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1. Preparación de platos ECM Cultura recubiertos o Cubreobjetos <ol><li> Preparar la solución ECM de stock de disolución de sustrato ECM en PBS (Dulbecco-buffer fosfato salino, Invitrogen, # 14040-133). Filtrar con un filtro de jeringa de 0,2 mm (VWR, # 28145-495) y congelar en alícuotas a -80 ° C. </li><li> Diluir solución ECM en PBS a la concentración deseada. Para MaxGel, diluir en DMEM (Dulbecco modificada de Eagle medio, Invitrogen, # 11995-065). </li><li> Si inmunofluorescencia se realizará, esterilizar 12 mm cubreobjetos circulares de vidrio (VWR, # 89015-724) mediante inmersión en etanol y dejar secar al aire. Esto debe hacerse en la campana laminar estéril. Si inmunofluorescencia no se llevará a cabo el paso 1.5. </li><li> Lugar esterilizado cubreobjetos en cada pocillo de una placa de pocillos 24 (Corning, n º 3526). </li><li> Añadir 0,5 ml de solución de substrato diluido a cada pocillo de la placa de 24 pocillos y se incuba a temperatura ambiente durante 3 h. </li><li> Aspirar la solución de ECM y lavar three veces en PBS. </li><li> Aspirar fuera de PBS y utilizar inmediatamente o envueltos en parafilm y se almacenaron a 4 ° C durante hasta 2 semanas. </li></ol> 2. Preparación de herramientas de disección Placas de Sylgard con carbón vegetal añadido se preparan según el protocolo del fabricante. El fondo negro resistente de estas placas proporciona soporte para la fijación abajo el embrión y el color ofrece un buen contraste que facilita la visualización del embrión translúcido. <ol><li> Para preparar las placas pesan directamente en un vaso de precipitados de tri-vierta en una balanza de 150 g de pieza en forma líquida 15 g Parte B y 1 g de polvo de carbón vegetal (World Precision Instruments, # SYLG184). Mezclar con un palito de madera o un depresor de lengua. Verter en vaso de plástico o placas de 100 cm. Utilice un soplete de butano pequeño lugar de 10 a 12 pulgadas por encima de los platos para quemar eventuales burbujas. Coloque las tapas en las placas y dejar reposar durante al menos 24 horas para ajustar. </li><li> Para preparar las herramientas de disección inserte un alfiler Minutien (0,1 mm diameter) en un soporte de pasador (Fine herramientas científicas, # 26002-10 y # 26018-17, respectivamente) como alternativa agujas de calibre 26 (BD, # 309597) dobladas en ángulo recto con la ayuda de fórceps puede utilizarse como instrumentos de disección. Afilado estudiantes Dumont # 5 Pinzas (Herramientas Artes Ciencia, # 91150-20) con una piedra de afilar (Fine Herramientas Científicas, # 29008-22). </li><li> Esterilizar todas las herramientas de disección con 70% de etanol antes de su uso. </li></ol> 3. Colección de Embriones <ol><li> Sacrificar al ratón cronometrado embarazada en 8,5 días post coito acuerdo con la normativa de animales Comité de Uso y extraer el útero. </li><li> Place útero en una placa Petri de plástico con PBS estéril. </li><li> Lavar útero una vez con PBS estéril. </li><li> Bajo un microscopio de disección cuidadosamente quitar embrión de deciduas utilizando un par de pinzas. </li><li> Retire las membranas extraembryonic y ahorrar para el genotipado de ser necesario. </li><li> Etapa embrión contando somites. Las etapas ideales para hacer explantes para analizar celular behAvior durante la elevación del pliegue neural estaría entre los 6 y 10 somite etapas cuando los pliegues neurales están comenzando a elevar y antes de la morfogénesis importante del mesénquima craneal lleva a cabo. </li><li> Lavar embrión en PBS. Colocar en un plato negro sylgard con DMEM que no contiene rojo fenol (Invitrogen, # 21,063-029). Retire las membranas extraembryonic y ahorrar para el genotipado de ser necesario. </li></ol> 4. Preparación de explantes <ol><li> Reorientar el microscopio en la magnificación más alta posible sobre la región de la cabeza del embrión. </li><li> Haga cortes con una aguja de disección en cada mano. Use una aguja para mantener el tejido en su lugar y el otro para hacer los cortes. </li><li> Cortar la cabeza del embrión anterior a los rhombomeres. </li><li> Corte a lo largo de la línea media para dividir en dos la cabeza en dos mitades iguales. </li><li> Corte alrededor de la periferia de la cabeza y la línea media. Estos recortes se eliminará la cresta premigratorias y ectodermo superficial en el borde exterior yla placa prechordal en la línea media. El tejido restante será el explante y contendrá la migración de