Hay una creciente apreciación por el impacto del microambiente mecánico en la señalización celular y la migración. Necesidad del uso de enfoques únicos y experimentales para proporcionar estimulación mecánica a células individuales. Esta técnica permite la manipulación dinámica del microambiente mecánico debajo de una célula en tiempo real.
Permitir la observación de cambios regulados mecánicamente en el comportamiento de migración celular y eventos de señalización subcelular. Demostrando el procedimiento conmigo estarán Nyla Naim, una post-doc y Johnathan Patterson, una técnica de nuestro laboratorio. Comience usando un Chorono-1 para activar la superficie de vidrio de cada resbalón de cubierta inferior durante 20 segundos, antes de colocar inmediatamente 50 microlitros de solución de trabajo de silano de unión en cada resbalón de cubierta.
Dejar secar la solución durante 10 minutos antes de enjuagar los resbalones de la cubierta dos veces con 95%etanol y dos veces con isopropanol. Luego, deje que los resbalones de la cubierta se sequen al aire durante aproximadamente 20 minutos. Para la deposición fluorescente de micro-perlas, primero sonicar la solución de micro-perlas de trabajo durante una hora.
15 minutos antes del final de la sonicación, coloque los resbalones de la cubierta activada verticalmente en un soporte antideslizante de cubierta de cerámica y transfiera el soporte a un limpiador de plasma de mesa para el tratamiento de plasma de habitación-aire durante tres minutos. A continuación, coloque piezas de película de parafina en tapas de 60 mililitros Petri, y coloque los resbalones de la cubierta en las películas, tocando ligeramente cada resbalón de cubierta para asegurar un buen contacto entre la película y el cubreobjetos. A continuación, añadir 150 microlitros de la solución de perlas de trabajo a la parte superior de cada tapa, y aspirar inmediatamente la solución de etanol desde el lado de los cubreobjetos, dejando las perlas en el cubreobjetos.
Para lanzar los Hidrogeles inmediatamente después de su preparación, agregue una gota de 25 microlitros de solución de Hydrogel al lado activado de cada cubreobjetos inferior, e inmediatamente voltee los cubreobjetos superiores con cuentas, del lado del cordón hacia abajo, en la gota. Deje que los geles se polimericen durante 30 minutos antes de usar fórceps para retirar suavemente los cubreobjetos. A continuación, enjuague los geles con lavados de tres, cinco minutos en hepes frescos de 50 miliMoler por lavado.
Para activar las superficies de Hydrogels, incubar los geles en hepes frescos de 50 miliMoler, complementados con 0,4 miliMolar Sulfo Sanpah, e inmediatamente exponer los geles a una lámpara de arco ultravioleta en un área cerrada durante 90 segundos. Al final de la activación, lavar los geles con tres, cinco minutos lavados en Hepes frescos, y tratar los Hidrogeles activados con 20 microgramos por mililitro de fibronectina durante una hora a 37 grados Celsius. Al final de la incubación, aspirar el exceso de solución de fibronectina y lavar los geles tres veces en PBS durante cinco minutos por lavado.
Después del último lavado, coloque los Hidrogeles en un pequeño volumen de PBS y esterilizar los geles durante 15 minutos bajo luz ultravioleta en una capucha de cultivo de tejido. Luego, lave los geles una vez en PBS fresco. Para el revestimiento celular, siembra 2.1 por 10 las cuatro células de interés en tres mililitros de medio por Hidrogel y permite que las células se adhieran a 37 grados Celsius durante cuatro a 18 horas.
Mientras las células se equilibran, utilice un tirador de microtu pipetas para tirar de un diámetro de un milímetro por microtubo de vidrio borosilicato de 100 milímetros de largo, para obtener un cónico de más de dos milímetros que se reduce a aproximadamente 50 micrómetros de diámetro en el primer milímetro, y se extiende a un tubo largo y paralelo de 10 micrómetros de diámetro en el último milímetro. A continuación, cargue la pipeta en un microforge y dé forma a la pipeta para tener una punta contundente de 15 micrómetros que se encierra al final de una sección de 250 micrómetros, doblada a aproximadamente 35 grados de ángel del resto de la pipeta. El diámetro aproximado en la curva debe ser de alrededor de 30 micrómetros para prestar fuerza a la punta.
