Los autores agradecen al NIH (AI074224 y GM085323) y NSF (0712019 y 0924699) fondos para apoyar proyectos dedicados a la biosíntesis heteróloga.

El texto siguiente es específico para el antibiótico eritromicina A, pero los pasos están diseñados para ser aplicables a otros productos naturales como candidatos para la biosíntesis heterólogo. 1. Eritromicina A Transferencia Genética Cluster <ol><li> Diseñar cebadores de PCR para amplificar todos los genes asociados con la eritromicina A en el grupo S. erythraea cromosoma. Este paso es específica para los candidatos de productos naturales cuyas secuencias genéticas se han determinado. Alternativamente, los genes requeridos pueden ser sintetizados (a través de varias opciones de proveedor comercial) con la ventaja de que los genes recientemente sintetizados estaría diseñado para el uso de codones óptima dentro de la E. nuevo coli huésped. Si la síntesis de ADN se persigue, un desafío actual es la generación de genes megasynthase que pueden exceder de 10 kb de longitud. Técnicamente, la síntesis se puede lograr, pero es difícil y costoso. Se prevé que improvem continuopadres en la tecnología genética síntesis abordará inconvenientes actuales y validan aún más este enfoque para el suministro de material genético heterólogo. </li><li> Realizar PCR usando recién preparada S. erythraea ADN genómico como plantilla. El ADN cromosómico se pueden preparar a partir de cultivos de S. erythraea o de material congelado de la bacteria (Figura 3) 25. Las reacciones de PCR se pueden beneficiar de la adición de DMSO (4 l en reacciones de 50 l) para dar cuenta de alto contenido de G + C en el objetivo S. erythraea genes. Cada gen amplificado se secuenció para confirmar que el gen completo ha sido recuperado y que no se han introducido mutaciones durante el proceso de PCR. </li><li> Mediante digestión de restricción y ligación, insertar cada uno de los genes aislados en vectores de expresión diseñados para E. coli (Figura 3). Esta es iniciada por el diseño de sitios de restricción dentro de los cebadores de PCR para permitir la digestión y ligación en ex adecuadovectores de depresión (un ejemplo se ha incluido en la figura 3). Hemos utilizado tanto pET21 y vectores pET28. El vector pET28 permite la inclusión de una secuencia líder 5 &#39;, que ayuda en la expresión de genes de eritromicina un caso. Confirmar la expresión de genes individuales a través de RT-PCR, análisis SDS-PAGE (usando fracciones de proteínas solubles), o convenientes ensayos fenotípicos (Figura 4). </li><li> Construir operones basados ​​en genes expresados ​​con éxito a partir de plásmidos de expresión individuales (Figura 3). Hemos utilizado tradicionalmente combinaciones de enzimas de restricción compatible-cohesivos (tal como Xba I y Spe I) 24 para convertir secuencialmente genes para los operones, sin embargo, los sitios de restricción elegido para la construcción operón no debe residir dentro de (o debe ser retirado de) el aislado secuencias de genes (un problema que se puede evitar si se utiliza la síntesis de genes). Este paso consolida la eritromicina A 20 genes antes de la E. coli transformación. Actualmente, hemos utilizado este método para incluir hasta 20 kb de ADN extraño en un vector pET estándar (dos genes de ~ 10 kb cada uno). Además, hemos utilizado este enfoque para generar operones contienen nueve genes. No se sabe exactamente la cantidad de ADN o número de genes que pueden estar integrados en pET de tipo plásmidos, sin embargo, los indicadores citados anteriormente proporcionan una referencia para los sistemas complicados como la vía biosintética de eritromicina. Finalmente, estándar en los pasos de ligación in vitro y las subsiguientes etapas de transformación con éxito cada vez más difícil como operón y aumenta plásmido tamaño. Temperatura de ligadura (12-22 ° C) y tiempo (3-24 hr) son variadas y electro-transformación se utiliza para ayudar en el proceso de producción de construcciones de plásmidos finales. </li><li> Transformar los plásmidos biosíntesis de nuevo diseño en E. coli cepa BAP1 mediante electro-transformación (Figura 5). El procedimiento puede intentarse con plásmidos introducidos de forma secuencial o en combination. Al transformar tamaño capaz o plásmidos numerosas, que han utilizado tradicionalmente electro-transformación (en oposición a una transformación química). Una vez transformado, placa de las células sobre medio sólido LB que contenía tetraciclina (5 mg / l), carbenicilina (100 mg / l), kanamicina (50 mg / l), estreptomicina (50 mg / l), y apramicina (50 mg / l ) para seleccionar para el mantenimiento del plásmido. Es muy raro utilizar antibióticos seis selección diferente después de la transformación de una E. coli celular, pero esto simplemente refleja el número