Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (AI050677, HD-051998, y GM103433), Malcolm Feist una beca de investigación cardiovascular, y la American Heart beca predoctoral Asociación (10PRE4200007).

1. Preparación de gelatina cubreobjetos recubiertos <ol><li> Coloque los lavados con ácido cubreobjetos de vidrio (15 mm de diámetro) en un plato de plástico estéril mm 100 (ES). Coloque 8-9 cubreobjetos por placa y asegurarse de que no se toquen entre sí o los lados del plato .. </li></ol> Nota: cubreobjetos, agujas y pinzas necesitar ser estériles para eliminar posibles microorganismos contaminantes, así como endotoxinas que afectan las funciones celulares, incluyendo la motilidad. <ol start="2"><li> Pesar el polvo de gelatina y resuspender el polvo en agua desionizada para preparar una solución de gelatina con una concentración final de 0,5 g/300 ml. A continuación, la solución de gelatina tiene que ser esterilizados en autoclave. </li><li> Pipetear 2-3 gotas de gelatina (~ 100-150 ml) a cada cubreobjetos. </li></ol> Nota: Tenga cuidado de no permitir que la gelatina para tocar el plato o usted no será capaz de eliminar los cubreobjetos del plato. <ol start="4"&gt; <li> Hornear los cubreobjetos recubiertos de gelatina en la placa de 100 mm en un horno a 90 ° C durante 10 min. </li><li> Quite el exceso de gelatina mediante pipeteo suave. </li><li> Secar los cubreobjetos en la placa de 100 mm en el horno a 70 º C durante 45 min. </li><li> Una vez seco, quite los cubreobjetos de la placa de 100 mm con una solución estéril, libre de endotoxinas aguja y pinzas (la aguja se utiliza para empujar suavemente el cubreobjetos para que sea accesible para las pinzas para quitar suavemente). </li><li> Coloque individuales recubiertos de gelatina cubreobjetos en pocillos separados de una placa de 24 pocillos. </li></ol> 2. Preparación de oro coloidal cubreobjetos recubiertos <ol><li> Pesar una cantidad apropiada de ácido cloroaúrico (trihidrato de ácido tetracloroáurico; HAuCl 4 · 3H 2 O) y luego volver a suspender en agua desionizada estéril para preparar una solución final de 14,5 mM (tóxico). Preparar 1,5 ml de la solución por 8-9 cubreobjetos. </li></ol> Advertencia: el ácido cloroaúrico es hbrazada si se ingiere, causa quemaduras graves en la piel y lesiones oculares graves y pueden causar una reacción alérgica en la piel. Tóxico en caso de ingestión. <ol start="2"><li> Pesar una cantidad adecuada de citrato de sodio (trisódico dihidrógeno 2-hidroxipropano-1, 2,3-tricarboxilato; Na 3 C 6 H 5 O 7) y luego volver a suspender el polvo en agua desionizada para obtener una solución final de 0,5%. Preparar 1 ml de la solución por 8-9 cubreobjetos. </li></ol> Advertencia: el citrato de sodio puede causar irritación de ojos y piel. También puede causar irritación del tracto respiratorio y digestivo. <ol start="3"><li> En una solución estéril, libre de endotoxina vaso de precipitados se combinan 1,5 ml de la estéril 14,5 mM HAuCl 4 solución y 13,5 ml de agua desionizada estéril, y el resultado debe producir una solución de color amarillo pálido. Los volúmenes mencionados permitirá 8-9 cubreobjetos de oro coloidal que se harán. </li><li> Mientras continua la agitación, calentar la solución en una placa caliente hasta que comience a baceite. </li></ol> Advertencia: El calentamiento de la solución se debe realizar en la campana de humos, como vapores puede ser dañino / tóxicos. Los vapores son destructivas para el tejido de las membranas mucosas y las vías respiratorias superiores. <ol start="5"><li> Retirar el vaso de la placa caliente. </li><li> Mientras se agita, añadir 0,7 ml de la solución de citrato de sodio 0,5%. El volumen mencionado permitirá 8-9 cubreobjetos de oro coloidal que se harán. </li><li> Mantener la agitación esta solución combinada durante aproximadamente 2 min (Nota: el color de la solución cambia gradualmente de color amarillo pálido, para borrar, a gris, a púrpura, a púrpura oscuro, antes de llegar a un vino tinto o, preferiblemente, color herrumbre) . Este producto es la solución de oro coloidal. </li><li> Se enfría la solución de oro coloidal en una pipeta de 10 ml para 1-2 min (con el fin de mantener la capa de gelatina sobre el cubreobjetos de fusión cuando la solución de oro coloidal se añade) y luego añadir 1.0-2.0 ml de la colloidal de solución de oro sobre cada cubreobjetos recubiertos con gelatina previamente colocado en un plato de 24-pocillos (es) (la cantidad de la solución de oro coloidal que se agrega a los cubreobjetos recubiertos de gelatina depende de lo bien que las partículas de oro se precipita en la solución - véase comentarios a continuación.) </li></ol> Nota: Debido a que puede haber variaciones en la eficiencia de la precipitación de partículas de oro, se aconseja añadir primero 0.5-1 ml de la solución de oro coloidal a los cubreobjetos recubiertos con gelatina y a continuación la cápsula 24-bien en la incubadora durante 0,5 hr . Después de este tiempo de incubación, los cubreobjetos se examinan bajo el microscopio de luz para la densidad adecuada de las partículas de oro sobre los cubreobjetos. Véase la Figura 1 para 20x imágenes de microscopía de ejemplos de demasiado bajo y demasiado alto una concentración de partículas de oro. Véase la Figura 2 para las imágenes de microscopía 40x de una concentración ideal de partículas de oro (al menos para uso con monocitos). El optimal densidad de las nanopartículas de oro en el portaobjetos debe ser determinado experimentalmente para cada tipo de células utilizadas, como las características de las diferentes células dictará