Damos las gracias a Rebecca Nishi, MS, y los técnicos del Fondo de Christopher &amp; Dana Reeve Núcleo Fundación Animal de la Universidad de California en Irvine, por su ayuda en la cirugía animal. También queremos agradecer a Gabriella Funes, Nekanti Usha y Denisse Moreno para la preparación técnica disparar asistencia, manuscrito y de vídeo y animación. Esta investigación fue apoyada por el NINDS (RO1 NS43428-01 a AJA), el Proyecto de la parálisis de América (PPA-32574 a HXN), y el Instituto de California para la Medicina Regenerativa (CIRM) de células madre Premio Formación T1-00008 a HXN. KDB fue apoyada por el programa de formación en Neurociencia Molecular y Celular en la Universidad de California Irvine (T32 NS007444).

1. La disociación de tejido de la médula espinal <ol><li> Segmentos de la médula espinal T8-T10 de no lesionados o de la médula espinal lesionada contusión (lesión en la T9) ratas Sprague Dawley fueron disecados y disociado mecánicamente con tijeras finas en HBSS a temperatura ambiente, como se describió anteriormente 1. Antes de la disociación del tejido, toda columnas de la médula espinal se mantuvieron en hielo seco durante 5 minutos antes de la extracción de segmentos de la médula T8-T10. </li><li> Trozos de tejido fueron recuperados por centrifugación (1 minuto, 1.000 rpm, a temperatura ambiente) y disociadas enzimáticamente con 2,5 mg de tripsina y 5 colagenasa mg en 5 ml de DME (Media Dulbecco modificado de Eagle) durante 20 minutos a 37 ° C antes de la trituración (~ 10 veces a temperatura ambiente) con una pipeta Pasteur de vidrio (9 pulgadas). </li><li> 10 ml de DME + 10% de suero fetal bovino se añadió a las células para inhibir las actividades enzimáticas y luego se filtró a través de un filtro de 40 micras de células. Después de una vuelta rápida, el pellet de células se resuspendió en 6 ml de HBSS y superpuestos en OptiPrep soluciones gradiente se describe a continuación. </li></ol> 2. La creación de soluciones OptiPrep gradiente <ol><li> Diluido OptiPrep fue construido mediante la dilución de OptiPrep 1:1 con tampón MOPS (0,15 M NaCl, 10 mM MOPS, pH 7,4). </li><li> Cuatro OptiPrep soluciones gradiente se hace mezclando 350, 250, 200, o 150 l OptiPrep diluido con HBSS a un volumen final de 1 ml (Tabla 1). </li><li> Las cuatro soluciones fueron lenta y cuidadosamente colocados en capas en un tubo cónico de 15 ml con la menor diluir en la parte inferior y la más diluida en la parte superior (Figura 1). </li></ol> 3. La separación de lípidos / mielina desechos de las células <ol><li> 6 ml de disociar las células de la columna vertebral en HBSS fue cuidadosamente por capas en la parte superior de las soluciones de gradiente OptiPrep. </li><li> Tubo que contiene las células y las soluciones de gradiente se centrifugó (15 min, 1900 rpm o 726 RCF, de 20 ° C) con una centrífuga Eppendorf 5810R con rotor basculante (A-4-62), la separación de la solución de células en distintas capas de lípidos / restos de mielina (parte superior del tubo de 7 ml), seguido por tres capas de neuronas, de células inflamatorias, células gliales y las células rojas de la sangre en el sedimento. Aunque la mayoría de las células inflamatorias, como monocitos, macrófagos, granulocitos polimorfonucleares y los linfocitos se encuentran en el sedimento, algunos de gran tamaño, los macrófagos activados pueden encontrarse en capas por encima de la pastilla. </li><li> La capa de restos de lípidos / mielina (principio 7 ml) se aspira cuidadosamente y se retira. Las células fueron lavadas y resuspendidas en 2,5 ml HBSS y se utiliza para inmunomarcaje a continuación. </li></ol> 4. Inmunomarcaje de células inmunitarias específicas para citometría de flujo <ol><li> Las células (500 l) recogidos de los preparativos de la médula espinal se sedimentaron y se resuspendieron en cloruro de amonio 0,85% (diluido en agua destilada) durante 5 minutos para lisar los glóbulos rojos. </li><li> Las células se lavaron con 500 l HBSS y luego bloquearon durante 30 minutos en el normal de conejo o suero del ratón a temperatura ambiente. </li><li> Las células se lavaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con anticuerpos (de conejo anti-PMN FITC, química precisa y científica; ratón anti-rata ED1 Alexa 488, Serotec, o el ratón anti-rata CD3 Alexa 488) o isotipo IgG diluido en solución HBSS (todos a la dilución 1:100), como se describió anteriormente 1. </li><li> Las células fueron lavadas dos veces después de cada paso por encima y luego resuspendido en 300 l HBSS después de la etapa final. </li></ol> 5. Evaluación cuantitativa de células por citometría de flujo <ol><li> Las muestras fueron analizadas en un citómetro de flujo FACS Calibur (Becton-Dickinson), utilizando el software Cell Quest. 5.000 eventos por muestra se lee en todas las muestras y análisis de datos se completó con la Cumbre (DakoCytomation). </li><li> Puertas de citometría de flujo se ajusta con el control de isotipo IgG células etiquetados o células de médula espinal de los animales de control no lesionados para establecer valores de referencia para la normalización a través de los puntos de tiempo como se describió anteriormente 1. Los valores medios de las células de forma positiva la etiqueta se expresaron como porcentaje (± SEM) de toda la muestra. </li></ol> 6. Los resultados representativos: La capacidad de un gradiente de OptiPrep para eliminar los restos de mielina y mejorar la detección de células inmunes por citometría de flujo se evaluó mediante la cuantificación de los PMN espinal en un dpi (fig. 1B), el pico ya se ha informado de la infiltración de PMN después de la lesión 1-3. Por otra parte, idéntica disecada la médula espinal fueron disociadas enzimáticamente sin OptiPrep-eliminación de restos de mielina y se evaluaron de manera similar en paralelo para la infiltración de PMN por citometría de flujo. Como hemos informado anteriormente 1, se produjo un cambio en la posición de los acontecimientos en las muestras aisladas con el método de purificación OptiPrep gradiente en comparación con la disociación enzimática solos, lo que demuestra el porcentaje de PMNs detectados en las muestras con