total de plásmidos necesarios para permitir la eritromicina A final de la biosíntesis. Si bien es posible, el enfoque limitará las capacidades de producción del compuesto, una vez se ha iniciado el cultivo (véase más adelante). </li></ol> 2. E. coli Reconstitución biosintética <ol><li> BAP1 cepa ha sido diseñado para proporcionar a los sustratos necesarios para la biosíntesis y de modificar después de la traducción la megasynthase B desoxieritronolida. Los genes individuales de la erythromycin Una vía se han probado para la expresión de genes y operones consolidado como en plásmidos de expresión. Esta sección está dedicada a las condiciones de cultivo para determinar la actividad concertada de la eritromicina A plena vía. </li><li> Tome 3 colonias separadas de la BAP1 recién transformada y inocular cultivos de 1,5 ml de LB que contienen los antibióticos requeridos plásmido de selección (en las mismas concentraciones indicado anteriormente para seleccionar los transformantes en medio sólido), isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG; 100 mM ) y arabinosa (2 mg / ml) para inducir la expresión de genes, y propionato de sodio 20 mM para apoyar la formación intracelular precursor biosintético. Una vez que se ha confirmado la producción, cultivos más grandes pueden llevarse a cabo en un intento de aumentar y maximizar los títulos de producto. </li><li> Cultivar las células a 22 º C y 250 rpm durante 24-48 horas. En este caso, los antibióticos de selección asegura que los plásmidos requeridos se mantienen en las primeras etapas del cultivo celular. Sin embargo, el plásmidos puede perderse fácilmente como los niveles de selección de antibióticos cambian en el transcurso del período de cultivo. Esto puede conducir a la inestabilidad del plásmido (es decir, la pérdida de uno o más plásmidos durante el cultivo), que luego podría limitar la capacidad de producción. El problema se exacerba cuando plásmidos incompatibles se utilizan para introducir un grupo completo de genes heterólogos. Tal es el caso para el compuesto de eritromicina A (Figura 5) y tendría que ser remediada a la sobreproducción verdaderamente el compuesto de E. coli. Sin embargo, para el propósito de demostrar la producción inicial, tales defectos de diseño son tolerados por el bien de expedita constitutivo de la viabilidad del enfoque heterólogo. </li><li> Aclarar las culturas por centrifugación a 10.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf. Eliminar el sobrenadante y se almacena a 4 ° C para su análisis. </li><li> En el caso de la eritromicina A, la falta de producción de compuesto fue tratado por la inclusión de la chaperonina GroES / EL (utilizando pGro7específicamente para hacer frente a la falta de actividad de la enzimas post-expresión) y la inclusión de copias de genes adicionales (para los genes sospechosos de expresión débil / actividad). Estrategias similares pueden ser necesarios esfuerzos con otros heterólogos de productos naturales de producción. </li></ol> 3. Análisis del producto <ol><li> Para confirmar y cuantificar la formación de la eritromicina A, se inyecta el sobrenadante de cultivo en un sistema de LC-MS (Figura 6). Eritromicina A disponible comercialmente se utilizó para confirmar la producción y como un estándar, durante la cuantificación. Para los casos sin estándares comercialmente disponibles, LC-MS análisis requeriría caracterización química adicional por RMN y espectrometría de masas de alta resolución. </li><li> Comparar la producción entre las 3 colonias / culturas de la transformación BAP1. Elija el mayor productor y preparar una acción del glicerol de la fuente de colonia. Este paso se puede realizar en paralelo con los cultivos de producción de la sección Protocolo2 mediante el uso de una pequeña porción de los cultivos para preparar stocks de glicerol. Almacene la acción del glicerol en un congelador -80 ° C. </li><li> Usando los confirmados, el más alto stock de células productoras, comienza una cultura de producción independiente y extraer el sobrenadante final con 2x volumen de acetato de etilo. Usar un sistema de vacío por evaporación para secar el extracto y se resuspende en 100 l de metanol. Transferir el extracto a un disco de filtro estéril (diámetro ~ 1/4 pulgada) y permitir que el disco se seque. Por otra parte, la cultura B. subtillis en líquido LB noche a la mañana. Añadir 20 l de la B. subtilis cultivo a 20 ml de agar LB líquido a 45 ° C. Placa de agar y dejar que se solidifique. Colocar el disco de filtro sobre la placa y se incuba a 37 ° C (Figura 7). Alternativamente, el extracto puede ser añadido a cultivos líquidos dentro de una placa de 96 pocillos para cuantificar la actividad usando un lector de placas (Figura 7). </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

