobjetos se secan al aire y se coloca en la placa de cultivo. </li><li> Para recubrir los cubreobjetos secos, 100 l de solución de revestimiento que contiene 100 mg / ml de poli-D-lisina y 10 ug / ml de solución de trabajo laminina se añade en cada cubreobjetos y la placa de cultivo se transfiere a una incubadora a 37 ° C. Después de 1-2 horas, la solución de revestimiento se retira y los cubreobjetos se lavaron 3 veces con PBS estéril 1X. </li><li> Para preparar el medio de cultivo, el Medio Esencial Mínimo (MEM) se complementa con fetal al 5% de suero bovino (FBS), penicilina-estreptomicina 1X solución (500 unidades de penicilLin y 500 g de estreptomicina), suplemento 1X GlutaMAX-I, y los reactivos antimitóticos que contiene 20 mM de 5-fluoro-2-desoxiuridina y 20 mM uridina (FDU / R). Para el medio libre de suero, el FBS se sustituye con el suplemento de B27. </li><li> La colagenasa Se prepara una solución disolviendo colagenasa Un polvo con MEM para hacer una concentración de trabajo de 1 mg / ml. Para la tripsina, la 1X TrypLE Express se utiliza. </li></ol> 2. Disección y Cosecha de ratón adulto las neuronas DRG <ol><li> Después de la eutanasia de los 6 - de ratón adulto de 10 semanas de edad, retire la piel dorsal y le cortó toda la columna. Lavar la columna vertebral eliminado con 1 x PBS 2-3 veces. </li><li> Pin de la columna vertebral para eliminar la placa de la disección con el lado ventral y quita cuidadosamente los músculos para exponer los nervios sensoriales con un microscopio de disección. Los nervios conectados a los GRD a nivel de la madera son los más gruesos y fáciles de localizar. Por lo tanto, sólo para la mayoría de los experimentos lumbarGRD se cosechan. </li><li> Corte a través de cada vértebra a lo largo de la línea central con unas tijeras pequeñas y retire con cuidado los discos intervertebrales. El uso de pinzas para separar las vértebras para exponer la médula espinal. </li><li> Para diseccionar los GRD de madera, levanta cada nervio de madera con una pinza y trazar hacia la médula espinal para localizar a los GRD asociados lumbares (L1 a L6). </li><li> Cortar cada GRD del nervio periférico conectado, las raíces dorsales y ventrales con unas tijeras de primavera, y lo almacena en un tubo de microcentrífuga con medio MEM se coloca en hielo. Más GRD en diferentes niveles espinal (por ejemplo GRD torácica) puede ser disecado cabo de una manera similar, cuando sea necesario. </li></ol> 3. La digestión y la disociación de ratón adulto las neuronas DRG <ol><li> Después de recoger todos los GRD disecados, reemplace el medio MEM con colagenasa 1 ml de una solución e incubar el tubo de microcentrífuga a 37 ° C durante 90 min. </li><li> Vuelva a colocar la colagenasa una solución con 500 l Express 1X TrypLE paralución y se incuba a 37 ° C durante 15-20 min. </li><li> Retire la solución de TrypLE Express y lavar los GRD con un medio de cultivo preparado ml (con un 5% de SFB) por 3 veces. </li><li> Añadir 600 l medio de cultivo y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo para triturar los tejidos de 20-30 veces con un 1 ml de azul, se graduó punta de la pipeta. </li><li> Después de la trituración, permitir que los tejidos no disociadas a asentarse en el fondo de la microcentrífuga y transferir la suspensión celular a un tubo de 10 ml estéril. Añadir otro medio de 600 l cultura y repita el paso de trituración hasta que la mayoría de los tejidos se disocian. La suspensión celular obtenida contiene tanto neuronas y células no neuronales. En la mayoría de los casos, las células de 6 GRD (~ 5 x 10 4) se utilizan para la reacción electroporación una. </li></ol> 4. La manipulación genética de las neuronas a través de electroporación <ol><li> Preparar la solución de transfección mediante la mezcla de la solución nucleofection Amaxa para las neuronas de ratón con plásmidos de ADN (~ 10 mg) O oligos siRNA (~ 0,2 nmol) para hacer un volumen final de 100 l por cada transfección. </li><li> Centrifugar las células disociadas a 680 rpm durante 7 minutos a temperatura ambiente, y desechar el sobrenadante tanto como sea posible. Añadir la solución de transfección preparada y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces con puntas de pipeta de 200 l para volver a suspender las células. </li><li> Transferir la suspensión celular se mezcla con la solución de transfección de la cubeta de electroporación y electroporate las células utilizando el programa Amaxa nucleofector sistema G-013. </li><li> Después de la electroporación, inmediatamente añadir 500 l de pre-calentado (37 ° C) que contenía FBS al medio de cultivo a la cubeta y transferir toda la solución (~ 600 l) en la placa de cultivo recubierto con densidades de células deseadas. Para el experimento que requiere re-suspensión y re-chapado, las neuronas se cultivan directamente sobre la placa de cultivo de plástico a alta densidad (10000-20000 células / pocillo). Para el experimento que se examina directamente el crecimiento del axón, las neuronas son ont plateadoo cubreobjetos de vidrio recubiertas con menor densidad (3000-5000 células / pocillo). Coloque la placa de cultivo en la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2). </li><li> Cuatro horas después de placas cuando las neuronas se han unido a los sustratos, vuelva a colocar el medio de cultivo (que contiene la solución nucleofection Amaxa) con 500 l medio de cultivo fresco y pre-calentado, y devolver la placa a la incubadora para el cultivo adicional (37 ° C , 5% CO 2). Tanto medio de cultivo que contiene FBS o el medio libre de suero se puede utilizar en este paso. </li></ol> 5. El cultivo de neuronas DRG para adultos para el Análisis de Axon crecimiento <ol><li> Para las neuronas transfectadas con plásmidos de ADN, la expresión del gen de interés (por ejemplo, EGFP) se puede observar ya en una hora unos pocos después de la electroporación. Para las neuronas transfectadas con siRNAs, por lo general esperar 3-4 días para