A continuación, coloque un Hidrogel en la etapa de un microscopio invertido. Cubra el medio con aceite mineral y seleccione el objetivo 10x. Esterilice la microtu pipeta preparada con el 70% de alcohol.
A continuación, inserte en el soporte de la microtumeta con el gancho apuntando hacia el plato, y utilice el manipulador del curso para bajar la pipeta hasta que el gancho toque la superficie del líquido. Enfoque el microscopio en las células adheridas a la parte superior del gel, y teniendo cuidado de que el objetivo no esté en peligro de golpear la muestra o etapa, lleve el foco por encima del gel para encontrar la punta de la micro-pipeta. Gire la pipeta hasta que la punta sea perpendicular al plano focal, de modo que la punta contundente de la microtumeta apunte hacia abajo, y vuelva a enfocar en la punta de la pipeta según sea necesario.
Concéntrese hacia abajo hasta la capa celular para medir qué tan lejos está la pipeta de la superficie del gel, y enfóquelse de nuevo hasta un plano que esté a parte entre el gel y la punta de la pipeta. A continuación, baje lentamente la pipeta para llegar al plano focal intermedio, y aumente el aumento a lo que se utilizará en el experimento, antes de bajar la pipeta hasta que se cierne justo por encima de la superficie del Hidrogel. Para la calibración del micromanipulador, imagine un área desprovista de células, un área con cuentas, pero sin manipulación, con la pipeta enganchando el gel, y con la pipeta comprometida tirando del gel.
A continuación, utilice la imagen J para comparar los campos sin cordón con los campos de cuentas sin compromiso, los campos de cuentas con el gel activado y el gel tirado para calcular los desplazamientos relativos del cordón y la fuerza aplicada a los geles. Para llevar a cabo un ensayo de durotaxis, monitoree un grupo de células durante 30 minutos para identificar las células que se mueven de manera dirigida. Seleccione una celda que se esté moviendo constantemente en una dirección y supervise las celdas de la velocidad de fotogramas deseada durante 30 minutos adicionales.
A continuación, coloque la pipeta unos 50 micrómetros delante del lado cercano del borde delantero de la celda seleccionada y mueva el micromantelidor de manera que el gel se deforme ortogonalmente a la dirección de desplazamiento de la célula. Luego, observe la célula con el tiempo mientras responde al gradiente local agudo de rigidez de Hidrogel. Usando esta técnica como se ha demostrado, los fibroblastos embrionarios de rata se mueven hacia el aumento de la rigidez en los gradientes aplicados por una microtu pipeta de vidrio.
Las células fibroblastas embrionarias de rata, que expresan transitoriamente el sensor de tensión de vinculina en geles de poliacrilamida kilopascale de 125 kilopascales, también demuestran la formación de adherencias focales en las direcciones del estiramiento durante un período de 40 minutos. El análisis de la transferencia de energía de resonancia de Forster revela que la vinculina localizada en las adhesiones focales experimenta un cambio inmediato en la tensión, cuando se presenta con una estimulación durtáctica aguda. Ampliar la utilidad de este ensayo a la observación de eventos de señalización subcelular, en respuesta a la estimulación durtáctica.
Si realiza varios intentos de estirar una celda, o si la microapropiela se desliza durante el ensayo, comience de nuevo con una nueva célula para evitar impartir múltiples estímulos mecánicos variables. Más allá de su utilidad para el ensayo de durataxis, esta técnica se puede combinar con enfoques genéticos, como biosensores, RNAI, o edición de genes para ayudar a delinear los mecanismos moleculares involucrados en la mecanotransducción.