Los pasos críticos en la biosíntesis heteróloga se encuentran en cada uno de los tres puntos de procedimiento en el proceso: 1) la transferencia genética, 2) la reconstitución de biosíntesis, y 3) análisis del producto. Un problema en cualquier momento va a descarrilar el objetivo último de establecer la biosíntesis heteróloga. Tal vez el aspecto más difícil del proceso es el establecimiento de la biosíntesis reconstituida, ya que esto es absolutamente necesario para permitir un análisis acertado. Sin emba...

Eritromicina A es un antibiótico producido por el policétido Gram-positivos bacteria del suelo Saccharopolyspora erythraea, y la producción actual se ha mejorado incrementalmente a ~ 10 g / L a través de décadas de mutagénesis tradicional y protocolos de cribado y más recientemente a través de esquemas de optimización de proceso 1-6. Estrategias de mutagénesis y selección son comunes en el desarrollo de antibióticos producto natural como resultado de las dificultades de cultivo y / o la manipulación genética de huéspedes nativos de producción y debido a la actividad antibiótica fácilmente disponibles o fenotipos de crecimiento mejoradas para facilitar la selección. En el caso de la eritromicina A, S. erythraea está limitado por un perfil de crecimiento lento y la falta de técnicas de manipulación genética directa (con relación a organismos tales como E. coli), por lo tanto, lo que dificulta una rápida mejora de la producción y la biosíntesis de nuevos derivados. Habiendo reconocido los problemas de producción y desbloqueado diversificatisobre las posibilidades con compuestos como la eritromicina A, la comunidad de investigadores comenzó a perseguir la idea de la biosíntesis heteróloga (Figura 1) 7. Estos esfuerzos coincidieron con la información secuencial disponible para el grupo de genes de eritromicina A 8-11. Cabe destacar que el número de secuenciado los complejos grupos de productos naturales de genes ha ampliado en gran medida 12-16, para proporcionar el empuje para mantener los esfuerzos en la biosíntesis heteróloga de acceso codificado potencial medicinal. Para ello, la reconstitución heterólogo requiere que el nuevo huésped satisfacer las necesidades de la ruta biosintética específica. E. coli proporciona la conveniencia técnica, un amplio abanico que abarca las técnicas de biología molecular y estrategias metabólicas y procesos de ingeniería para desarrollo de productos. Sin embargo, cuando se compara con los hosts de producción nativos, E. coli no presenta el mismo nivel de producción complejo producto natural. Por lo tanto, se desconoce si E. coli podría servir como una opción viable para la biosíntesis de complejo heterólogo producto natural. Sin embargo, se supuso que la E. coli sería un organismo huésped ideal si biosíntesis heterólogo podría ser lograda. Con este objetivo en mente, los esfuerzos iniciales comenzaron a producir la aglicona policétido 6-desoxieritronolida B (6dEB) a través de E. coli. Sin embargo, nativo E. metabolismo coli no podría proporcionar niveles apreciables de la propionil-CoA y (2S)-metilmalonil-CoA precursores necesarios para apoyar la biosíntesis de 6dEB ni podía el nuevo huésped después de la traducción modificar la sintasa B desoxieritronolida (DEBS) enzimas. Para solucionar estos problemas, una vía metabólica compuesto de enzimas nativas y heterólogas fue construido en E. coli tales que exógenamente propionato alimentado se