El etiquetado, la hibridación y los protocolos de lavado de este documento contiene algunas modificaciones a los desarrollados anteriormente por el Dr. J. Quackenbush, mientras que en el Instituto de Investigación Genómica (TIGR), el Dr. Shawn Levy en la Vanderbilt microarray Shared Resource (VMSR), y el Dr. Rob Alba, mientras que en el Instituto Boyce Thompson (BTI), la Universidad de Cornell.

(Tenga en cuenta las secciones 1 - 4 No demostrada en Video) Preparación de Cy-etiquetados objetivo cDNA Lo que sigue es el protocolo que utiliza para la síntesis de cDNA a partir de ARN total de pino taeda y el etiquetado de cDNA indirecta antes de microarrays hibridaciones. Aunque a algunos no triviales se han realizado modificaciones, el protocolo de abajo es similar a la del manual de instrucciones proporcionado con superíndice Kit indirectos de la Invitrogen Etiquetado cDNA. Parte 1: primer capítulo de reacción de síntesis de cDNA <ol><li> Mezclar y brevemente giro cada componente del kit antes de su uso. </li><li> Prepare las reacciones de la siguiente manera: <ul><li> Xμl DEPC-H 2 O </li><li> Xμl ARN total, 20 mg / reacción (pretratamiento con DNasa Turbo de Ambion) </li><li> 2μl anclado oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl) </li><li> Primer 1μl azar hexamer </li><li style="list-style:none;"> Volumen total = 18μl </li></ul></li><li> Incubar los tubos a 70 ° C durante 5 minutos, y luego colocar en hielo durante 1-2 minutos. </li><li> Agregue lo siguiente a cada tubo de reacción sobre hielo: <ul><li> 6μl 5X primer capítulo de buffer </li><li> 1.5μl 0,1 M TDT </li><li> 1.5μl 10 mM dNTP mix </li><li> 1μl RNaseOUT (40U/μl) </li><li> 2μl superíndice III RT (400U/μl) </li></ul></li><li> Mezclar suavemente y girar brevemente. Incubar el tubo en la noche a 45 ° C. </li><li> Añadir 15μl de NaOH 1 M a cada tubo de reacción y mezclar bien. </li><li> Incubar el tubo a 70 ° C durante 10 minutos. </li><li> Añadir 15μl de HCl 1 M y mezcle suavemente. </li><li> Añadir 20μl de acetato de sodio 3M (pH 5.2) y mezclar suavemente. </li></ol> Parte 2: Purificación primer capítulo de cDNA. <ol><li> Agregar 500μl de tampón de carga a la cDNA (del Paso 1.9) y mezclar bien. </li><li> Coloque una columna de purificación de SNAP (suministrado con el kit de marcaje indirecto) en un tubo de recogida y la carga de su cDNA en la columna. </li><li> Giran a 14.000 g a temperatura ambiente durante 1 minuto, descartar el filtrado. </li><li> Colocar la columna de cupones para alimentos en el tubo de la misma colección y añadir 500μl de tampón de lavado. </li><li> Giran a 14.000 g a temperatura ambiente durante 1 minuto, descartar el filtrado. </li><li> Repita los pasos 2,4 y 2,5 veces tres, para un total de tres lavados 500μl. </li><li> Girar una vez más a 14.000 g a temperatura ambiente durante un minuto seg; deseche el flujo continuo. </li><li> Colocar la columna de cupones para alimentos en un tubo de 1,5 ml nuevo. </li><li> Añadir 50μl de agua caliente con DEPC (50 ° C) a la columna de cupones para alimentos y la columna se incuban a temperatura ambiente durante 1 minuto. Eluir el cDNA a través de un giro a 14.000 g a temperatura ambiente durante 1 minuto. </li><li> Repita el paso 2.9, utilizando 100μl de agua tibia con DEPC agua y el mismo tubo 1,5 ml de eluyente. </li><li> Añadir 20μl de acetato de sodio 3M (pH 5,2) para el eluyente de los pasos 2.9 y 2.10. </li><li> Añadir 3μl de glucógeno (20mg/ml) en el tubo y mezclar. </li><li> Agregar 500μl de helado de EtOH al 100%, mezclar bien e incubar el tubo durante 1 hora a -80 º C. </li><li> Girar el tubo a 14.000 ga 4 ° C durante 20 minutos. Retire con cuidado el sobrenadante. </li><li> Agregar 500μl de helado de EtOH 70% y el giro del tubo a 14.000 ga 4 ° C durante 5 minutos. Retire con cuidado el sobrenadante. </li><li> Aire seco de la muestra durante 5 minutos; asegurar que todos los EtOH se retira. </li><li> Caliente el tampón de acoplamiento 2X a 37 ° C durante 5 minutos y vuelva a suspender la muestra de ADNc en 5μl de búfer cálidos acoplamiento 2X. </li><li> Calentar el cDNA / buffer de acoplamiento a 50 ° C durante 10 minutos y agitar bien. Asegúrese de que el cDNA pellet es totalmente re-suspendido en el tampón de acoplamiento 2X. </li></ol> Parte 3: Etiquetado con tinte fluorescente En la preparación de la reacción, tenga cuidado para minimizar la exposición de la solución de colorante a la luz. Además, el DMSO es higroscópico y absorbe la humedad del aire, que va a reaccionar con el éster de NHS del colorante y reducir significativamente la eficacia de la reacción de acoplamiento. Mantenga el DMSO suministrado en el kit en un tapón de rosca vial ámbar a -20 ° C, y dejar que el