la cresta neural craneal, mesodermo paraxial y ectodermo superficial. </li><li> A medida que el tejido se corta, eliminar los restos disecados de la cápsula, utilizando una pipeta Pasteur estéril. Esto evita confundir el explante con los restos disecados. </li><li> Lave suavemente el explante pipeteando arriba y abajo con una punta de pipeta y 20 l Pipetman. Esto eliminará las células débilmente conectados y evitar los bordes dentados en los explantes. </li><li> Recoja cuidadosamente cada explante en aproximadamente 10 l de líquido utilizando una punta de pipeta y 20 l Pipetman y el lugar en el centro de la cultura pozo cubierto. </li><li> Añadir 20 l de medio de cultivo suplementado con FBS al 15% para cubrir el explante. </li><li> Colocar la placa en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado (5% de CO 2, 37 ° C) durante 1-2 horas para permitir que el explante para insertarse en el fondo del plato. Ver periódicamente para asegurar que el explante no se sequefuera. </li><li> Cuando el explante se ha unido, añadir con cuidado a cada pocillo 250 l de DMEM suplementado con FBS al 10% que ha sido calentado a 37 ° C en un baño de agua. Una vez que haya adjuntado explantes que no se muevan cuando la placa se agita suavemente bajo el microscopio. </li><li> Volver plato de cultivo de tejidos incubadora. </li><li> Después de 24 horas, los explantes se estarán sólidamente sujetos y las células comienzan a emigrar. En este momento los agentes farmacológicos se pueden añadir a los medios de comunicación. </li><li> 48 h después de la siembra, las células han emigrado de los explantes. La distancia migrada puede ser visualizado y formado la imagen. Por lo general detener la cultura en este punto ya explantes comienzan a mostrar signos de disminución de la viabilidad a largo incubaciones. Un colorante vital tal como naranja de acridina o azul de tripano también se puede utilizar para comprobar la viabilidad de los explantes. </li><li> En este punto, las imágenes pueden ser adquiridas para documentar la distancia y el número de células que migran desde el explante. Alternativamente, si explantes se sembraron en cubreobjetos,que puede ser fijo y los análisis inmunohistoquímicos realiza para visualizar las proteínas de interés. </li></ol> Los pasos críticos en el protocolo <ol><li> Cortar explantes de aproximadamente el mismo tamaño. </li><li> Borrar todos los residuos disección de la placa de disección como está disección para evitar escombros confuso con el tejido deseado explantado. </li><li> Cuando explantes enchapado en pozos o en cubreobjetos asegúrese de colocar las gotas de los medios de comunicación con explante en el centro del pozo. </li><li> Permitir explantar tiempo suficiente para fijar antes de inundar el bien con los medios de comunicación. </li><li> Condiciones de tratamiento deben ser estandarizados para cada sustrato de ensayo y el agente farmacológico utilizado. </li><li> Dos explantes se pueden hacer de cada embrión (uno de la izquierda y uno de la derecha del tubo neural). </li><li> Cuando evaluar la migración de células de líneas de ratones mutantes en diferentes condiciones experimentales, poner un explante mutante en el grupo de control y el otro en el grupo tratado. </li></ol> Solución de problemas <ol><li> Si explantes no adjuntar, aumentar el tiempo asignado para su fijación. En nuestra experiencia, aproximadamente la mitad de los explantes no dan grandes explantes y se adhieren de manera más eficiente. </li><li> Si explantes se adhieren a la periferia del bien que va a ser difícil de imagen. Asegúrese de colocar los explantes en el centro del pozo. </li><li> Idealmente explantes será de aproximadamente el mismo tamaño. Sin embargo, las diferencias en tamaño del explante se puede corregir para usar el diámetro de los explantes como un factor de corrección cuando quanitating migraciones de células de explantes. </li><li> Si se produce contaminación estar seguro estériles condiciones de trabajo están siendo utilizados. Todas las herramientas y superficies de trabajo deben ser esterilizados con 70% de etanol. Pipetas y placas de Petri debe ser nuevo y estéril. </li><li> Si explantes se están perdiendo durante la disección, periódicamente remueven escombros para evitar la pérdida de explante. </li><li> El dominio de la disección es mucho tiempo y requiere práctica. Optimal de aumento, herramientas disección cortante y ayuda agujas. </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