restos de mielina intacta fue sólo una fracción (0,5%) del porcentaje de PMNs detectados (5,1%) en OptiPrep Purifmuestras de IED (fig. 1B). Estos datos sugieren que los restos de mielina en las preparaciones de tejidos puede ocultar las lecturas de citometría de flujo, y demostrar que la eliminación de los residuos de mielina aumenta la sensibilidad de la detección de células inmunes en el tejido de la médula espinal lesionada. Una vez establecida la sensibilidad del sistema de gradiente OptiPrep para la detección de células en la médula espinal lesionada, que caracteriza los cambios en la infiltración celular durante un período que va desde 2 horas a 180 dpi y se estableció una respuesta novedosa multifásico de la inflamación celular después de la lesión que incluyó PMNs, macrófagos / microglia y las células T. Según lo confirmado por los estudios previos 1-3, los PMN entró por primera vez el cable a las 2 horas después de la lesión y alcanzó un máximo de 1 ppp (Figura 2 y 4). Macrófagos / microglia en el otro lado 1,4,5, no se detectaron en la médula espinal lesionada hasta el 3 de dpi, y llegó inicialmente a los 7 dpi (Figura 3 y 4). Sorprendentemente, se muestra por primera vez que los macrófagos / microglia alcanzó su punto máximo en el segundo tiempo de 60 dpi y se mantuvo elevada hasta 180 dpi (Figura 3 y 4). Similares a los macrófagos / microglia, las células T infiltración se prevé que pico 7 dpi 5-7, sin embargo, la citometría de flujo no se detectaron cambios en el número de células T en los primeros 7 dpi, aunque un número elevado de células T se detectó a las 9 dpi (1,6%) (Figura 4). Mientras que las células T número estaba disminuyendo en un 10 dpi, una persistente respuesta de células T se observó a través de 180 dpi, momento en el que el 4,4% de las células fueron marcadas para CD3 (Figura 4). En conjunto, estos datos demuestran una respuesta multifásica en función del tiempo de la inflamación celular después de la lesión (Figura 4), las fases iniciales de la inflamación celular se compone de la cumbre a principios de los PMN 1 ppp seguido de un pico de ED1 + macrófagos / microglia 7 dpi y T -celdas 9 dpi, mientras que las fases posteriores se compone de las tres poblaciones celulares en aumento después de 14 dpi y persistentes a través de 180 dpi, con un pico notable segundo de los macrófagos / microglia a 60 dpi. Este estudio timecourse y los datos cuantitativos generados por citometría de flujo se han validado con anterioridad, que muestra resultados comparables a los datos obtenidos de estereología cuantitativa de immunolabeled secciones de la médula espinal 1. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698table1.jpg" alt="Tabla 1"/> Tabla 1. Preparación de gradiente OptiPrep para la eliminación de restos de mielina. Cuatro soluciones gradiente OptiPrep se realizan con HBSS y se diluye OptiPrep (1:1 dilución de OptiPrep y MOPS). <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Densidades OptiPrep gradiente más separados mielina / restos de la médula espinal lesionada tejidos / células y mejorar la evaluación de células inmunes por citometría de flujo. (A) La mielina / basura se separa de las células (neuronas, células gliales y células del sistema inmune) después de la centrifugación del tejido disociado de la médula espinal a través de un gradiente de OptiPrep seguida de aspiración de la capa de mielina / escombros. (B) PMN número en la médula espinal lesionada, que muestra una mayor sensibilidad en la detección de los PMN después de la remoción de escombros (Student t-test, p = 0,0001). Todas las puertas de citometría de flujo se ajusta con células marcadas de animales ilesos, n = 5 por grupo, con una media ± SEM. 5.000 eventos por muestra se lee en todas las muestras y los valores medios de las células de forma positiva la etiqueta se expresaron como porcentaje (± SEM) de toda la muestra. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. La detección de la infiltración de PMN en la médula espinal lesionada por citometría de flujo. Después de una contusión moderada (200 kd) en T9, PMN entró rápidamente en la médula espinal a partir de 2 horas (B) después de la lesión y en horas pico 1 ppp (C). Todas las puertas de citometría de flujo se ajusta con células marcadas de animales lesionados (A). <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Detección de los macrófagos / microglia en la infiltración de la médula espinal lesionada por citometría de flujo. Después de una contusión moderada (200 kd) en T9, ED1 + macrófagos / microglia mayor número en la médula espinal lesionada a partir de 3 dpi (D), alcanzó su punto máximo aguda a los 7 dpi (E), se redujo a niveles bajos a los 14 dpi (F) , antes de subir a un segundo pico a los 60 dpi (G), y se mantuvo en la médula espinal lesionada de hasta 180 dpi (H). IgG etiquetado de control de isotipo de las células de la columna vertebral 7 dpi (B) mostró un mínimo de anticuerpos etiquetado de fondo y no hay diferencia de las células marcadas con anticuerpos de 2 horas después de la lesión (C) o no lesionado animales (A). Todas las puertas de citometría de flujo se ajusta con células marcadas de animales ilesos. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698table2.jpg" alt="Tabla 2"/> Tabla 2. Muestras de animales en experimentos timecourse. Para cada punto del tiempo (0 horas a 180 dpi), cinco animales recibieron una moderada (200 kd) contusión en la T9,y los tejidos de médula espinal fueron evaluados por citometría de flujo para el número de PMN, macrófagos ED1 + / microglia, y CD3 + células-T. Sin embargo, no todas las muestras de los animales fueron recuperados con éxito de PMN (4-5), ED1 (3-5), y CD3 (4-5) el flujo de los análisis de citometría. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Un timecourse de la inflamación celular en la médula espinal después de una contusión moderada (200 kd) en T9. Según la evaluación realizada por citometría de flujo, el número de PMN, macrófagos ED1 + / microglia, y CD3 + células T alcanzó aguda (1,7 y 9 dpi, respectivamente) y se mantuvo de forma crónica en la médula espinal lesionada. N = 3 al 5 por grupo, la media ± SEM.

