Nos gustaría dar las gracias a Andrea Tedeschi para ayudar en el establecimiento de los experimentos inicial de fichas en el laboratorio y Lindner Ricco por su contribución a ajustar las condiciones para el chip. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Hertie, la subvención de Fortune, de la Universidad de Tubinga, y la DFG DI subvenciones 1497/1-1 (todos los concedidos a Simone Di Giovanni).

1. Columna dorsal ciático y la lesión del nervio <ol><li> El animal se coloca sobre un paño quirúrgico y por debajo de ella un thermopad está presente durante todo el procedimiento, manteniendo la temperatura corporal del ratón a 37 ° C. Todos los animales son anestesiados para una cirugía con una continua isoflurano / O 2 de la administración. Los instrumentos quirúrgicos se esterilizan en autoclave antes del procedimiento. </li><li> Por lesiones ciático, ambos miembros posteriores son cuidadosamente afeitado y la depilación se ha completado con el removedor de pelo genéricos antes de la limpieza de la piel con alcohol seguido por Betadyne 3 veces. </li><li> El nervio ciático se expone mediante una incisión de 4 mm posterior y paralela al fémur a la mitad del muslo a través de la piel y mediante la difusión de los músculos además del músculo bíceps femoral con unas pinzas finas. </li><li> El nervio ciático es expuesto a continuación, lesionado, y la piel se cierra con dos clips de sutura. </li></ol> NOTA: La misma incisión se realiza para exponer el nervio ciático, pero se sutura la herida cerrada dejando el nervio intacto de la lesión simulada. <ol start="5"><li> Por lesiones de la columna dorsal, la parte de atrás del ratón es cuidadosamente afeitado y la depilación se ha completado con el removedor de pelo genéricos antes de la limpieza de la piel con alcohol aerosol / golpe. </li><li> La médula espinal está expuesta mediante una incisión de 2,5 cm a partir de T7 a T13. La piel se separan, y el tejido conectivo se elimina a lo largo de la vértebra de T9 a T11. </li><li> La laminectomía se realiza a nivel de T10 </li></ol> NOTA: Para la mayoría de los experimentos, la laminectomía se considera la lesión Sham. <ol start="8"><li> Unas pocas gotas de Xylocain se añaden a los tejidos para anestesiar a la cuerda, y la duramadre se retira, prestando atención para no tocar la médula espinal. </li><li> Las columnas dorsales están lesionados y el músculo se sutura cerca, de nuevo prestando atención para no tocar la médula espinal. Finalmente, la piel se sutura cerrada con clips de sutura. La buprenorfina (0,1 mg / kg de peso corporal) se debe administrar dos veces al día durante 48 horas o hasta que ya no son necesarios. </li></ol> 2. Entrecruzamiento <ol><li> Diseccionar DRG L4 y L5 de ratones heridos después de la eutanasia. Recoge un total de 16 GRD en helado HBSS + cóctel de inhibidores de la proteasa (2 heridos y 2 DRG farsa de cada animal para un total de 4 animales). </li><li> En pocas palabras centrífuga de la DRG, a continuación, retire con cuidado la HBSS y añadir 500 l de formaldehído al 1% en PBS cóctel + inhibidores de la proteasa e incubar la muestra durante 30 minutos a 37 ° C. </li></ol> Paso crítico. Use formaldehído fresco, de calidad para biología molecular. <ol start="3"><li> Añadir 125 mM de glicina para detener la fijación e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> En pocas palabras centrífuga, aspirado de buffer, y lavar el tejido dos veces con 500 l helado de PBS cóctel + inhibidores de la proteasa. </li></ol> 3. Los núcleos de preparación y corte de la cromatina <ol><li> Aspirar de PBS, añadir 400 l de tampón de lisis SDS, transferir a un tubo de microcentrífuga de pre-enfriado, y destruir el tejido de alrededor de 30 golpes con la micropestle. </li></ol> Paso crítico. Lisis y la alteración de los tejidos son de vital importancia para un buen rendimiento de la cromatina reticulada. <ol start="2"><li> Sonicar la muestra con 8 