El método aplicado aquí proporciona un ensayo de gran alcance para examinar el comportamiento de células mesenquimales craneales. Además de los análisis estáticos presentados aquí, vivir experimentos de imagen en campo claro o en combinación con la expresión de proteínas GFP-etiquetados pueden emplearse para examinar el comportamiento de las células en tiempo real a medida que migran desde el explante. Para los experimentos de imagen en vivo, los explantes pueden ser etiquetados con Dil o para diferenciar la migración de la cresta neural del mesodermo paraxial, ROSA-YFP; Mesp1-cre o YFP-ROSA; Wnt1 cre-o de otras líneas transgénicas podrían utilizarse. Craneales ECM mesénquima-interacciones también pueden ser examinados utilizando este ensayo de explante. Aquí explantes de placas en sustratos de ECM diferentes que están presentes en el mesénquima craneal para demostrar que las células migran sobre estos en diferentes grados y que el ECM influye en la morfología de las células. Además, los explantes pueden ser embebidos en una matriz tridimensional para acceder a los comportamientos de cells en este contexto. Este ensayo de explante es modificable para el análisis del efecto de las manipulaciones genéticas y farmacológica sobre comportamientos mesénquima craneales para analizar señales intrínsecos y extrínsecos que pueden regular y modificar la migración. Por ejemplo, se utilizó este ensayo en nuestros estudios para discernir la función del exceso de secreción de Hsp90 en los comportamientos celulares anormales en Hectd1 mesénquima mutante craneal 15. En estos experimentos, se trataron explantes con anticuerpo anti-Hsp90, Hsp90 proteínas, geldanamicina y DMA (amelioride dimetil) para bloquear la secreción de Hsp90 para demostrar que el comportamiento anormal de células mutantes Hectd1 es debido al exceso de Hsp90 extracelular 15. Enfoques similares se podrían utilizar para diseccionar farmacológicamente vías adicionales que subyacen a la morfogénesis normal o anormal del mesénquima craneal. Una vez que el ensayo se haya completado, los explantes y células migratorias pueden ser analizadas por una serie de métodos. Por ejemplo, los análisis inmunohistoquímico cun ser empleados para examinar la localización de proteínas críticas para los movimientos celulares. Transcriptome análisis también podría ser empleado para determinar cómo los tratamientos afectan la expresión génica. Una limitación importante de esta técnica es que no hace comportamientos del modelo en tres dimensiones, ya que se producirían in vivo. Modificación del protocolo donde explantes se incrustan en una matriz de tres dimensiones (por ejemplo, Matrigel) junto con la expresión de proteínas fluorescentes marcados-compartimentos celulares podrían ser empleados necesario para abordar esta cuestión. Incluso si estas modificaciones se llevaron a cabo, más experimentos para correlacionar comportamientos observados en este ensayo ex vivo con aquellos in vivo sería necesario. Otras limitaciones incluyen el gran número de embriones necesarios para generar un número suficiente para generar datos estadísticamente significativas. Lo más importante, la disección es relativamente simple, requiere práctica para dominar.