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El uso de la citometría de flujo para cuantificar las células inmunes en el SNC se ve complicada por el contenido de lípidos / mielina y los escombros. Además de interferir con la unión de los anticuerpos y la especificidad, los restos de mielina puede tener el tamaño y propiedades similares a las células inmunes de granulación, la disminución de la sensibilidad y la precisión de medición 8. La célula novedoso método de preparación se describe aquí es eficaz en la eliminación de restos de mielina y por lo tanto mejora la sensibilidad de la citometría de flujo para detectar cambios en la inflamación celular en la médula espinal lesionada. Por ejemplo, la eliminación de restos de mielina por este método de detección mejorada de células del sistema inmune frente a la disociación enzimática alone.Critically, el uso novedoso de este método permitió la primera caracterización de la inflamación celular agudo y crónico después de la lesión para incluir un curso a tiempo completo para los PMN, macrófagos / microglia y las células T de hasta 180 dpi, e identificó una fase de la segunda novela de la inflamación celular. Estos importantes hallazgos de un componente multifásica de neuroinflamación puede ser fundamental para el diseño e implementación de estrategias racionales de tratamiento terapéutico, incluyendo tanto las intervenciones basadas en células y farmacológicos para el SCI. El sistema de gradiente OptiPrep se ha utilizado para los residuos por separado a partir de células en la sangre de 9, o las neuronas del cerebro purificar para fines de cultivo de células de 10, sin embargo, se ha modificado y avanzado sistema de este método para separar los residuos de mielina de las células de la médula espinal disociada, y permitió cuantificación rápida y más precisa de la inflamación celular por citometría de flujo. Este método, junto con la citometría de flujo es probable que proporcione un avance significativo en la investigación de la inflamación después de lesiones del SNC o estados patológicos, como la mayoría de los estudios sólo han caracterizado la inflamación celular en el SNC mediante técnicas morfológicas e histológicas que no son del tipo de células específicas o no siempre puede proporcionar información verdadera evaluación cuantitativa. Además, algunos estudios recientes han intentado cuantificar las células inmunes de la médula espinal lesionada por citometría de flujo utilizando tejido fresco cable disociada 11,12 o células separadas por el gradiente de Percoll sistema de 13, sin embargo, estos estudios han demostrado tanto los rendimientos celulares de baja o insensible detección de las células inmunes. En cambio, el gradiente de OptiPrep células método de preparación ha dado por primera vez, la evaluación cuantitativa sensible y fiable mediante citometría de flujo a los cambios de la inflamación celular en respuesta a la gravedad de las lesiones clasificadas y más de un timecourse extendido hasta 180 dpi. La sensibilidad y fiabilidad de los análisis de citometría de flujo también depende de la especificidad de los anticuerpos utilizados para detectar determinados tipos de células inmunes, como la citometría de flujo no permite que los criterios morfológicos para diferenciar aún más los tipos de células. La especificidad de los anticuerpos de los PMN, macrófagos / microglia o T dice-ha sido probado a fondo en la citometría de flujo para los PMN peritoneal y macrófagos alveolares en la cultura y las células de la lesión espinal 1,2 tejido de la médula. Junto con el sistema de gradiente OptiPrep, estos anticuerpos utilizados para la citometría de flujo han contribuido a la generación de un análisis temporal y cuantitativa de la inflamación celular que ha proporcionado nueva comprensión de la dinámica del microambiente SCI, y se identificaron por primera vez una respuesta multifásica extendida de la inflamación celular. Esta respuesta multifásica de las células después de la lesión puede ser importante para investigar el papel de determinados tipos de células presentes en determinados momentos después de la lesión o generar intervenciones terapéuticas contra determinados tipos de células que pueden agravar las lesiones. Además, estos hallazgos pueden ayudar en el desarrollo de una lógica adecuada para las intervenciones óptimas de drogas o célula de base para el DME.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> OptiPrep </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9182490 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H1387 </td></tr><tr><td> Conejo anti-rata PMN (FITC) </td><td> Química exacta y científica </td><td> AIFAD51140 </td></tr><tr><td> Ratón anti-rata ED1 (Alexa Fluor 488) </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA341A488 </td></tr><tr><td> Ratón anti-rata CD3 (FITC) </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA772F </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Sigma </td><td> T9935 </td></tr><tr><td> Colagenasa </td><td> Sigma </td><td> C5138 </td></tr><tr><td> DME </td><td> Sigma </td><td> D1152 </td></tr><tr><td> IgG1 de ratón (Alexa Fluor 488) </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA1209A488 </td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> Suero de conejo </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 011-000-120011-000-120 </td></tr><tr><td> Suero de ratón </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-120 </td></tr><tr><td> Filtro celular </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry:  a novel use for a cell purification method