convierte intracelularmente propionil-CoA y luego (2S)-metilmalonil-CoA; durante la ingeniería para completar esta vía, un gen sfp se colocó en the cromosoma de E. coli BL21 (DE3) para producir una nueva cepa llamada BAP1. La enzima Sfp es un capaz phosphopantetheinyl transferasa de unir el cofactor 4&#39;-fosfopanteteína a las enzimas DEBS 17,18. Los tres genes DEBS (cada ~ 10 kb) se colocaron después en dos vectores de expresión por separado seleccionables que contienen promotores inducibles T7. Después de un ajuste de clave de temperatura después de la inducción (a 22 ° C), los genes DEBS fueron expresados ​​coordinadamente dentro BAP1 en un estado activo capaz de generar 6dEB 19. La búsqueda de la eritromicina A plena biosíntesis entonces comenzó a usar un grupo de genes análogos de Micromonospora megalomicea o una vía híbrida compuesta de genes de S. erythraea, S. fradiae, y S. venezuelae, que produce los compuestos intermedios eritromicina C y D 6-desoxieritromicina, respectivamente 20-22. Recientemente, nuestro grupo ha extendido estos esfuerzos mediante la producción de erythromycin A (la forma más clínicamente pertinente de la eritromicina) a través de E. coli. A diferencia de los trabajos anteriores, nuestra estrategia coordinada expresó la S. 20 original erythraea genes necesarios para la biosíntesis de policétidos, la biosíntesis de deoxysugar y fijación, corte y confección adicional, y auto-resistencia (Figura 2). En total, 26 (nativo y heterólogas) genes fueron diseñados para permitir a E. coli para producir eritromicina A en 4 mg / L 23,24. Este resultado estableció la producción completa de un complejo producto natural policétido utilizando E. coli y sirve como base para aprovechar esta opción de nueva producción o el ejercicio de otras nuevas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> PCR máquina </td><td> Eppendorf </td><td> Mastercycler personal </td><td></td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo (DMSO) </td><td> Pescador </td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td> Electroporador </td><td> BioRad </td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Pescador </td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td> Propionato de sodio </td><td> Sigma </td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-arabinosa </td><td> Sigma </td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td> Refrigerado Shaker </td><td> Thermo Scientific </td><td> MaxQ 4000 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifugue </td><td> Eppendorf </td><td> Centrifugar 5415D </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td> Takara </td><td> Acompañante plásmido Set (3340) </td><td></td></tr><tr><td> pET21, pET28, PCDF-Duet-1 </td><td> Merck Chemicals </td><td> 69742-3, 69864, 71340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td> Applied Biosystems </td><td> 3200 Q-Trap </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de etilo </td><td> Sigma </td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Sigma </td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga de vacío </td><td> Eppendorf </td><td> Concentrador de 5301 </td><td></td></tr><tr><td> Evaporador rotativo </td><td> Buchi </td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

the logic, experimental steps, and potential of heterologous natural product biosynthesis featuring the complex antibiotic erythromycin a produced through e. coli