Cierre del tubo neural en la región craneal se produce entre 8,5 días de embriones (E8.5) y 9,5 en el embrión de ratón. Si no se cierra correctamente el tubo neural en los resultados de la cabeza en la anencefalia, un defecto de nacimiento común estructural en los seres humanos y es incompatible con la vida. Las fuerzas que impulsan cierre del tubo neural cefálica se generan a partir tanto del tejido neural en sí y la epidermis que rodea y mesénquima 3. En particular, la expansión del mesénquima craneal se piensa que es esencial para la elevación del 1,2 craneal pliegues neurales. El mesénquima craneal es rica en proteínas de ECM en particular, proteínas glicosiladas, tales como proteoglicanos de sulfato de heparina, sulfatos de condroitina y 4-8 hialuronato. A diferencia en el embrión de pollo en donde las células de la cresta neural emigran desde el tubo neural dorsal tras el cierre del tubo neural, de la cresta neural en el embrión de ratón migra al mismo tiempo que los pliegues neurales comienzan a rISE (después de la etapa de somite 5). Así, durante la neurulación en el embrión de ratón, el mesénquima craneal está compuesto de células derivadas de la cresta neural y el mesodermo paraxial. La cresta neural y el mesodermo paraxial poblaciones son inducidos en diferentes momentos en el desarrollo; localizados en posiciones diferentes en el embrión y se desarrollan en diferentes estructuras de 9,10. El mesodermo paraxial se origina a partir de la línea primitiva y migra a la región anterior del embrión que la base de la placa neural presuntiva. La cresta neural es inducida en la unión de la placa neural y ectodermo epidérmico, sufre un epitelial a mesénquima y deslamina justo antes de la elevación del pliegue neural en el embrión de roedor. Las células de la cresta neural migran a lo largo de los caminos estereotipados en el mesodermo paraxial subectodermal al arco branquial, frontonasal y el mesénquima periocular. El mesodermo paraxial contribuirá a algunos de los huesos de la bóveda del cráneo y los músculos de la cara, mientras que the cresta neural contribuirá a otros huesos del cráneo y de la cara, además de los nervios craneales 9-11. El mesodermo paraxial y linajes de la cresta neural puede ser diferente marcado por la Mesp1-cre y cre-Wnt1 líneas de ratones transgénicos, respectivamente 9. El papel esencial del mesénquima craneal en el cierre del tubo neural se ha deducido a partir de experimentos en los que el tratamiento de los embriones de roedores con ECM interrumpir agentes tales como hialuronidasa, condroitinasa ABC, heparitinasa o Diazo-oxo norleucina-(DON) durante neurulación afectada cierre del tubo neural 7, 12-14. En estos experimentos, el análisis histológico de secciones estáticas siguientes neurulación reveló dysmorphogeneis asociados de la craneal mesénquima 7,12-14. Sin embargo, puesto que el agente teratógeno tenían acceso a múltiples tejidos, lo que queda por determinar si el mesénquima craneal es realmente el tejido diana. En apoyo a la conclusión de que este tejidoes esencial para el tubo neural, el mesénquima craneal parece anormal en los análisis histológicos en algunos mutantes de ratón con exencefalia 15-17. Sin embargo, en la mayoría de los casos, el efecto de la mutación sobre el comportamiento celular de la mesénquima craneal no se ha abordado. Hemos ideado un ensayo in vivo explante ex para examinar directamente la consecuencia de la mutación genética o manipulación farmacológica sobre el comportamiento de células mesenquimales craneal 15. Este ensayo es similar a la publicada por Tzahor et al 2003 para acceder al potencial de diferenciación del mesénquima craneal que subyace a los 18 rhombomeres excepto hemos modificado la disección explante para estudiar las propiedades migratorias de las poblaciones más anteriores del mesénquima craneal que subyacen a la anterior neural plato. Nuestro método es también una modificación de las pruebas de explantes a cabo en el embrión de pollo para analizar el comportamiento migratorio de la cresta neural con keY las diferencias. Preparativos previos han extirpado la cresta neural o el mesodermo paraxial más posterior 19,20. Además, durante la elevación neural veces en el embrión de pollo, la cresta neural aún no ha emigrado desde el tubo neural dorsal y por lo tanto explantes tomados de la mesodermo paraxial anterior no contienen células de la cresta neural. En nuestro ensayo, los explantes craneales mesénquima que consisten de mesodermo paraxial, la cresta neural y ectodermo superficial se preparan y se sembraron sobre un sustrato. La manipulación experimental incluyendo el aislamiento de explantes procedentes de mutantes genéticos, enchapado explantes sobre ECM diferente o tratamientos farmacológicos se puede realizar. Las células migran desde el explante y la distancia, el número y el comportamiento puede ser analizado y comparado entre los grupos de tratamiento. Además, esta preparación es modificable para análisis de la migración celular mediante técnicas de imagen en vivo. Después del experimento de migración, los explantes pueden ser fijadas y sometidas a análisis inmunohistoquímico para pielesther dilucidar el efecto de los tratamientos. En general, el protocolo presentado aquí es un ensayo ex vivo sencillo para investigar el comportamiento del mesénquima craneal. Como un experimento representativo, utilizamos este ensayo para examinar la migración de mesénquima craneal en diferentes sustratos extracelulares.