su fuerza de movimiento en los cubreobjetos. Si la concentración de partículas de oro es insuficiente, agrega un adicional de 0.5-1 ml de la solución de oro coloidal a los cubreobjetos recubiertos con gelatina. Dependiendo del tamaño de la célula, la concentración adecuada de partículas de oro pueden variar y, por lo tanto en última instancia dependerá del tamaño de la célula examinado para la motilidad. Por ejemplo, con los monocitos humanos que son de pequeño tamaño células (~ 10-20 micras 28), una mayor concentración de partículas de oro se requería en nuestros análisis. La distribución adecuada de las nanopartículas de oro proporciona al investigador la capacidad de distinguir fácilmente y eficientemente los bordes de las pistas celulares. Una concentración de partículas de oro que es demasiado alta dificulta la capacidad de las células para moverse y por lo tanto para medir con precisiónsu motilidad, mientras que una concentración de partículas de oro que es demasiado bajo límites de capacidad de los de delinear un registro preciso de la motilidad. Nota Importante: Si la síntesis de nanopartículas de oro es problemático, sintetizado nanopartículas de oro están disponibles comercialmente en tamaños desde 5 nm a 400 nm. Adicionalmente, microesferas fluorescentes también se han utilizado en estudios de motilidad de las células 29. Sin embargo, el uso de estas microesferas requiere un microscopio de fluorescencia para el análisis de la migración celular. <ol start="9"><li> Colocar el plato 24-así coloidales con cubreobjetos recubiertos de oro en una incubadora a 37 ° C e incubar entre 1 hr durante la noche. </li><li> Después de la incubación, enjuague / eliminar oro no unido por inmersión de los portaobjetos (3x) en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS, pH 7,4). </li><li> Coloque estos coloidales recubiertas de oro en un cubreobjetos limpio de 12 pocillos placa (s) que contiene PBS. </li><li> Almacenar estos cubreobjetos a 4 ° C hasta el momento deutilizar (Parafilm la placa antes de colocarlos en el refrigerador). </li></ol> Nota importante: Siempre mantenga las coloidales recubiertas de oro cubreobjetos en algún tipo de líquido / medios de comunicación como las partículas de oro pueden desprenderse de los cubreobjetos si se deja secar. Los cubreobjetos de oro coloidal se debe utilizar dentro de 2-3 meses a partir de la fecha en que fueron hechas. Control de calidad: En un solo ensayo phagokinetic motilidad pista, es crítico utilizar cubreobjetos que se caracterizan por una concentración similar de partículas de oro. Este punto simple permitirá a las diferencias cuantitativas en la motilidad celular entre las muestras a ser solamente debido a la naturaleza del tratamiento y no las propiedades físicas de las coloidales de oro revestido con cubreobjetos. Somos partidarios de cubreobjetos usando sólo realizadas al mismo tiempo en experimentos individuales, aunque se ha demostrado que siempre que la densidad de las nanopartículas de oro son iguales, el uso de cubreobjetosa partir de diferentes preparaciones es apropiado. 3. El análisis de la motilidad celular <ol><li> Colocar las coloidales de oro revestido con cubreobjetos en un medio apropiado celulares para las células de interés. </li><li> Transferir las células tratadas adecuadamente sobre las coloidales de oro revestido con cubreobjetos colocados en una placa de 24-pocillos (es) </li></ol> Nota: El número de células transferidas al pozo individual necesita ser determinado para cada tipo de célula estudiado. Idealmente, las células deben ser distribuidas por igual en el oro coloidal recubierto con cubreobjetos, que a su vez permitirá el análisis estadístico de las pistas sólo creado por una sola célula. Si las células se sembraron en placas a una concentración demasiado elevada, se vuelve altamente probable que las pistas superpuestas de células múltiples se verá. Pistas superpuestas no pueden cuantificarse con precisión y, por lo tanto, no pueden tenerse en cuenta en el análisis final del movimiento de las células de la prueba. Superposición de pistas como resultado dela participación de múltiples celdas generalmente son fáciles de observar, como fusionado o cruzado pistas (en el campo de análisis) en la que dos o más células pueden ser observados en la misma área contigua borra. <ol start="3"><li> Incubar a 37 ° C / 5% de CO 2 durante 24 horas (o para cualquier momento adecuado; por ejemplo, hemos analizado la motilidad monocitos entre 6 hr y 24 hr células post-tratamiento y endoteliales en 12 horas después del tratamiento). El marco de tiempo óptimo para determinar y medir la motilidad celular variará con el tipo de célula estudiado y, por lo tanto debe ser determinado experimentalmente para cada tipo de célula (un buen punto de partida, sin embargo, es 6 a 12 horas después del tratamiento). </li></ol> Nota: Si experimentales coloidales de oro cubreobjetos recubiertos necesitan ser almacenados y / o analizados en un momento posterior, las células y nanopartículas de oro necesitan ser fijados sobre los cubreobjetos. Para llevar a cabo esta etapa de fijación; Paso siguiente 3.3, primer lavado cubreobjetos con cuidado 2 veces con 1xPBS (inmersión de cubreobjetos es preferible, como una eliminación de las nanopartículas de oro de cubreobjetos debe evitarse), a continuación, utilizar un método de fijación de células estándar, tal como la incubación con paraformaldehído al 3% a temperatura ambiente. Después de una incubación de 15-min, el paraformaldehído al 3% deben ser retirados y los cubreobjetos se lavaron cuidadosamente 3 veces