permitir que el agotamiento suficiente de las proteínas endógenas. Los cultivos de neuronas se puede, ya sea directamente fijada para el análisis de crecimiento de los axones en el varionos puntos de tiempo (1-4 días después de la electroporación) o re-suspendido y re-chapada para analizar axón rebrote (véase más adelante). </li><li> Para RNAi mediada por la pérdida de la función de los estudios, los cultivos de neuronas puede ser re-suspendido y vuelto a chapar para permitir que los axones de las neuronas a crecer de nuevo, en los que las proteínas específicas ya están agotadas. Para ello, sustituir el medio de cultivo antiguo de los cultivos de neuronas de alta densidad con 1 ml de pre-calentado medio fresco y la pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo para 6-10 veces para volver a suspender las neuronas conectados de la placa de cultivo. Debido a que las células no neuronales (por ejemplo, células de Schwann) adjuntar mucho más ajustada a la placa de cultivo de neuronas, las células suspendidas de re-son principalmente las neuronas. </li><li> Transferir las neuronas de re-suspendida en un tubo de microcentrífuga y se tritura suavemente 10-15 veces para volver a disociar los grupos de células en la suspensión de células individuales. </li><li> Placa de re-re-las neuronas disociadas en cubreobjetos recién preparados en el de baja densidad (3000-5000 células / pocillo) y la cultura durante toda la noche (16-24 horas). </li></ol> 6. Fijación, tinción inmuno-, e imágenes de fluorescencia <ol><li> Aspirar el medio y añadir un 4% paraformaldehído (PFA) (200 l / pocillo) para fijar las células durante 15-20 minutos a temperatura ambiente. Las células fijadas se lavan entonces con 1X PBS durante 3 veces. </li><li> Aspirar el PBS y añadir la solución de bloqueo (1% de albúmina sérica bovina, 0,1% de Triton X-100, y 2,0% de suero normal de cabra en PBS 1X) a las neuronas fijos durante 60 min a temperatura ambiente. </li><li> Para los axones de la etiqueta, las neuronas son inmuno-teñidas con anti-neurofilamentos o anti-anticuerpos βIII tubulina. Para ello, coloque una gota 30μl de la solución de anticuerpo primario (1:1200 dilución de la tubulina-βIII anticuerpos) en una parafina para cada cubreobjetos. Invertir los cubreobjetos y colocarlos en la solución de anticuerpo primario durante 60 min a temperatura ambiente. </li><li> Volver cubreobjetos a la placa de cultivo original y se lava con PBS 1X durante 3 veces. </li><li> Repita el mismo procedimiento para la una secundariatibody. </li><li> Lavar los cubres con agua destilada por 3 veces, y luego montar cubreobjetos sobre portaobjetos de vidrio con la solución de montaje (por ejemplo, prolongar la Antifade Oro). </li><li> Las neuronas teñidas se pueden visualizar con cualquier sistema de microscopía de fluorescencia equipado con una cámara digital. Las longitudes de los axones se miden y analizan con el software de análisis de imágenes. </li></ol> 7. Los resultados representativos En la ausencia de factores de crecimiento extracelulares agregado, las neuronas DRG adultos por lo general comienzan a crecer los axones de 48 horas después de sembrar primero. Los axones muestran a menudo morfologías ramificados (Figura 1). En contraste, las neuronas de re-chapados empezar a extender axones sólo una hora pocos después de placas, y los axones alargado con mucho menor ramificación (Figura 2). Estos resultados sugieren que la re-chapados neuronas comparten propiedades similares a las de las neuronas lesionadas acondicionado. Al utilizar este enfoque, hemos realizado recientemente la pérdida de-de la función de los estudios para examinar el papel de la regeneración axonal factor de transcripción c-Jun asociada en el crecimiento de los axones de las neuronas adultas DRG in vitro. Los resultados mostraron que la electroporación de un grupo de 4 diferentes siRNAs dirigidos a diferentes regiones de c-Jun (ON-TARGETplus) reduce notablemente los niveles de proteína de c-Jun en adultos neuronas DRG 3 días después de la transfección (Figura 3) 9. Cuando las neuronas se volvieron a plateado y culta el crecimiento durante la noche, los axones de las neuronas desmontables c-Jun se redujo significativamente (control: 348,37 ± 16.21mm; si-c-Jun: 262,32 ± 15,69 micras, Figura 3) 9. Estos resultados indican que las neuronas adultas cultivadas DRG proporciona un modelo útil para estudiar el crecimiento del axón de las neuronas adultas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig1.jpg" /> Figura 1. Adultos DRG neuronas de ratón cultivadas en baja densidad durante 3 días. Las neuronas fueron teñidas con anti - &amp; bETA, anticuerpos III tubulina. Tenga en cuenta que la mayoría de los axones muestran morfologías ramificados. Barra de escala: 125 m. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig2.jpg" /> Figura 2. Re-chapado del ratón adulto las neuronas DRG después de 3 días de cultivo. (A), las neuronas cultivadas DRG para adultos en alta densidad de 3 días. (B) re-chapada DRG neuronas adultas fueron cultivados a baja densidad para pasar la noche. Tenga en cuenta que la mayoría de los axones muestran morfologías alargadas con poca ramificación del axón. Barra de escala: 250 m en A y 125 micras en B. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig3.jpg" /> Figura 3. El papel de c-Jun en el crecimiento de los axones de las neuronas DRG adultos in vitro. (A) Western blot de c-Jun en el ratón adulto las neuronas DRG después de la electroporación de c-Jun siRNAs. El resultado muestra el nivel notablemente reducido de c-Jun. (B) Control de las neuronas transfectadas con EGFP creció axones largos después de la re-siembra y el cultivo de una noche. (C) Co-transinfección de c-Jun siRNAs y EGFP crecimiento axonal deterioro de los adultos las neuronas DRG después de la re-siembra y el cultivo de una noche. Rojo: Tuj-1 tinción; Verde: EGFP. Barra de escala: 125 m. Estos resultados han sido publicados en Saijilafu et al. 9.