La detección de las células inmunes en los heridos sistema nervioso central (SNC) mediante técnicas morfológicas o histológico no siempre ha proporcionado verdadero análisis cuantitativo de la inflamación celular. La citometría de flujo es un método rápido alternativo para cuantificar las células inmunes en el cerebro lesionado o tejido de la médula espinal. Históricamente, la citometría de flujo se ha utilizado para cuantificar las células inmunes de la sangre recogida o el bazo o el timo disociada, y sólo unos pocos estudios han intentado cuantificar las células inmunes de la médula espinal lesionada por citometría de flujo utilizando tejido fresco cable disociados. Sin embargo, el tejido disociado de la médula espinal se concentra con restos de mielina que pueden confundirse con las células y reducir la fiabilidad de recuento de células obtenidas por el citómetro de flujo. Hemos avanzado un método de preparación de células con el sistema de gradiente OptiPrep que haga efectiva la separación de lípidos / mielina restos de las células, proporcionando cuantificaciones sensible y fiable de la inflamación celular en la médula espinal lesionada por citometría de flujo. Como se describe en nuestro estudio reciente (Beck &amp; Nguyen et al, Brain 2010 Feb; 133 (Pt 2):.. 433-47), la preparación de células OptiPrep había aumentado la sensibilidad para detectar la inflamación celular en la médula espinal lesionada, con un recuento de tipos específicos de células se correlaciona con la gravedad de la lesión. Fundamentalmente, el uso novedoso de este método proporcionó la primera caracterización de la inflamación celular agudo y crónico después de la lesión para incluir un curso a tiempo completo para los leucocitos polimorfonucleares (PMN, neutrófilos), los macrófagos / microglia y las células T en un período de entre 2 horas 180 días después de la lesión (ppp), la identificación de una fase de novela sorprendente segundo de la inflamación celular. Caracterización completa de la inflamación celular con este método puede proporcionar una mejor comprensión de la neuroinflamación en el SNC lesionado, y revelan un componente importante de la neuroinflamación multifásico que pueden ser críticos para el diseño e implementación de estrategias racionales de tratamiento terapéutico, tanto a base de células y farmacológicos intervenciones para el DME.

