Los autores desean agradecer a Jeanette Schermuly para la preparación recombinante de ARN polimerasa T7 y Ebelt Norman para la asistencia en la preparación de la figura 1. Este trabajo fue financiado con fondos de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) y la Sociedad Max Planck.

1. Generación de tiempo pre-crRNA sustratos a través de PCR <ol><li> Diseño de PCR primers dirigidos a las regiones espaciadoras de un clúster CRISPR. Añadir la ARN polimerasa T7 (T7RNAP) promotor de la secuencia (5 &#39;-taatacgactcactata-3&#39;) para el cebador directo y sitios de restricción para la clonación del producto de PCR en un vector para ambos cebadores (por ejemplo, BamHI y Hind III para pUC19, fig. 2A) . Nota: El T7RNAP requiere un residuo de guanidina para la iniciación apropiada de la transcripción. </li><li> Amplíe su pre-crRNA secuencia de interés a partir de ADN genómico por PCR. </li><li> Separar los productos de PCR por electroforesis en gel de agarosa y gel de extraer la banda deseada. Se digiere el producto de PCR con las enzimas de restricción para crear extremos pegajosos (por ejemplo, BamHI y HindIII, fig. 2A). Se purifica el producto de PCR con un kit de purificación de PCR para eliminar la escisión de los subproductos. </li><li> Configurar una reacción de ligación que contiene ADN ligasa de T4, tampón de T4 ADN ligasa yuna relación molar 3:1 de la exfoliados producto de la PCR y el vector desfosforilado lineal pUC con los correspondientes extremos cohesivos. Incubar la mezcla a 16 ° C durante la noche. Transformar la mezcla de ligación en células competentes de Escherichia coli DH5a por protocolos estándar y analizan el blanco en azul para identificar la ligadura exitosa. </li><li> Aislar los plásmidos de las colonias de blancos usando un kit de preparación de plásmido. Identificar los clones positivos por secuenciación del plásmido. Alternativamente, la PCR de colonias podría ser utilizada para el cribado. </li></ol> 2. Generación del intermedio pre-crRNA sustratos a través de la hibridación de oligonucleótidos de ADN <ol><li> Diseño de avance y retroceso oligonucleótidos con el CRISPR deseado repetir / espaciador secuencia. Los oligonucleótidos contienen la secuencia de un promotor T7 RNAP, así como sitios de restricción terminales (por ejemplo, BamHI y Hind III para pUC19). Terminar los oligonucleótidos para garantizar que forma extremos pegajosos después de recocido (véase la fig. 2B </strong&gt;). </li><li> 5&#39;-fosforilan 1 nmol de cada oligonucleótido en una reacción separada 20μl que contiene 5 l de T4 polinucleótido quinasa (PNK), 2 l de tampón T4 PNK 10x, 2 l ATP (10 mM). Incubar cada muestra durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Hibridar los dos oligonucleótidos fosforilados. Combinar 1μl de la mezcla de oligo fosforilados hacia adelante (de 2,2.), 1 l de la mezcla de oligo inverso fosforilado (de 2,2.), 1 l de tampón de T4 ADN ligasa 10x en una reacción de 10 l. Se incuban las muestras durante 5 min a 95 ° C en un bloque de calentamiento o en agua hirviendo, apague la fuente de calor y dejar que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente (~ 2-3 horas). Nota: En este paso crítico, el proceso de enfriamiento lento favorece la hibridación de los dos oligonucleótidos en comparación con la formación de estructuras dentro de cada oligonucleótido único. </li><li> Ligar 4 l de la mezcla de hibridación, 1μl de digerido y desfosforilado vector pUC (0,1 g /l) con ADN ligasa de T4, tampón de T4 ADN ligasa 10x y 10 mM ATP en una mezcla de ligación 20 l. Incubar la muestra a 16 ° C durante la noche. </li><li> Transformar los plásmidos ligados a células competentes de Escherichia coli DH5a de protocolos estándar y utilizar cribado blanco azul. Aislar plásmidos y identificar los clones positivos por digestión (para cribar para insertos del tamaño deseado) y la secuenciación del plásmido posterior. </li></ol> 3. Generación de corto sustratos Cas ARN a través de la síntesis de encargo oligonucleótido de ARN Diseño corto Cas ARN sustratos (por ejemplo, repetir secuencias individuales, fig. 2C) y utilizar las instalaciones personalizadas de síntesis de oligonucleótidos de ARN. Nota: La inclusión de un desoxirribonucleótido en una posición especificada de un oligonucleótido de ARN (Fig. 2C) se puede utilizar para identificar el sitio de escisión del ARN. 4. In vitro T7 RNA polimerasa de transcripción <ol><li> Aislar los plásmidos con el constructo diseñado (de 1,9. 2,7 o.) Utilizando un kit de purificación de plásmido maxiprep. </li><li> Linealizar el plásmido con la enzima de restricción que corta aguas abajo del fragmento clonado (por ejemplo, HindIII). Asegurar la digestión completa. Nota: Si un divergente 3 define &#39;terminal del transcrito de ARN se desea, el constructo diseñado debe contener un sitio adicional de restricción específica para &quot;run-off&quot; transcripción aguas arriba de la secuencia HindIII. </li><li> Se purificó el plásmido linealizado mediante extracción con fenol: cloroformo extracción (1:1) y precipitación con etanol. Recuperar los ácidos nucleicos mediante resuspensión del sedimento en DEPC estéril agua tratada. </li><li> Crear una in vitro T7 RNAP correr mezcla de transcripción que contiene 40 mM Hepes / KOH (pH 8), 22 mM de MgCl 2, ditiotreitol 5 mM, espermidina 1 mM, 4 mM de cada trifosfato de nucleósido (ATP, CTP, GTP, UTP ), 40-100 g / ml de digeridoplásmido y 0,1 mg / ml T7 RNAP en agua tratada con DEPC. Incubar durante 3 horas a 37 ° C. </li><li> Analizar los transcritos de ARN obtenidos en un gel desnaturalizante de poliacrilamida urea 8 M 12% (Fig. 3A). Las transcripciones de ARN se puede purificar a través de Mono Q cromatografía de intercambio aniónico 13 y se recupera por precipitación con etanol de las fracciones de ARN y la resuspensión del sedimento en agua estéril tratada con DEPC. Para uso futuro, almacenar el ARN a -80 ° C. </li></ol> 5. CAS6 endonucleasa de ensayo <ol><li> Establecer un 20 l in vitro T7 RNAP correr mezcla de transcripción (ver 4,4) que contiene una cantidad reducida de 2 mM ATP y se complementa con 2,5 l α-[32 P]-ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Purificar los productos de reacción a través de la extracción de gel a partir de una desnaturalización del 8 M urea gel de poliacrilamida al 12%. Visualice bandas por autorradiografía. </li><li> Producir y purificar las proteínas recombinantes deseados Cas. En este ejemplo, CAS6 de Clostridium thermocellum se purificó por medio de calor precipitación y cromatografía de Ni-NTA. </li><li> Establecer un ensayo de reacción de endonucleasa (por ejemplo, para Clostridium thermocellum CAS6, la mezcla de reacción contiene 20 mM Hepes (KOH pH 8), 250 mM KCl, 2 mM de MgCl 2, 1 mM DTT, 12.000 cpm de ARN sustrato y enzima 1 mM y se incubó a 37 ° C durante 30 min). </li><li> Cargar 5 l de la mezcla de reacción (+ 10 l tampón de carga de ARN que contiene 95% de formamida) en un gel de urea 8 M de poliacrilamida al 12%. Visualice los productos de degradación después de electroforesis por autorradiografía. </li></ol> 6. Los resultados representativos Un ejemplo de sustratos de ARN para el análisis de la actividad endonucleasa de Cas se muestra en la Figura 3A. Una parte alícuota de 5 l de un sistema analítico de 100 l en la reacción de transcripción in vitro fueron cargados. Tenga en cuenta que la eficiencia de la producción de ARN varía entre diferentes construcciones. Algunos factores de tsombrero se observaron para influir en la cantidad de ARN obtenidos son (i) la secuencia inicial que sigue a la G +1 requiere para iniciar la transcripción, (ii) la posibilidad de la formación de la estructura del ARN durante la transcripción y (iii) la elección del sitio de restricción para la generación de la posición de escisión segunda vuelta. La investigación de la actividad endonucleasa de ARN requiere tanto de proteínas altamente purificada recombinante Cas (Fig. 3B) y adecuados controles negativos. Idealmente, esta muestra de control negativo difiere tan poco como sea posible a partir de la reacción de endonucleasa investigado Cas. Esto puede lograrse mediante la incubación del ARN con tampón de reacción y de lisado celular sin Cas-expresión (y siguiendo el procedimiento de purificación idénticas). Un control negativo ideal es la adición de un desoxirribonucleótido en el sitio de corte propuesto. En la Figura 3C, la escisión de una secuencia de repetición 5 &#39;terminal con la etiqueta se muestra por Clostridium thermocellum CAS6. Bajo<html> idénticas condiciones, esta repetición no es un sustrato más cuando un desoxirribonucleótido se introduce en la posición -9. Este método también proporciona información sobre el sitio de escisión. Finalmente, un tiempo marcado internamente pre-crRNA se escinde por CAS6 y dos fragmentos de escisión se observan. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema general de CRISPR / Cas actividad. La descripción general siguiente de la inserción de una secuencia de ADN viral (protospacer) en el clúster CRISPR (adaptación), la transcripción y el procesamiento de la matriz de CRISPR en crRNAs pequeños por una endonucleasa de CAS6, la absorción de crRNAs en el complejo de Cascade y la interferencia de un repetido ataque viral basado en la complementariedad entre crRNA y protospacer. Protospacer adyacentes motivos (PAM) secuencias virales protospacer marca. igura 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Generación de sustratos de ARN de las proteínas Cas. El esquema muestra el flujo de trabajo para la generación de (A) de largo pre-crRNA sustratos, (B) intermedio pre-crRNA sustratos y (C) corto Cas sustratos de ARN para pre-crRNA producción. Ejemplos de secuencias se presentan para el conjunto CRISPR de Clostridium thermocellum. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" /> Figura 3. CAS6 ensayo endonucleasa. A.) azul de toluidina gel de poliacrilamida teñido de un oligonucleótido de ARN de diseño personalizado (250 pmol) y dos transcripciones de ARN in vitro (5 l de una reacción típica de 100 l). B.) SDS-PAGE en gel de una preparación CAS6 (80 pmol) de Clostridium thermocellum después de calorprecipitación a 50 ° C durante 1 hora y cromatografía de Ni-NTA. C) Detección de actividad endonucleolítica CAS6 para las secuencias 5 &#39;de repetición terminal etiquetados y pre-crRNA transcritos in vitro. La introducción de un dNTP en la posición -9 suprime CAS6 de escisión para una corta sustrato Cas ARN (S, fig. 2C). A 5 &#39;terminal 8 nt etiqueta también se genera para la maduración de largo crRNA pre-crRNA sustratos (L, Fig. 2A). Las bandas se separaron en un gel desnaturalizante de urea 8 M de poliacrilamida al 12% y se visualizaron por autorradiografía.