pulsos, 10 segundos cada uno en un 70% la producción (Bandelin, Sonoplus GM70). </li></ol> PRECAUCIÓN. El corte de la cromatina debe ser optimizado para su tratamiento con ultrasonidos en particular configuración y la fragmentación apropiada de la cromatina se debe comprobar antes de ejecutar el experimento IP actual (ver sección 3). NOTA. La fragmentación de la cromatina también puede ser realizada por micrococcal nucleasa (MNase) la digestión. Como regla general, la fragmentación por ultrasonidos es el preferido para los tejidos fijos, mientras que la digestión se ve favorecida por MNase inmunoprecipitación de la cromatina nativa tejido. Reticulada, la cromatina cortado puede ser almacenado a -80 ° C hasta por 2 meses, pero evitar los ciclos de congelación / descongelación ciclos. 4. Análisis de la digestión de la cromatina (recomendado) <ol><li> Retire 10 l de la muestra de la cromatina cortado para su análisis. Añadir 200 mM de NaCl a la muestra y revertir la reticulación mediante la incubación a 65 ° C durante 2 horas. </li><li> Purificar el ADN (ver sección 8) y ejecutar un 1% en gel de agarosa. ADN debe ser fragmentada a una longitud de aproximadamente 200-1000 pb (Figura 1). </li></ol> PRECAUCIÓN. Excesiva fragmentación de la cromatina puede conducir a la señal de disminución, mientras que la fragmentación incompleta dará lugar a la resolución disminuye y el fondo mayor. 5. Inmunoprecipitación <ol><li> Determinar el número de reacciones de inmunoprecipitación (ver nota abajo), y se dividen en partes iguales en tubos de muestras nuevas. Llevar el volumen de cadahasta 500 ml con buffer chip + inhibidores de la proteasa cóctel. </li><li> Tomar 5 l de la muestra diluida y transferir a un tubo nuevo. Esta es la muestra de 1% de entrada y se almacenan a -20 ° C hasta que sea necesario (Sección 7). </li><li> Para cada inmunoprecipitación, añade anticuerpo apropiado o normal de control de IgG e incubar a ° C durante la noche con rotación 4. </li></ol> NOTA. Para determinar el número de inmunoprecipitación, un control positivo (por ejemplo, anticuerpos Histona H3) y un control negativo (normal IgG) debe ser considerado. La cantidad de anticuerpos utilizados para cada IP varía entre los anticuerpos y debe ser determinada empíricamente. Sin embargo, es por lo general dentro de un rango de 2-10? G / inmunoprecipitación. <ol start="4"><li> Para inmunoprecipitar su anticuerpo / proteína / ADN, añadir 30 l de chip grado de proteínas G bolas magnéticas y se incuba durante 2 horas a 4 ° C con rotación. </li></ol> 6. Lavado <ol><li> De pull-down obligado cromatina cordón complejo, se coloca el tubo en la rejilla magnética. Espere hasta que la solución es clara y luego retire con cuidado el sobrenadante. </li><li> Añadir 1 ml de lavado de baja en sal (buffer chip) hasta el talón y se incuba a 4 ° C durante 3-5 minutos con una rotación, a continuación, tire hacia abajo los granos y aspirado de lavado como en el paso 6.1. Repita este paso para un total de 3 lavados. </li><li> Añadir 1 ml de solución tampón lavado de alta sal (CHIP buffer + 350 mM NaCl) hasta el talón y se incuban durante 3-5 minutos con una rotación, a continuación, tire hacia abajo los granos y aspirado de lavado como en el paso 6.1. </li></ol> 7. Elución y la reversión de cross-linking <ol><li> Tomar las muestras de entrada de la -20 ° C, añadir 150 ml de tampón de elución chip y dejar de lado a temperatura ambiente hasta el Paso 7.5. </li><li> Añadir 150 ml de buffer de elución 1x chip para cada muestra de IP de Paso 6.3. </li><li> Colocar los tubos en un termomezclador y eluir la cromatina de los granos mediante la incubación de muestras a 65 ° C durante 30 minutos con agitación suave. </li><li> Desplegable granos en la rejilla magnética, y con mucho cuidado la transferencia de la cromatina eluido (sobrenadante) en los tubos nuevos. </li><li> A todos los tubos, incluyendo muestras de su entrada, agregue 200 mM de NaCl y 40 g / reacción de proteinasa K y se incuba a 65 ° C durante 2 horas. </li></ol> NOTA. La etapa de elución puede realizarse a temperatura ambiente, también, pero podría no ser tan eficiente. 