La producción heteróloga de productos naturales complejos es un enfoque diseñado para hacer frente a las limitaciones actuales y las posibilidades futuras. Es particularmente útil para aquellos compuestos que poseen valor terapéutico, pero no puede ser suficientemente producido o se beneficiaría de una forma mejorada de producción. Los procedimientos experimentales implicados pueden subdividirse en tres componentes: 1) transferencia genética, 2) la reconstitución heterólogo, y 3) el análisis del producto. Cada componente experimental está en continua optimización para afrontar los retos y anticipar las oportunidades asociadas a este nuevo enfoque. Heteróloga biosíntesis comienza con la identificación de una secuencia genética responsable de un producto natural valioso. La transferencia de esta secuencia a un huésped heterólogo se ve complicada por la complejidad ruta biosintética responsable de la formación de producto. El antibiótico eritromicina A es un buen ejemplo. Veinte genes (un total de&gt; 50 kb) son necesarias para la biosíntesis eventual. Además, tres de estos genes codifican megasynthases, multi-dominio de enzimas cada ~ 300 kDa de tamaño. Este material genético debe ser diseñado y se transfirió a E. coli para la biosíntesis reconstituida. El uso de aislamiento de PCR, construcción operón, plásmidos de múltiples cystronic, y electro-transformación se describe en la transferencia de la eritromicina A clúster genética a E. coli. Una vez transferido, el E. coli celular debe soportar la biosíntesis eventual. Este proceso es también un reto, dadas las diferencias sustanciales entre E. coli y la mayoría de los anfitriones originales responsables de la formación de complejos productos naturales. La celda debe proporcionar sustratos necesarios para apoyar la biosíntesis y coordinadamente expresar el cluster genético transferido para producir enzimas activas. En el caso de la eritromicina A, la E. coli celular tuvo que ser diseñado para proporcionar a los dos precursores (propionyl-CoA y (2S)-metilmalonil-CoA) necesario para la biosíntesis. Además, las modificaciones de secuencias de genes, el número de copias del plásmido, chaperonina co-expresión, modificación post-traduccional enzimática, y temperatura de proceso se requiere también para permitir que la eritromicina A final de formación. Por último, la producción exitosa debe ser evaluada. Para el caso de la eritromicina A, presentaremos dos métodos. La primera es la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) para confirmar y cuantificar la producción. La bioactividad de la eritromicina A también se confirmó mediante el uso de un ensayo biológico en el que se prueba la actividad antibiótica contra Bacillus subtilis. Los ensayos de evaluación establecen eritromicina A de la biosíntesis de E. coli y sentar las bases para futuros esfuerzos de ingeniería para mejorar o diversificar la producción y para la producción de nuevos compuestos complejos naturales utilizando este enfoque.

El resultado deseado de este enfoque es la producción de un producto natural completamente bioactivo a partir de la E. coli heteróloga de acogida. Esto está mejor representada por los resultados de CL-EM utilizados para confirmar y cuantificar la producción (Figura 6) y el bioensayo antibacteriano utilizado para confirmar la actividad final (Figura 7). En el esquema general de la biosíntesis heteróloga, este resultado se define el éxito. Una vez logrado, los esfuerzos de...

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The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

La biosíntesis heteróloga de la eritromicina A través<em&gt; E. coli</em&gt; Incluye las siguientes etapas experimentales: 1) la transferencia genética, 2) la reconstitución heteróloga, y 3) análisis de productos. Cada paso se explica en el contexto de la motivación, el potencial y retos terapéuticos en la producción de productos naturales utilizando<em&gt; E. coli</em&gt; Como anfitrión sustituto.

La lógica, la Plaza experimentales, y el potencial de la Biosíntesis heteróloga Producto Natural Con la eritromicina Complejo antibiótico producido a través de un<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

18.4K vistas.  State University of New York at Buffalo. La biosíntesis heteróloga de la eritromicina A través E. coli Incluye las siguientes etapas experimentales: 1) la transferencia genética, 2) la reconstitución heteróloga, y 3) análisis de productos. Cada paso se explica en el contexto de la motivación, el potencial y retos terapéuticos en la producción de productos naturales utilizando E. coli Como anfitrión sustituto.