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No hay conflictos de interés declarado.

Adultos DRG neuronas regeneren sus axones firmeza después de la lesión del nervio periférico in vivo e in vitro, lo que proporciona un sistema útil para estudiar la regeneración de axones en los animales adultos. El cultivo in vitro de los adultos las neuronas DRG se está convirtiendo en un método ampliamente utilizado para investigar los mecanismos moleculares por los cuales la regeneración del axón está regulado. El procedimiento in vitro de neuronas de c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> Poli-D-lisina hidrobromuro </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> La laminina </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td></tr><tr><td> 5-fluoro-2-desoxiuridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Uridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U3003 </td></tr><tr><td> Una colagenasa </td><td> Roche </td><td> 10103578001 </td></tr><tr><td> TrypLE expreso </td><td> Invitrogen </td><td> 12604-013 </td></tr><tr><td> Suero bovino fetal </td><td> Invitrogen </td><td> 10270-098 </td></tr><tr><td> La penicilina-estreptomicina (100 veces) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122</td></tr><tr><td> GlutaMAX-I (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-038 </td></tr><tr><td> Vidrio cubreobjetos (# 1) </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencias </td><td> 72196-12 </td></tr><tr><td> 24 células y placa de cultivo </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21 a 040 CV </td></tr><tr><td> Agua estéril, destilada y desionizada </td><td> Mediatech </td><td> 25 a 055 CV </td></tr><tr><td> Nucleofector y electroporación Kits para las neuronas de ratón </td><td> Lonza </td><td> VPG-1001 </td></tr><tr><td> ON-TARGETplus siRNA contra c-Jun </td><td> Dharmacon </td><td> L-043776 </td></tr><tr><td> Anticuerpo anti - tubulina βIII (Tuj-1) </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td></tr><tr><td> Prolongar la solución de Oro Antifade de montaje </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td></tr></tbody&gt; </table>

genetic study of axon regeneration with cultured adult dorsal root ganglion neurons