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No hay conflictos de interés declarado.

Los métodos presentados permiten la generación de Cas sustratos endonucleasas de tamaños diferentes y con mayor o menor libertad en el diseño de la secuencia. El enfoque más directo para la generación de sustratos sintéticos de oligonucleótidos de ARN se limita a diseños de ARN cortos debido a los costes crecientes y las limitaciones técnicas en la creación de más oligómeros de ARN. Si bien el éxito la síntesis de ARN se ha informado de oligómeros de ARN no modificadas de más de 100 nucleótidos de longitud, el máximo práctico y económico para la síntesis de ARN de ratón se encuentra por debajo de 40 nucleótidos. Sin embargo, cualquier secuencia dada se puede sintetizar y la introducción dirigida de nucleótidos modificados (por ejemplo, desoxirribonucleótidos) puede ser utilizada para analizar los sitios de escisión en detalle. Más pre-ARNc debe ser generada a través de la transcripción in vitro. La hibridación de oligonucleótidos que contienen un promotor de ARN polimerasa de T7 permite la producción de longitud intermedia pre-CRRNComo. La longitud máxima de forma rutinaria y económicamente oligonucleótidos de ADN sintetizados es justo por encima de 150 nucleótidos y representa el máximo de pre-sintéticos crRNAs través de este método. El conjunto de varios pares hibridados de oligonucleótidos de ADN que forman extremos pegajosos con cada otro puede extender esta longitud máxima, pero requiere retos crecientes en la clonación de la construcción. La principal ventaja de este método es la capacidad de generar pre-crRNA construcciones (y por lo tanto Cas endonucleasa de sustratos) con cualquier secuencia deseada. Esto permite que el ensayo de diseños crRNA sintéticos. Por último, grandes y pre-crRNAs se puede obtener de PCR amplificados de elementos genómicos enteros CRISPR o fracciones de los mismos. Las alteraciones en la transcripción in vitro en plantilla de plásmido puede ser introducido a través de mutagénesis dirigida al sitio para la generación de pre-crRNA variantes. Estas construcciones se pueden utilizar para analizar el patrón global de la escisión endonucleolítica dentro de un enteropre-crRNA. El trabajo pionero para la producción de ARN no modificado a través de T7 ARN polimerasa en transcripción in vitro se basa en el 14 ARN de transferencia y ARN virus del mosaico del bromo 15. El consenso T7 promotor de ARN polimerasa consiste de un dominio de reconocimiento (-17 a través de -5) y un dominio de iniciación (-4 a través +6) con iniciación de la transcripción en una guanosina esencial +1 16. Aguas abajo de las posiciones +1 puede ser variada que permite la transcripción de casi cualquier secuencia de ARN deseado. Los métodos presentados en las plantillas para generar in vitro de transcripción run-off para permitir la síntesis in vitro de concluir la fase de crRNAs que responden a regiones genómicas CRISPR o sintéticas variantes pre-crRNA. Las transcripciones se generan con un presente trifosfato 5&#39;-terminal a menos que la reacción de transcripción se ceba con GMP para obtener 5 &#39;monofosfato termini 14. Estos terminales son necesarios si las transcripciones deben ser etiquetadoscon polinucleótido quinasa de T4 y γ-[32 P]-ATP. Actividad de escisión de CAS6 y enzimas similares a CAS6 genera crRNA que contienen 5&#39;-hidroxilo y un 2 &#39;, 3&#39;-termini cíclicos de fosfato. Estos ARN se pueden analizar para el reconocimiento por el complejo Cascade.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Antártico Fosfatasa </td><td> NEB </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> en trifosfato de transcripción in vitro ultrapura grado de nucleótidos </td><td> Bioscience Jena </td><td> NU-1010 - NU-1013 </td><td></td></tr><tr><td> Cromatografía de líquidos, ktapurifier 100 </td><td> GE Healthcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oligonucleótidos de ADN </td><td> GTM Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oligonucleótidos de ARN </td><td> GTM Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> PCR kit de purificación </td><td> QIAGEN </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Spin Miniprep Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 27106 </td><td></td></tr><tr><td> Kit Plasmid Maxi </td><td> QIAGEN </td><td> 