Video: The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Transformación de ADN plásmido en E. coli utilizando el método de choque térmico

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Investigación

Biología

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

Procesamiento de los Pinus taeda PtGen2 cDNA microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

La disección bruto del estómago de la langosta, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagénesis y funcional protocolos de selección de la evolución dirigida de proteínas en E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening Expresión cuantitativa y Purificación Aplicada a Recombinante Disulfide ricos en proteínas del veneno Producido en<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Método para la Evaluación de los efectos de un rango de longitudes de onda e intensidades de / Terapia de luz del infrarrojo cercano Red sobre el estrés oxidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. The S domain forms a contiguous scaffold around the viral RNA, whereas the P domain forms viral spikes on the S domain and contains determinants for antigenicity and host-cell interactions. The P domain binds carbohydrate structures, i.e., histo-blood group antigens, which are thought to be important for norovirus infections. In this protocol, we describe a method for producing high quality norovirus P domains in high yields. These proteins can then be used for X-ray crystallography and ELISA in order to study antigenicity and host-cell interactions.
The P domain is firstly cloned into an expression vector and then expressed in bacteria. The protein is purified using three steps that involve immobilized metal-ion affinity chromatography and size exclusion chromatography. In principle, it is possible to clone, express, purify, and crystallize proteins in less than four weeks, which makes this protocol a rapid system for analyzing newly emerging norovirus strains.

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Here, we describe a method to express and purify high quality norovirus protruding (P) domains in E. coli for use in X-ray crystallography studies. This method can be applied to other calicivirus P domains, as well as non-structural proteins, i.e., viral protein genome-linked (VPg), protease, and RNA dependent RNA polymerase (RdRp).

La producción de norovirus dominios que sobresale en humanos<em&gt; E. coli</em&gt; Para la cristalografía de rayos X

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication machinery. The stalling of a replisome can lead to its dissociation from the chromosome, either in part or its entirety, leading to the collapse of the replication fork. The recovery from this collapse is a necessity for the cell to accurately complete chromosomal duplication and subsequently divide. Therefore, when the collapse occurs, the cell has evolved diverse mechanisms that take place to restore the DNA fork and allow replication to be completed with high fidelity. Previously, these replication repair pathways in bacteria have been studied using UV damage, which has the disadvantage of not being localized to a known site. This manuscript describes a system utilizing a Fluorescence Repressor Operator System (FROS) to create a site-specific protein block that can induce the stalling and collapse of replication forks in Escherichia coli. Protocols detail how the status of replication can be visualized in single living cells using fluorescence microscopy and DNA replication intermediates can be analyzed by 2-dimensional agarose gel electrophoresis. Temperature sensitive mutants of replisome components (e.g. DnaBts) can be incorporated into the system to induce a synchronous collapse of the replication forks. Furthermore, the roles of the recombination proteins and helicases that are involved in these processes can be studied using genetic knockouts within this system.

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Induciendo un bloqueo de replicación de sitios en específico<i&gt; E. coli</i&gt; El uso de un sistema fluorescente represor operador

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy to use and widely utilized by laboratories analyzing the adipogenic potential of mesenchymal cells. However, they are not specific to changes in gene transcription. We have developed a gene-specific differentiation assay to analyze when a mesenchymal cell has switched its fate to an adipogenic lineage. Immuno-labelling against fatty acid binding protein-4 (FABP4), a lineage-specific marker of adipogenic differentiation, enabled visualization and quantification of differentiated cells. The ability to quantify adipogenic differentiation potential of mesenchymal cells in a 96 well microplate format has promising implications for a number of applications. Hundreds of clinical trials involve the use of adult mesenchymal stromal cells and it is currently difficult to correlate therapeutic outcomes within and especially between such clinical trials. This simple high-throughput FABP4 assay provides a quantitative assay for assessing the differentiation potential of patient-derived cells and is a robust tool for comparing different isolation and expansion methods. This is particularly important given the increasing recognition of the heterogeneity of the cells being administered to patients in mesenchymal cell products. The assay also has potential utility in high throughput drug screening, particularly in obesity and pre-diabetes research.

Traditional methods of assessing adipogenic differentiation are cheap and easy to use, but are not specific to changes in gene expression. We have developed an assay to quantify mesenchymal cell differentiation into mature adipocytes using a lineage specific marker. This assay has diverse applications across basic research and clinical medicine.

Visualización y cuantificación del potencial de la diferenciación de células mesenquimales Adipogenic con un marcador específico de linaje

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...