vial alcance la temperatura ambiente antes de abrir para evitar la condensación. Utilice sólo el DMSO suministrado con el kit. <ol><li> Abrir un paquete de Cy-3 o Cy-5 Dye y añadir 75μl de DMSO directamente al vial de tinte. </li><li> Añadir 5μl de la solución de DMSO / colorante en el tubo de paso 2.18. </li><li> Mezclar bien e incubar el tubo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 hora. </li><li> Añadir 20μl de acetato de sodio 3M (pH 5,2) a la solución de tinte junto cDNA. </li><li> Agregar 500μl de tampón de carga a la solución de cDNA. Mezclar bien por agitación. </li><li> Coloque una columna de SNAP en un tubo de recogida de claro y cargue la solución de cDNA / buffer. </li><li> Giran a 14.000 g a temperatura ambiente durante 1 minuto, descartar el filtrado. </li><li> Colocar la columna de cupones para alimentos en la misma coleccióntubo, añadir 500μl de tampón de lavado a la columna. </li><li> Giran a 14.000 g a temperatura ambiente durante 1 minuto, descartar el filtrado. </li><li> Repita los pasos 3. 8-3.9 tres veces, para un total de tres lavados 500μl. </li><li> Girar una vez más a 14.000 g a temperatura ambiente durante 1 minuto, descartar el filtrado. </li><li> Colocar la columna de cupones para alimentos en un tubo de la nueva colección de color ámbar. </li><li> Añadir 65μl de agua caliente con DEPC (50 ° C) a la columna de SNAP e incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto. </li><li> Giran a 14.000 g, a temperatura ambiente durante 1 minuto y recoger el filtrado. El flujo a través deberá contener 60μl de su purificada de tinte junto cDNA. </li></ol> Parte 4: Evaluación del procedimiento de etiquetado. <ol><li> Llevar a cabo un ensayo para evaluar cada espectrofotómetro etiquetado Cy-cDNA. Calcular el número total de pmol de cDNA sintetizado: [DO 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg] / 324,5 pg / pmol. Calcular el total de pmol incorporado Cy-Dye para cada reacción de marcaje: pmol Cy3 = [OD 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [OD 650 X vol.] / 0,25. A continuación, calcular la pmol de nucleótidos / pmol relación de tinte para cada reacción. Reacciones óptimo generar 6000pmol&gt; de cDNA (por 60ul),&gt; 200pmol de Cy-Dye (por 60ul), y una relación de nucleótidos / tinte que es &lt;30. </li></ol> Parte 5: Diapositiva de prelavado <ol><li> La matriz PtGen2 está impreso en Corning diapositivas UltraGAPS (amino-silano recubiertos) y ADNc son UV-reticulado. Puntos de impresión son visibles debido a la alta salinidad del buffer. </li><li> Utilice un rotulador de punta de diamante para marcar la diapositiva de las zonas superior e inferior del área de impresión (opcional). </li><li> Ponga aproximadamente 250 ml previamente calentada a 43 ° C 0.2% de solución de SDS en la fuente de lavado del portaobjetos del microscopio (3 &quot;x 4&quot;). </li><li> Colocar los portaobjetos para ser pre-hibridación en el estante de diapositivas y sumergirse en la solución de SDS 15-20 veces con mucha energía para eliminar las sales en las diapositivas. </li><li> Con unas pinzas, retirar con cuidado las diapositivas de la rejilla y colóquelos en un frasco de Coplin que contiene pre-hibridación Buffer (5X SSC, 0,1% SDS, 1% BSA) que ha sido previamente calentada a 43 ° C. Se incuba a 43 ° C durante por lo menos una hora. </li></ol> Parte 6: Pre-hibridación <ol><li> Establecido cinco platos de lavado de diapositivas, cada una con millipure dH 2 O, y una jarra de Coplin llena de isopropanol grado molecular. Colocar los portaobjetos en una gradilla para portaobjetos y el proceso de forma secuencial a través de cinco platos a mojar 20 veces cada uno. </li><li> Retirar los portaobjetos dos a la vez desde el agua de lavado quinto y baño 5-6 veces en el lugar de isopropanol y de inmediato en una presentación de diapositivas en la microcentrífuga (sobremesa Chipmate, 2 posiciones) y el giro de 1 minuto a secas. </li><li> Diapositivas limpiar con aire comprimido filtrado a través de un cartucho de filtro de 0,22 M y el lugar con el código de barras hacia arriba en una cámara de hibridación Genomic Solutions. </li><li> LifterSlips Clean ™ con aire filtrado y colocarlos en las diapositivas con las tiras blancas hacia abajo. Utilice una punta de pipeta amarilla para alinear con cuidado la hoja de levantador de la diapositiva (lavado LifterSlips ™ por primera vez en etanol al 70% es opcional. Hemos encontrado que es innecesario.) </li></ol> Parte 7: La hibridación Debe llevarse a cabo en la oscuridad o bajo luz baja. <ol><li> Para cada diapositiva que se hibridan, calcular la cantidad de Cy-5 y Cy-3 etiquetados cDNA para dar 50-75pmol de cada objetivo. Combine las cantidades en un solo