12163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> NEB </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> HindIII </td><td> NEB </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> ADN ligasa de T4 </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> T4 polinucleótido quinasa </td><td> Ambion </td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> T7 ARN polimerasa </td><td> preparación propia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mezcle la solución desoxinucleótido </td><td> NEB </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td> Mini-Protean Tetra Sistema de Electroforesis </td><td> Bio-Rad </td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td> Storm 840 Scanner </td><td&gt; GE Healthcare </td><td> 163723 </td><td></td></tr><tr><td> Almacenamiento Phosphorscreen </td><td> Dinámica Molecular </td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td> Mono Q 5/50 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> Phusion de alta fidelidad de ADN polimerasa </td><td> NEB </td><td> M0530L </td><td> utilizar el tampón GC </td></tr><tr><td> Azul de toluidina </td><td> Sigma </td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19 </td><td> NEB </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ-[32 P]-ATP, α-[32 P]-ATP </td><td> Hartmann Analítica </td><td> SRP-401, SRP-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

substrate generation for endonucleases of crispr/cas systems

La interacción de los virus y sus anfitriones procarióticos forma a la evolución de la vida bacteriana y Arqueales. Los procariotas desarrollado varias estrategias para evadir los ataques virales que incluyen modificación de la restricción, la infección abortiva y sistemas CRISPR / Cas. Estos sistemas adaptativos inmunes encontradas en muchas bacterias y Archaea consisten de más Abrillantado c r i egularly nterspaced s hort t alindromic r EPEAT (CRISPR) secuencias y un número de C RISPR como asociado (CAS) genes (Fig. 1) 1-3. Los distintos conjuntos de proteínas Cas y repite definir al menos tres grandes tipos divergentes de CRISPR / Cas sistemas 4. Las proteínas universales cas1 y cas2 se proponen para participar en la absorción del ADN viral quegenerará un nuevo elemento separador entre dos repeticiones en el extremo 5 &#39;terminal de un clúster de CRISPR se extiende 5. El clúster completo se transcribe en un precursor-crRNA que contiene todos espaciador y secuencias de repetición y es posteriormente procesada por una enzima de la familia diversa CAS6 en pequeños crRNAs 6-8. Estos crRNAs consisten en la secuencia espaciadora flanqueado por una 5 &#39;terminal (8 nucleótidos) y un 3&#39; terminal de etiqueta derivada de la secuencia de repetición 9. Una infección repetida del virus ahora se puede bloquear como el nuevo crRNA será dirigido por un complejo de proteínas Cas (Cascade) en el ADN viral y lo identifican como tales a través de complementariedad de base 10. Por último, para CRISPR / Cas sistemas de tipo 1, el CAS3 nucleasa va a destruir al invasor detectó DNA 11,12. Estos procesos definen CRISPR / CAS como un sistema inmune adaptativo de los procariotas y abrió un campo de investigación fascinante para el estudio de las proteínas implicadas Cas.La función de muchas proteínas Cas sigue siendo difícil de alcanzar y las causas de la aparente diversidad de los sistemas CRISPR / Cas aún no se han iluminado. Las actividades potenciales de la mayoría de las proteínas de Cas se predijo a través de detallados análisis computacionales. Una fracción importante de las proteínas Cas son o bien se muestra o propuesto para funcionar como endonucleasas de 4. A continuación, se presentan los métodos para generar crRNAs y precursor ARNc-para el estudio de endoribonucleases Cas. Diferentes ensayos endonucleasa requieren secuencias de repetición ya sea directamente cortas que pueden ser sintetizados como oligonucleótidos de ARN o secuencias ya crRNA y pre-crRNA que se generan in vitro a través de la ARN polimerasa T7 escorrentía transcripción. Esta metodología permite la incorporación de nucleótidos radiactivos para la generación de sustratos de endonucleasa internos etiquetados y la creación de crRNAs sintéticos o mutante. CAS6 actividad endonucleasa se utiliza para madurar pre-crRNAs en crRNAs con 5&#39;-hydroxilo y un 2 &#39;, 3&#39;-termini cíclicos de fosfato.