con 1x PBS. Los cubreobjetos fijos se pueden almacenar en un refrigerador. <ol start="4"><li> Utilizando un microscopio de luz, capturar imágenes de las pistas creadas por una sola célula en movimiento (Nota: El aumento que se usa para tomar fotografías de pistas celulares ciertamente variar en función del tipo de células bajo investigación). Ejemplos de pistas celulares creadas por las células no móviles y móviles sobre coloidales recubiertas de oro cubreobjetos se muestra en la Figura 2. </li></ol> Nota: Las nanopartículas de oro de tamaño utilizado en el ensayo de motilidad pista phagokinetic se ha encontrado para ser completamente no tóxico para las células 30. Si es necesario, La viabilidad de las células examinadas se puede evaluar por tinción con azul de tripano o examinar para otros marcadores de viabilidad celular. Habría que tener en cuenta la necesidad de fijación, tipo de fijación, etc, si este paso debe llevarse a cabo. <ol start="5"><li> Usando el software libremente disponible, tales como el software ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) o NIH Image ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/</a> ), ambos desarrollados en la Los Institutos Nacionales de la Salud, o ImageTool ( <a href="http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html" target="_blank">http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html</a> ), desarrollado en la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio, el área promedio (en unidades arbitrarias) de oro coloidal aprobado por 10-20 o más células (por muestra) se determina para cada grupo experimental de las imágenes capturadas. Estadísticas entonces se puede realizar en tél recogió los resultados. Por ejemplo, los resultados pueden ser graficados como media ± el error estándar de la media (SEM) con t de Student pruebas realizadas, y un valor de p &lt;0,05 se utilizan como medida de significación estadística entre las muestras. Las figuras 3 y 4 pasos muestran en la análisis de la zona de oro coloidal se aclaró por la célula. </li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+DAPK+inhibits+cell+motility+by+blocking+the+integrin-mediated+polarity+pathway.">The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway.</a> J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).</li><li>Benazeraf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+cell+motility+gradient+downstream+of+FGF+controls+elongation+of+an+amniote+embryo.">A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo.</a> Nature. 466, 248-252 (2010).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El ensayo de la motilidad phagokinetic pista presentado en este artículo es un método simple y altamente eficaz para el análisis cuantitativo de la migración celular. Debido a múltiples tipos de células pueden ser analizados 9-17, este método tiene el potencial de uso amplio en múltiples disciplinas. El uso de coloidales cubreobjetos de vidrio recubiertas de oro permite la medición de un área de la pista se aclaró por una célula en movimiento. El ensayo puede medir el efecto de diferentes estímul...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> El número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Los cubreobjetos de vidrio (15 mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-83 </td><td></td></tr><tr><td> La gelatina 300 Bloom </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-1890 </td><td></td></tr><tr><td> Trihidrato ácido tetracloroáurico </td><td> Fisher Chemical </td><td> G54-1 </td><td> 14,5 mM (una solución de trabajo final) </td></tr><tr><td> Citrato de Sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP327-500 </td><td> 0,5% (una solución de trabajo final) </td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Fisher Scientific </td><td> O4042 </td><td> 3% (una solución de trabajo final) </td></tr><tr><td> 100 mm placa de cultivo tisular </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1802 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de 12 pocillos </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-29 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de 24 pocillos </td><td> Fisher Scientific </td><td> 07-200-84 </td><td></td></tr><tr><td> Techne Horno Hybridiser HB-1D </td><td> LabPlanet </td><td> 2040500 </td><td> El horno de laboratorio estándar será suficiente </td></tr><tr><td> 10 ml Pipetas serológicas </td><td> Sarstedt </td><td> 86.1254.001 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet-Aid Filler / Dispenser </td><td> Drummond </td><td> 13-681-15 </td><td></td></tr><tr><td> P200 Manual de un canal de pipeta </td><td> Rainin </td><td> PR-200 </td><td></td></tr><tr><td> 200 ml Consejos Barrera </td><td> CLP </td><td> BT200 </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ software </td><td> <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">htt</a>p :/ / rsb.info.nih.gov / ij / </td><td></td><td> Licencia: Dominio Público </td></tr><tr><td> Nikon Eclipse TE300 con un CoolSNAPfx fotométricas monocromo de 12-bit CCD cámara </td><td> Nikon </td><td></td><td> Discontinued; La especificación más comparable tiene Nikon Eclipse Ti, pero un extremo inferior Nikon 80i será adecuado también. Otras marcas también ofrecen microscopios comparables. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Nota: Los reactivos y equipos que figuran a continuación han sido utilizados por nosotros en nuestros diversos estudios. Otros suministros, proveedores, reactivos y equipo puede utilizarse, siempre que tienen especificaciones similares. </td></tr></tbody></table>