tubo y seca en un secador de vacío con el ajuste de calor a 37-45 ° C. Evitar que se seque por completo! </li><li> Resuspender las sondas de hibridación de amortiguación seca en 60 ml (recién hecho ese día) y agitar brevemente. </li><li> Incubar los cDNAs resuspendido durante 5 minutos en un baño de 95 ° C y luego microfuga rápido durante 30 segundos. </li><li> De carga de todo el volumen de la sonda se resuspendieron lentamente pipeteo en el slide-LifterSlip ™ unión en la parte inferior (código de barras) de la diapositiva. La diapositiva se carga por medio de la acción capilar. (Algunos prefieren la pipeta a la diapositiva y luego suavemente la superposición LifterSlip ™ es un método de un disparo ya que si te las burbujas no se puede mover el LifterSlip ™ después de la colocación que puede conducir a punto artefactos manchas) </li><li> 20 ul lugar de la TDT en 100 mM de cada bien la humedad situados en los extremos de la cámara. </li><li> Coloque la parte superior de la cámara y apretar los tornillos de la leva. Cubrir la cámara con papel de aluminio y sumergirse en un baño de agua 48 ° C durante 12-18 horas con agitación suave a 50-60 rpm. </li></ol> Parte 8: La hibridación Post-Lava Todos los lavados deben llevarse a cabo en la oscuridad o bajo luz baja. Las diapositivas no deben dejarse secar hasta que el último paso. <ol><li> Establecer una jarra de Coplin llena con solución de lavado # 1 @ 53 ° C, y cuatro platos de diapositivas de lavado llena con 250 ml de cada una de las siguientes: 1) Wcenizas Solución # 1 @ 53 ° C, 2) solución de lavado # 2 @ temperatura ambiente, 3 y 4) dos platos que contienen solución de lavado # 3 @ temperatura ambiente. </li><li> Retire con cuidado las diapositivas de las cámaras de hibridación y el lugar de dos en dos un momento en el frasco de Coplin. Dejar durante 30 segundos, luego levante la diapositiva a cabo lentamente y el deslizamiento elevador se mantendrá en el frasco. Colocar los portaobjetos en la gradilla para portaobjetos e inmediatamente sumergirse en la solución de lavado # 1 (1X SSC, 0,2% SDS, el precalentamiento a 43 ° C). Repita hasta que todos se retiran y se LifterSlips todas las diapositivas que vaya a lavar en la solución de lavado # 1 plato. Sumérgete en rack arriba y hacia abajo 10 veces con fuerza. </li><li> Plato a cabo en 53 ° C en el aire coctelera con agitación a 50 a 100 rpm durante 10 minutos. </li><li> Transferencia de rejilla para la solución de lavado # 2 (0,1 X SSC, 0,2% SDS), caída de 10 veces, y se incuban a temperatura ambiente, agitando lento durante 10 minutos. </li><li> Dip de rack de 15 veces en la primera solución de lavado # 3 (0.1X SSC) para eliminar cualquier residuo de SDS se transfieren de la solución de lavado # 2. Bastidor a cabo en la solución de lavado # 3 segundos platos, caída de 10 veces, y luego lenta agitación durante 10 minutos. </li><li> Colocar los portaobjetos en 50 ml tubos Falcon tope y girar @ rpm 1.500 en centrífuga equipada con un rotor basculante. Retirar los portaobjetos a la luz de contenedores a prueba, se utiliza otro tubo Falcon cubierta con papel de aluminio y de purga de aire del tubo de gas nitrógeno, tapa bien (lo que reduce la oxidación de los tintes Cy, especialmente Cy-5 en el verano cuando los niveles de ozono son más altos ). Las diapositivas se pueden almacenar durante un par de horas antes de la digitalización en los tubos de nitrógeno purgado, sin embargo, mejores resultados se obtienen cuando la señal de escaneo se realiza inmediatamente después del lavado. </li></ol> Parte 9: Recolección de datos y análisis estadístico <ol><li> Datos de escaneo de imagen se recoge en una ScanArray PerkinElmer. Nosotros usamos un valor de escaneo de 10 micras y el balance de Cy3 y Cy5 señales usando el método de ajuste de línea según las instrucciones del fabricante. </li><li> TIF son cuadriculados y los datos brutos de la señal recogida y filtrada con Imagene versión 7.5 (biodescubrimiento, Inc., El Segundo, CA) </li><li> La normalización de datos y evaluación para determinar estadísticamente especies válidas expresados ​​diferencialmente se hace con BRB matriz Ver herramientas. 3.7. </li><li> Análisis de patrones para facilitar la determinación de los genes expresados ​​de forma coordinada se realiza con el software de análisis de patrones de expresión génica (GEPAS) Ver. 3.1. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1182/Figure1_WWLorenz-1.png" alt="Figura 1" /> Figura 1. Ejemplo de PtGen2 serie procesados ​​con este l. PROTOCOLO DE <img src="/files/ftp_upload/1182/Figure2_WWLorenz.png" alt="Figura 2" /> Figura 2. Ejemplo de PtGen2 serie procesados ​​mediante hibridación estándar y protocolos de lavado.