an explant assay for assessing cellular behavior of the cranial mesenchyme

El sistema nervioso central se deriva de la placa neural que sufre una serie de movimientos morfogenéticos complejos resultantes en la formación del tubo neural en un proceso conocido como neurulación. Durante tubo neural, la morfogénesis del mesénquima que subyace en la placa neural se cree para conducir elevación pliegue neural. El mesénquima craneal está compuesto por el mesodermo paraxial y las células de la cresta neural. Las células del mesénquima craneal forma una malla pourous compuesto de células con forma de estrelladas y mezcla de la matriz extracelular (ECM) hebras que soportan los pliegues neurales. Durante la neurulación, el mesénquima craneal experimenta reordenamientos estereotipadas resultantes en su expansión y estos movimientos se cree que proporcionan una fuerza impulsora para la elevación pliegue neural. Sin embargo, las vías y los comportamientos celulares que conducen a la morfogénesis mesénquima craneal siguen siendo poco estudiada. Las interacciones entre el ECM y las células de los craneales thes subyacen mesénquimacomportamientos e celulares. Aquí se describe un ensayo ex vivo sencillo explante ideado para caracterizar el comportamiento de estas células. Este ensayo es modificable a manipulaciones farmacológicas para diseccionar la vías de señalización implicadas en vivo y análisis de imágenes para caracterizar mejor el comportamiento de estas células. Se presenta un experimento representativo que demuestra la utilidad de este ensayo en la caracterización de las propiedades migratorias de la mesenchyme craneal en una variedad de componentes de ECM.

La aparición de células que migran a partir de explantes mesénquima craneales se muestra en la Figura 2. Hemos probado la migración sobre sustratos de ECM distintos que están presentes en el mesénquima craneal durante neurulación incluyendo fibronectina (100 mg / ml, Sigma # F1141), laminina (100 mg / ml, Sigma # L2020), ECM MaxGel (1:500 dilución en DMEM , Sigma # E0282) y ácido hialurónico (1 mg / ml, Sigma, # 53747). Las células no migran desde el explante cuando no está presente ECM (datos no mostrados) y todos los sustratos probados migración de las células de apoyo. Tanto la forma, así como los tamaños de las células que migran desde los explantes depende del sustrato. Esto se espera que los estudios anteriores demuestran que las fuerzas mecánicas generadas por la interacción de las células con ECM diferente afectar tanto a la forma y las propiedades migratorias de las células 21. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig1.jpg" fo:content-width = &quot;5.5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4245/4245fig1highres.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Preparación de explantes. (A) Preparar explantes, E8.5 embriones disecados de deciduas y tejidos extraembryonic. (B) los jefes de embriones se disecan de la parte anterior del cuerpo de los rhombomeres. Los explantes se preparan mediante la eliminación de tejido de la línea media y los bordes exteriores de la cabeza para eliminar la placa precordal en la línea media y la cresta neural y el ectodermo premigratorias superficie en la frontera, respectivamente. (C) Los explantes se prepararon cortando el tejido de los bordes de la línea media y exterior de la cabeza para eliminar la placa precordal en la línea media y la cresta neural y el ectodermo premigratorias superficie en las fronteras. (D) Los explantes se colocan en un pequeño volumen de medios de comunicación en platos recubiertos de ECM / cubreobjetos y se dejan adherir antes de la adición de más medios de comunicación. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig2.jpg" /> Figura 2. Los explantes de migración de células mesenquimales craneales de explantes chapada en diferentes sustratos. Se sembraron en fibronectina, laminina, ECM MaxGel o ácido hialurónico y se fotografiaron después de 48 h en cultivo. Tamaño bar = 200 mm.