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Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

La cuantificación de la inflamación celular en el SNC lesionado / patológica por citometría de flujo se ve complicada por los residuos de lípidos / mielina que puede tener un tamaño similar y la granulación de las células, disminuyendo la sensibilidad / precisión. Hemos avanzado un método de preparación de células para eliminar los restos de mielina y mejorar la detección de células por citometría de flujo en la médula espinal lesionada.

Evaluación cuantitativa de las células inmunes en el tejido de la médula espinal lesionada por citometría de flujo: un nuevo uso de un método de purificación celular

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

quantitative-assessment-immune-cells-injured-spinal-cord-tissue-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.0K vistas.  University of California. La cuantificación de la inflamación celular en el SNC lesionado / patológica por citometría de flujo se ve complicada por los residuos de lípidos / mielina que puede tener un tamaño similar y la granulación de las células, disminuyendo la sensibilidad / precisión. Hemos avanzado un método de preparación de células para eliminar los restos de mielina y mejorar la detección de células por citometría de flujo en la médula espinal lesionada.

Video: Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required to define their phenotype and effector functions. Histochemical approaches are instrumental to determine the location of the infiltrating cells and to analyze the associated CNS pathology. However, in-situ histochemistry and immunofluorescent staining techniques are limited by the number of antibodies that can be used at a single time to characterize immune cell subtypes in a particular tissue. Therefore, histological approaches in conjunction with immune-phenotyping by flow cytometry are critical to fully characterize the composition of local CNS infiltration. This protocol is based on the separation of CNS cellular suspensions over discontinous percoll gradients. The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for identification of various immune cell populations in a single sample by flow cytometry.

The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for flow cytometric analyses.

Aislamiento de células del cerebro y la médula espinal mononucleares uso de gradientes de Percoll

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

El examen de selección tímica positivo y negativo por citometría de flujo

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

El uso de la citometría de flujo para evaluar el estado de la cromatina en las células T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...