<ol>
	<li>Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+stress-responsive+genes+in+loblolly+pine+(Pinus+taeda)+roots+identified+by+analyses+of+expressed+sequence+tag+libraries.">Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries.</a> Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).</li><li>Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> unpublished data. , .</li><li>Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+guide+to+cDNA+microarray+analysis.">A concise guide to cDNA microarray analysis.</a> Biotechniques. 29, 548-562 (2000).</li><li>Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESTs,+cDNA+microarrays,+and+gene+expression+profiling:+tools+for+dissecting+plant+physiology+and+development.">ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development.</a> The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).</li><li>Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gene+Expression+changes+in+Pinus+species+using+a+Loblolly+pine+cDNA+microarray.">Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray.</a> IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. , (2008).</li><li>Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+during+P.+pinaster+embryo+development.">Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development.</a> 7th Plant Genomics European Meeting. , (2008).</li></ol>

PtGen2 es un recientemente desarrollado, los microarrays de cDNA a medida que fue diseñado para ser utilizado principalmente por la comunidad de investigación de pino taeda. Los resultados preliminares generados hasta el momento han demostrado la matriz para ser una herramienta valiosa en la evaluación de los acontecimientos de la transcripción que se producen en respuesta a estrés por sequía, así como en el seguimiento de los cambios que se producen durante el desarrollo del embrión en el pino marítimo, Pi...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pre-hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt&#x2019;s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #1</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #2</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC, 0.2% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #3</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC</td>
</tr>
<tr>
<td>Isopropyl Alcohol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>34959-2.5L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352196</td>
<td>Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation</td>
</tr>
<tr>
<td>Coplin Jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Dish & Rack </td>
<td>Other</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
<td>Other</td>
<td>Sigma&#x2122;</td>
<td>A-9418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PolyA RNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>POLYA.GF</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling </td>
<td>Kit</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>L1014-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Turbo DNase</td>
<td>Kit</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1907</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-5 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA25001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-3 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA23001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LifterSlips&trade;</td>
<td>Other</td>
<td>Erie Scientific Company&#x2122; </td>
<td>25X601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HybChambers</td>
<td>Equipment</td>
<td>GeneMachines</td>
<td>JHYB200003</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