8. ADN de recuperación <ol><li> Añadir 1 volumen de fenol / cloroformo a su paso muestras de 7,5 y agitar durante 30 segundos. </li><li> Centrifugar a máxima velocidad en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante 5 minutos. </li><li> Con cuidado, la recuperación de la acuosa (superior) de fase en los tubos nuevos, agregar 1 volumen de cloroformo a la fase acuosa, y agitar durante 30 segundos. </li><li> Centrifugar a máxima velocidad en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante 5 minutos. </li><li> Con cuidado, la recuperación de la acuosa (superior) en la fase de tubos nuevos, a continuación, añadir 300 mm de NaOAc, 20 mg / reacción de glucógeno, y 2,5 volúmenes de etanol helado al 100%. </li></ol> PRECAUCIÓN. La adición de un portador, como el glucógeno, es necesaria para mejorar la precipitación de fragmentos de ADN relativamente pequeño tamaño. <ol start="6"><li> Se incuba a 80 ° C durante 2 horas para precipitar el ADN. </li></ol> NOTA. La etapa de precipitación también se puede realizar durante la noche a -20 ° C. <ol start="7"><li> Centrifugar las muestras a la máxima velocidad en una microcentrífuga durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante y lavar los sedimentos de ADN se precipitó con 300 l de helado de etanol al 70%. </li><li> Centrifugar las muestras a la máxima velocidad en una microcentrífuga durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Retire con cuidado tanto sobrenadante como sea posible y dejar que las bolitas de aire seco. </li><li> Resuspender en 20 l de H 2 O. estéril Las muestras ya están listos para PCR, o el ADN puede ser almacenado a -20 ° C. </li></ol> 9. Resultados representante Un resultado representativo de un experimento de chip en GRD siguientes lesión ciática se muestra (Figuras 1 y 2). En primer lugar, mostrar fragmentación de ADN con una longitud de aproximadamente 200-1000 pb (Figura 1). En segundo lugar, demostrar un chip de señal PCR después del promotor proximal de la proteína asociada al crecimiento-43 (GAP-43) sólo después de la lesión del nervio ciático (carril 4, figura 2, 5 &#39;). No hay señal de PCR se presenta cuando el animal recibe una lesión en la farsa solo (calle 3), y cuando se utiliza el suero normal de IgG para la IP (carril 5 y 6). Para probar la especificidad de los anticuerpos, se analizaron las muestras de ADN mismo, sino que se utiliza un conjunto de cebadores de control que detecta una región en la 3&#39;-UTR de nuestro gen de interés, donde se espera que no la ocupación. Señales de PCR están ausentes de todos los carriles (carriles 3-6, Figura 2, 3 &#39;), a excepción de la señal de entrada, lo que representa no-IP muestras de ADN como los controles estándar de PCR (carriles 1-2, Figure 2). Este procedimiento chip se puede realizar después de una lesión por la columna vertebral dorsal ciático o como se resume en un esquema (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Gel de agarosa de invertir reticulado de ADN que ha sido cortado por ultrasonidos para el rango adecuado de longitudes de los fragmentos. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Semi-cuantitativos de PCR a partir de tejido DRG siguientes lesión del nervio ciático, que muestran que p53 acetilado se une a la GAP-43 región promotora proximal 48 horas después de la lesión del nervio ciático. Control de PCR de la serie DRG mismo tejido que el gen p53 acetilado no se une a una región de control del ADN situado en la región 3 &#39;no traducida (UTR) de la GAP-43 gen (S = Sham, I = lesionados). <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Un esquema general que muestra la ubicación de los sitios de lesión en el nervio ciático, y la columna dorsal.