a quantitative evaluation of cell migration by the phagokinetic track motility assay

Motilidad celular es un proceso biológico importante para ambos organismos unicelulares y multicelulares. Es esencial para el movimiento de los organismos unicelulares hacia una fuente de nutrientes o fuera de las condiciones inadecuadas, así como en organismos multicelulares para desarrollo de tejidos, la vigilancia inmunológica y la cicatrización de heridas, sólo por mencionar algunos papeles 1,2,3. La desregulación de este proceso puede conducir a graves enfermedades neurológicas, cardiovasculares e inmunológicos, así como la formación exacerbada tumor y diseminarse 4,5. Molecularmente, la polimerización de actina y reciclado del receptor se ha demostrado que desempeñan papeles importantes en la creación de extensiones celulares (lamellipodia), que impulsan el movimiento de avance de la célula 6,7,8. Sin embargo, muchas cuestiones biológicas acerca de la migración de células permanecen sin respuesta. El papel central de la motilidad celular en la salud humana y la enfermedad pone de relieve la importancia de comprender el mec específicohanisms involucrados en este proceso y hace que los métodos precisos para la evaluación de la motilidad celular particularmente importante. Microscopios se utilizan generalmente para visualizar el movimiento de las células. Sin embargo, las células se mueven más lentamente, por lo que la medición cuantitativa de la migración de células de un proceso consume recursos que requieren costosas cámaras y software para crear cuantitativos Caducada tiempo películas de células móviles. Por lo tanto, la capacidad de realizar una medición cuantitativa de la migración celular que es rentable, no laborioso, y que utiliza el equipo común de laboratorio es una gran necesidad de muchos investigadores. El ensayo de pista de la motilidad phagokinetic utiliza la capacidad de una célula en movimiento para eliminar partículas de oro de su camino para crear una pista medible sobre un cubreobjetos de vidrio revestida con oro coloidal 9,10. Con el uso de software de libre disposición, múltiples pistas pueden ser evaluadas para cada tratamiento para lograr requisitos estadísticos. El ensayo puede ser utilizado para evaluarmotilidad de muchos tipos de células, tales como células de cáncer de 11,12, fibroblastos, neutrófilos 9 13, células del músculo esquelético, queratinocitos 14 15 16, los trofoblastos, células endoteliales y monocitos 17, 10,18-22. El protocolo implica la creación de diapositivas recubierto con nanopartículas de oro (Au °) que son generados por una reducción de ácido cloroaúrico (Au 3 +) por citrato de sodio. Este método fue desarrollado por Turkevich et al. En 1951 23 y luego mejoró en los años 1970 por Frens et al. 24,25. Como resultado de esta etapa de reducción química, partículas de oro (10-20 nm de diámetro) precipitar a partir de la mezcla de reacción y se puede aplicar a cubreobjetos de vidrio, que son entonces listo para su uso en los análisis de la migración celular 9,26,27. En general, el ensayo de motilidad phagokinetic track es una medida rápida, fácil y cuantitativa de la motilidad celular. Además, sepuede ser utilizado como un simple ensayo de alto rendimiento, para uso con tipos de células que no son susceptibles de tiempo-caducada formación de imágenes, así como otros usos, dependiendo de las necesidades del investigador. En conjunto, la capacidad para medir cuantitativamente la motilidad celular de múltiples tipos de células sin la necesidad de costosos microscopios y software, junto con el uso de equipo de laboratorio común y los productos químicos, hacer el ensayo de pista de la motilidad phagokinetic una buena elección para los científicos con un interés en comprender celular motilidad.