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An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

El mesénquima craneal experimenta movimientos dramáticos morfogénicas probable que proporciona una fuerza motriz para la elevación de los pliegues neurales<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Aquí se describe un sencillo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Explantar ensayo para caracterizar los comportamientos celulares de la mesenchyme craneal durante neurulación. Este ensayo tiene numerosas aplicaciones, incluyendo ser susceptible de manipulaciones farmacológicas y análisis de imágenes en directo.

Un ensayo de explante para evaluar el comportamiento celular del mesénquima craneal

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.7K vistas.  Children's National Medical Center. El mesénquima craneal experimenta movimientos dramáticos morfogénicas probable que proporciona una fuerza motriz para la elevación de los pliegues neurales 1,2. Aquí se describe un sencillo Ex vivo Explantar ensayo para caracterizar los comportamientos celulares de la mesenchyme craneal durante neurulación. Este ensayo tiene numerosas aplicaciones, incluyendo ser susceptible de manipulaciones farmacológicas y análisis de imágenes e...

Video: An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositivo de microfluidos con los patrones de Surco para el estudio del comportamiento celular

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Investigación

Biología

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

La toxicidad celular de Nanogenomedicine en la línea celular MCF-7: ensayo de MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical research. The hypoxic chamber offers a simple system to control oxygenation in standard culture vessels, but lacks precise temporal and spatial control over the oxygen concentration at the cell surface, preventing its application in studying a variety of physiological phenomena. Other systems have improved upon the hypoxic chamber, but require specialized knowledge and equipment for their operation, making them intimidating for the average researcher. A microfabricated insert for multiwell plates has been developed to more effectively control the temporal and spatial oxygen concentration to better model physiological phenomena found in vivo. The platform consists of a polydimethylsiloxane insert that nests into a standard multiwell plate and serves as a passive microfluidic gas network with a gas-permeable membrane aimed to modulate oxygen delivery to adherent cells. The device is simple to use and is connected to gas cylinders that provide the pressure to introduce the desired oxygen concentration into the platform. Fabrication involves a combination of standard SU-8 photolithography, replica molding, and defined PDMS spinning on a silicon wafer. The components of the device are bonded after surface treatment using a hand-held plasma system. Validation is accomplished with a planar fluorescent oxygen sensor. Equilibration time is on the order of minutes and a wide variety of oxygen profiles can be attained based on the device design, such as the cyclic profile achieved in this study, and even oxygen gradients to mimic those found in vivo. The device can be sterilized for cell culture using common methods without loss of function. The device's applicability to studying the in vitro wound healing response will be demonstrated.

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Fabrication and validation of an add-on platform that offers enhanced control over the spatial and temporal oxygenation in a 6-well plate. The device is adaptable to a number of culture systems and can be used to investigate the effects of oxygen on wound healing.

Fabricación y operación de una inserción de oxígeno para Adherente cultivos celulares

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Ensayo clonigénicas: las células adherentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Electroporación de mesénquima craneofacial

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Una herramienta de análisis que cuantifica los cambios celulares Morfología de imágenes tridimensionales de fluorescencia

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

Viva Imaging Ensayo para la evaluación de los Roles de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y esfingomielinasa en la reparación de los poros de la formación de toxina Heridas

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Medición de los efectos de las bacterias en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamiento El uso de un ensayo de retención de huevo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

Ensayo Desafiador durotaxis de una sola célula para evaluar el control mecánico del movimiento celular y los eventos de señalización relacionados

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Evaluación de la capacidad fagocítica específica por edad de los hemocitos de Drosophila melanogaster adultos utilizando un ensayo de fagocitosia In Vivo

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...