processing the loblolly pine ptgen2 cdna microarray

PtGen2 es un microarray de cDNA que contiene 26.496 función amplificada EST pino taeda. La serie es producida en nuestro laboratorio para su uso por los investigadores que estudian la expresión de genes en las especies de coníferas de pino y otros. PtGen2 se desarrolló como resultado de nuestros esfuerzos de descubrimiento de genes de pino de incienso, y se compone de secuencias identificadas principalmente de tejidos de la raíz, sino también de la aguja y el tallo. 1,2 PtGen2 ha sido probado por hibridación de diferentes tintes de Cy-etiquetados ADNc objetivo de coníferas , utilizando tanto amplificada y no amplificada, los métodos indirectos de etiquetado, y también probó con una serie de condiciones de hibridación y lavado. Este vídeo se centra en la manipulación y elaboración de las diapositivas antes y después de pre-hibridación, así como después de la hibridación, con algunas modificaciones a los procedimientos desarrollados con anterioridad. 3,4 También se incluyen, en forma de texto único, son los protocolos que se utilizan para la generación, el etiquetado y la limpieza de s objetivo cDNA, así como información sobre el software utilizado para el procesamiento de datos de salida. PtGen2 se imprime con un búfer de impresión de propiedad que contiene altas concentraciones de sal que puede ser difícil de eliminar por completo. Las diapositivas se lavan por primera vez en una cálida solución de SDS antes de la pre-hibridación. Después de pre-hibridación, las diapositivas se lavan con fuerza en varios cambios de agua para completar la eliminación de las sales restantes. LifterSlips ™ que se han limpiado y colocado en las diapositivas y etiquetados cDNA se carga en el cuidado de microarrays mediante una acción capilar que proporciona una distribución uniforme de la muestra a través de la diapositiva, y reduce la posibilidad de la incorporación de la burbuja. La hibridación de los objetivos de la matriz se realiza a 48 ° C en condiciones de alta humedad. Después de la hibridación, una serie de lavados estándar se realiza a 53 ° C y temperatura ambiente durante períodos prolongados. Procesamiento PtGen2 diapositivas utilizando esta técnica reduce la sal y la SDS-derivados artefactos a menudo se ve cuando la matriz se procesa con menos rigor. Hibridación de los objetivos derivados de varias fuentes diferentes de coníferas de ARN, el procesamiento del protocolo dado menos artefactos de fondo reducido, y proporcionan una mayor coherencia entre los diferentes grupos experimentales de arrays.

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Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

El cDNA microarrays PtGen2 fue desarrollado para estudios de expresión génica en el pino de incienso,<em&gt; P. taeda</em&gt;, Y otras especies de coníferas. Aquí, se muestra pre-y post-hibridación manejo y técnicas de lavado que se pueden utilizar con esta matriz para obtener una mejor consistencia, artefactos reducidos y menores fondos.