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	<li>Beirowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+analysis+of+Wallerian+degeneration+using+restricted+axonal+labelling+in+YFP-H+mice.">Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).</li><li>Carey, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).</li><li>Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(&amp;mu;ChIP.">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (&amp;mu;ChIP.</a> Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.+Plant+Methods.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods.</a> 11, 3-11 (2007).</li><li>Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Makwana, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+successful+peripheral+regeneration.">Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration.</a> Febs J. 272, 2628-2638 (2005).</li><li>Tedeschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+p53-CBP/p300+transcription+module+is+required+for+GAP-43+expression,+axon+outgrowth,+and+regeneration.">A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).</li><li>Teng, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regeneration+in+adult+CNS+neurons--signaling+molecules+and+pathways.">Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways.</a> J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).</li></ol>

Este protocolo proporciona un método de preguntar directamente sobre el medio ambiente de la cromatina durante la regeneración axonal en el sistema nervioso adulto después de una lesión axonal. Se incorpora el modelo de lesión DRG con inmunoprecipitación de cromatina para investigar el entorno de la transcripción y epigenéticos posteriores a la lesión a cualquiera de los SNP o sistema nervioso central. Es particularmente útil para los investigadores que deseen para caracterizar putativo sitios de unión para e...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Buffer chip 10 veces </td><td> Señalización Celular </td><td> 7008 </td></tr><tr><td> Chip 2x Tampón de Elución </td><td> Señalización Celular </td><td> 7009 </td></tr><tr><td> Grado chip de proteína G bolas magnéticas </td><td> Señalización Celular </td><td> 9006 </td></tr><tr><td> Bastidor de agarre Magna (8 también) </td><td> Millipore </td><td> 20-400 </td></tr><tr><td> Cloroformo </td><td> MERCK </td><td> De las Naciones Unidas 1888 </td></tr><tr><td> 37% de formaldehído </td><td> ROTH </td><td> CP10.1 </td></tr><tr><td> 10x solución de glicina </td><td> Señalización Celular </td><td> 7005 </td></tr><tr><td> Glucógeno </td><td> Sigma </td><td> G1767 </td></tr><tr><td> HBSS 10x </td><td> Gibco </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> Histona H3 de anticuerpos (conejo) </td><td> Señalización Celular </td><td> 2650 </td></tr><tr><td> IgG normal de conejo </td><td> Señalización Celular </td><td> 2729 </td></tr><tr><td> Fenol / cloroformo / alcohol isoamílico </td><td> ROTH </td><td> A156.1 </td></tr><tr><td> Inhibidores de la proteasa Cocktail comprimidos </td><td> Roche </td><td> 04 693 116 001 </td></tr><tr><td> Proteinasa K (20 mg / ml) </td><td> Señalización Celular </td><td> 10012 </td></tr><tr><td> Tampón de lisis SDS </td><td> Al norte del estado </td><td> 20-163 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Equipo necesario </th></tr><tr><td> Sonicator </td></tr><tr><td> Micropestle </td></tr><tr><td> Microcentrífuga </td></tr><tr><td> Thermomixer </td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury

Axones en el sistema nervioso central (SNC) no se regeneran mientras que en el sistema nervioso periférico (SNP) se regeneran de forma limitada después de la lesión (Teng et al., 2006). Se reconoce que los programas de transcripción esencial para crecimiento de las neuritas y axones se reactivan después de la lesión en el SNP (Makwana et al., 2005). Sin embargo las herramientas disponibles para analizar la regulación de genes neuronales in vivo son limitadas y desafíos. Los ganglios de la raíz dorsal (GRD) ofrecen un sistema modelo excelente lesiones ya que tanto el SNC y SNP son inervadas por un axón bifurcado procedentes de la soma mismo. Los ganglios representan una colección discreta de cuerpos celulares en todos los eventos de la transcripción se producen, y proporcionar así una región claramente definida de la actividad transcripcional que puede ser fácilmente reproducible y retirado del animal. Lesiones de las fibras nerviosas en el SNP (nervio ciático, por ejemplo), donde la regeneración axonal ocurre, debe revelar una serie de programas de transcripción que son distintos de los que respondieron a una lesión similar en el sistema nervioso central, donde la regeneración no tiene lugar (por ejemplo, la médula espinal ). Sitios de unión factor de transcripción, histonas y la modificación del ADN resultante de una lesión a cualquiera SNP o sistema nervioso central puede caracterizarse utilizando inmunoprecipitación de cromatina (CHIP). Aquí se describe un protocolo de chip usando tejido fijado DRG ratón después de una lesión axonal. Esta poderosa combinación ofrece un medio para caracterizar el entorno de la cromatina a favor de la regeneración necesaria para promover la regeneración axonal.

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Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Se presenta un método de inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal. El enfoque puede ser utilizado para identificar sitios específicos de factor de transcripción vinculante y la modificación epigenética de las histonas y el ADN importantes para la regeneración de los axones dañados, tanto en el sistema nervioso periférico y central.

Inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

chromatin-immunoprecipitation-from-dorsal-root-ganglia-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.0K vistas.  University of Tuebingen. Se presenta un método de inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal. El enfoque puede ser utilizado para identificar sitios específicos de factor de transcripción vinculante y la modificación epigenética de las histonas y el ADN importantes para la regeneración de los axones dañados, tanto en el sistema nervioso periférico y central.

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Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Imágenes en vivo de los axones de la raíz dorsal después de rizotomía

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Investigación

Neurociencias

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Imaging intravital de axonales Interacciones con macrófagos y microglia en un ratón Dorsal Crush Columna Lesión

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

Extrusión hidráulica de la médula espinal y aislamiento de los ganglios de la raíz dorsal en roedores

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Inyección de raíz dorsal ganglio de raíz dorsal y Lesión por aplastamiento como modelo para la regeneración del axón sensorial

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Aislamiento de los ganglios de raíz dorsal y en cultivo primario para el estudio de liberación de neurotransmisor

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Aislamiento rápido de macrófagos de ganando de raíz dorsal

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purificación de fibroblastos y células Schwann de los nervios sensoriales y motores en Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as well as various other cell types. Published culture protocols often refer to whole dissociated DRG cultures as being neuronal, despite the presence of fibroblasts, Schwann cells, macrophages, and lymphocytes. While these whole DRG cultures are sufficient for imaging applications where neurons can be discerned based on morphology or staining, protein or RNA homogenates collected from these cultures are not primarily neuronal in origin. Here, we describe an immunopanning sequence for cultured mouse DRGs. The goal of this method is to enrich DRG cultures for neurons by removing other cell types. Immunopanning refers to a method of removing cell types by adhering antibodies to cell culture dishes. Using these dishes, we can negatively select against and reduce the number of fibroblasts, immune cells, and Schwann cells in culture. This method allows us to increase the percentage of neurons in cultures.

This paper describes an immunopanning protocol for adult mouse dorsal root ganglia. By adhering antibodies to culture plates, we can negatively select and remove non-neuronal cells. We show that the cultures are enriched for neurons using this protocol, allowing for an in-depth study of neuronal responses to manipulation.

Enriquecimiento de cultivos de neuronas de ganglios de la raíz dorsal de ratones adultos mediante inmunopanización

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...