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Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

CRISPR / Cas sistemas median la inmunidad adaptativa en bacterias y arqueas. Muchas proteínas CAS se propone actuar como endoribonucleases que actúan sobre los precursores crRNA de longitud variable. Aquí se ilustran tres enfoques diferentes para generar pre-crRNA sustratos para el análisis bioquímico de la actividad endonucleasa de Cas.

Sustrato Generación para endonucleasas de CRISPR / Cas Sistemas

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

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27.2K vistas.  Max-Planck-Institute for Terrestrial Microbiology. CRISPR / Cas sistemas median la inmunidad adaptativa en bacterias y arqueas. Muchas proteínas CAS se propone actuar como endoribonucleases que actúan sobre los precursores crRNA de longitud variable. Aquí se ilustran tres enfoques diferentes para generar pre-crRNA sustratos para el análisis bioquímico de la actividad endonucleasa de Cas.

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Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Utilizando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) para desarrollar herramientas de diagnóstico

Investigación

Biología

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of cells (approximately 25 in C. borealis) which are well characterized. The cells in the STG exhibit a broad range of outputs and are responsible for the motor actions of the stomach. The stomach contains the gastric mill which breaks down food with three internal teeth, and the pylorus which filters the food before it reaches the midgut. The STG produces two rhythmic outputs to control the gastric mill and pylorus known as central pattern generators (CPGs). Each cell in the STG can participate in one or both of these rhythms. These CPGs allow for the study of neuromodulation, homeostasis, cellular and network variability, network development, and network recovery.
The dissection of the stomatogastric nervous system (STNS) from the Jonah crab (Cancer borealis) is done in two parts; the gross and fine dissection. In the gross dissection the entire stomach is dissected from the crab. During the fine dissection the STNS is extracted from the stomach using a dissection microscope and micro-dissection tools (see figure 1). The STNS includes the STG, the oesophageal ganglion (OG), and the commissural ganglia (CoG) as well as the nerves that innervate the stomach muscles. Here, we show how to perform a complete dissection of the STNS in preparation for an electrophysiology experiment where the cells in the STG would be recorded from intracellularly and the peripheral nerves would be used for extracellular recordings. The proper technique for finding the desired nerves is shown as well as our technique of desheathing the ganglion to reveal the somata and neuropil.

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric nervous system (STNS) of the Jonah crab (C. borealis) can be used for electrophysiology, immunohistochemistry, and cell culture studies. The STNS extraction is done in two parts: the gross and fine dissection.

Cáncer de Borealis Stomatogastric disección del sistema nervioso

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

La disección bruto del estómago de la langosta, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generación de humanos CD40 activado por células B

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescencia de células activadas por la clasificación de los protoplastos de la planta

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Síntesis y caracterización de nanosondas fosforescentes de imágenes de oxígeno en sistemas biológicos

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

Los ensayos biofísicos investigará las propiedades mecánicas del núcleo celular Interfase: Aplicación del sustrato deformación y manipulación de Microneedle

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

El uso de quimiostatos en Microbiana Biología de Sistemas

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Generación de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramación

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...