Es bien sabido que las neuronas maduras en el sistema nervioso central (SNC) no se puede regenerar sus axones después de lesiones debidas a la capacidad disminuida intrínseca para apoyar el crecimiento axonal y un ambiente hostil en el 1,2 SNC maduro. En contraste, las neuronas maduras en el sistema nervioso periférico (PNS) regenerar fácilmente después de las lesiones 3. XXX raíz dorsal (DRG ganglionares) neuronas son bien conocidos para regenerar robustamente después de lesiones de nervios periféricos. Cada neurona DRG crece un axón del soma celular, que se ramifica en dos ramas: una rama axonal periférico que inerva objetivos periféricos y una rama central que se extiende a la médula espinal. Lesiones de los resultados DRG axones periféricos en la regeneración de axones sustancial, mientras que los axones centrales en la médula espinal regenerarse poco después de la lesión. Sin embargo, si la lesión axonal periférica se produce antes de la lesión de la médula espinal (un proceso llamado la lesión acondicionado), la regeneración de los axones centrales es greatly mejora 4. Por otra parte, los axones de las neuronas DRG centrales comparten el mismo ambiente hostil como descendente corticoespinal axones en la médula espinal. En conjunto, es la hipótesis de que los mecanismos moleculares que controlan la regeneración de los axones de las neuronas DRG adultos pueden aprovecharse para mejorar la regeneración del SNC axón. Como resultado, adultos neuronas DRG se utilizan ahora ampliamente como un sistema modelo para estudiar el crecimiento axonal regenerativo 5-7. Aquí se describe un método de cultivo adulto DRG neurona que puede ser utilizado para el estudio genético de la regeneración axonal in vitro. En este ejemplo de un adulto las neuronas DRG están genéticamente manipulados a través de electroporación mediada por transfección de genes 6,8. Al transfectar neuronas con ADN plásmido o si / shRNA, este enfoque permite a ambos ganancia y la pérdida de la función de los experimentos para investigar el papel de un gen de interés en el crecimiento de los axones de las neuronas DRG adultos. Cuando las neuronas son transfectadas con SI / shRNA, la proteína endógena es dirigidageneralmente agotada después de 3-4 días en cultivo, durante el cual el crecimiento del axón tiempo robusta ya ha ocurrido, por lo que los estudios de pérdida de la función sea menos eficaz. Para resolver este problema, el método aquí descrito incluye un paso de re-suspensión y re-chapado después de la transfección, que permite que los axones para volver a crecer a partir de las neuronas en la ausencia de la proteína específica. Por último, ofrecemos un ejemplo del uso de este modelo in vitro para estudiar el papel de una regeneración axonal asociada a la genética, c-Jun, en la mediación de crecimiento de los axones de las neuronas DRG adultos 9.

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Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para el estudio genético de la regeneración axonal utilizando cultivos de neuronas de ratones adultos ganglio de la raíz dorsal se describe. El método incluye un paso para permitir re-suspension/re-plating axón re-crecimiento de las neuronas se someten a la manipulación genética. Este enfoque es especialmente útil para los estudios de pérdida de la función de regeneración axonal utilizando RNAi basado en caída proteína.

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.4K vistas.  Johns Hopkins University School of Medicine. Un In vitro Modelo para el estudio genético de la regeneración axonal utilizando cultivos de neuronas de ratones adultos ganglio de la raíz dorsal se describe. El método incluye un paso para permitir re-suspension/re-plating axón re-crecimiento de las neuronas se someten a la manipulación genética. Este enfoque es especialmente útil para los estudios de pérdida de la función de regeneración axonal utilizando RNAi basado en caída proteína.

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Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Investigación

Neurociencias

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

En Vitro Modelado de canceroso Neural Invasion: Modelo del ganglio de la raíz dorsal

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Un Enfoque para Mejorar la alineación y la mielinización de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Inyección de raíz dorsal ganglio de raíz dorsal y Lesión por aplastamiento como modelo para la regeneración del axón sensorial

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Laminotomía para acceso de ganglio de raíz Dorsal Lumbar y de la inyección en los cerdos

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Investigadora de axón mamífero de regeneración: En Vivo electroporación de ganglio de raíz Dorsal de ratón adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Aislamiento rápido de macrófagos de ganando de raíz dorsal

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.

Uso De Las Neuronas Del Hipocampo Cultivadas Primarias Para Estudiar El Ensamblaje De Los Segmentos Iniciales Axón

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

In situ Visualización del crecimiento de axones y la dinámica de los conos de crecimiento en cultivos agudos de cortes cerebrales embrionarios ex vivo

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...