Se muestra un ejemplo de las imágenes tomadas con un microscopio óptico que muestra un área de la pista se aclaró por una sola célula (un monocito de nuestros experimentos se muestra en la Figura 2). No móviles células crean característica pequeño óvalo, o en forma de círculo alrededor de sí mismos-tractos que indican un bajo nivel basal de circulación de estas células no estimuladas (figuras 2A y 2B). En contraste, las células muy móviles [en nuestro sistema, el citomeg...

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A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

El ensayo de motilidad phagokinetic track es un método usado para evaluar el movimiento de las células. Específicamente, el ensayo mide la quimiocinesis (motilidad celular aleatoria) en el tiempo de una manera cuantitativa. El ensayo se aprovecha de la capacidad de las células para crear una pista medible de su movimiento en coloidales de oro revestido con cubreobjetos.

Una evaluación cuantitativa de la migración celular mediante el ensayo de la canción Motilidad Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.8K vistas.  Louisiana State University Health Sciences Center. El ensayo de motilidad phagokinetic track es un método usado para evaluar el movimiento de las células. Específicamente, el ensayo mide la quimiocinesis (motilidad celular aleatoria) en el tiempo de una manera cuantitativa. El ensayo se aprovecha de la capacidad de las células para crear una pista medible de su movimiento en coloidales de oro revestido con cubreobjetos.

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Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

Evaluación cuantitativa de las células inmunes en el tejido de la médula espinal lesionada por citometría de flujo: un nuevo uso de un método de purificación celular

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Investigación

Inmunología e Infección

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

El análisis cuantitativo de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas viral y neuraminidasas el uso de anticuerpos Universal en simples ensayos Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Detección del virus infeccioso de campo recogidos por los mosquitos del ensayo cultivo celular Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

De las Migraciones células dendríticas mediante resonancia 19F / 1H Magnetic

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

In vitro Ensayo de cocultivo para evaluar la migración transepitelial de neutrófilos inducida por patógenos

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

Evaluación cuantitativa de neutrófilo humano migración a través de una vejiga cultivada Epitelio

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

De Alto Rendimiento Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayo para determinar los perfiles de expresión de los tipos I y III de interferón subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Los ensayos cualitativos y cuantitativos para la detección y caracterización de proteínas de antimicrobianos

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...