Procesamiento de los Pinus taeda PtGen2 cDNA microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

processing-the-loblolly-pine-ptgen2-cdna-microarray

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K vistas.  University of Georgia (UGA). El cDNA microarrays PtGen2 fue desarrollado para estudios de expresión génica en el pino de incienso, P. taeda, Y otras especies de coníferas. Aquí, se muestra pre-y post-hibridación manejo y técnicas de lavado que se pueden utilizar con esta matriz para obtener una mejor consistencia, artefactos reducidos y menores fondos.

Video: Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

Gibberella zeae ascósporas de producción y de recolección de experimentos de microarrays.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Investigación

Biología

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

La sonda de microfluidos: Operación y Uso de tratamiento de superficies localizadas

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Aislamiento del ARN de síntesis embrionarias pez cebra y el cDNA de análisis de expresión génica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Gene mundial y Análisis de Expresión utilizando una plataforma de microarrays de oligonucleótidos de pez cebra

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high concentrations of phenolic compounds and polysaccharides that interfere with RNA purification. Isolation of high-quality RNA from these species requires rigorous tissue collection procedures in the field and the employment of an RNA isolation protocol comprised of multiple organic extraction steps in order to isolate RNA of sufficient quality for microarray and other genomic analyses. The isolation of high-quality RNA from field-collected loblolly pine samples can be challenging, but several modifications to standard tissue and RNA isolation procedures greatly improve results. The extent of general RNA degradation increases if samples are not properly collected and transported from the field, especially during large-scale harvests. Total RNA yields can be increased significantly by pulverizing samples in a liquid nitrogen freezer mill prior to RNA isolation, especially when samples come from woody tissues. This is primarily due to the presence of oxidizing agents, such as phenolic compounds, and polysaccharides that are both present at high levels in extracts from the woody tissues of most conifer species. If not removed, these contaminants can carry over leading to problems, such as RNA degradation, that result in low yields and a poor quality RNA sample. Carryover of phenolic compounds, as well as polysaccharides, can also reduce or even completely eliminate the activity of reverse transcriptase or other polymerases commonly used for cDNA synthesis. In particular, RNA destined to be used as template for double-stranded cDNA synthesis in the generation of cDNA libraries, single-stranded cDNA synthesis for PCR or qPCR's, or for the synthesis of microarray target materials must be of the highest quality if researchers expect to obtain optimal results. RNA isolation techniques commonly employed for many other plant species are often insufficient in their ability to remove these contaminants from conifer samples and thus do not yield total RNA samples suitable for downstream manipulations. In this video we demonstrate methods for field collection of conifer tissues, beginning with the felling of a forty year-old tree, to the harvesting of phloem, secondary xylem, and reaction wood xylem. We also demonstrate an RNA isolation protocol that has consistently yielded high-quality RNA for subsequent enzymatic manipulations.

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Many plant tissues, including phloem and xylem from loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high levels of phenolics and polysaccharides that interfere with RNA purification. This presentation discusses techniques for the harvest of field-grown tissues and isolation of RNA of sufficient quality for microarrays and other genomic analyses.

Un método mejorado para el aislamiento de ARN a partir de pino taeda ( P. taeda L.) y otras especies de coníferas

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

Realización de experimentos de microarrays personalizados microARN

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been studied substantially using traditional two-dimensional techniques. Recent advancements in X-ray imaging technology via desktop micro-computed tomography (&#181;CT) and synchrotron radiation micro-computed tomography (SR&#181;CT) have allowed for the acquisition of high-resolution three-dimensional (3D) scans of a larger field of view (FOV) than other 3D imaging techniques (e.g., SEM) providing a more complete picture of microscopic structures within human cortical bone. The specimen should be accurately centered within the FOV, however, to limit the appearance of streak artifacts known to impact data analysis. Previous studies have reported procurement of irregularly shaped rectilinear bone blocks that result in imaging artifacts due to uneven edges or image truncation. We have applied a geological sampling protocol (coring) to procure consistently sized cortical bone core specimens for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This coring method is efficient and minimally destructive to tissue. It creates uniform cylindrical samples that decrease imaging artifacts by nature of being isometric during rotation and providing a uniform path length for X-ray beams throughout scanning. Image processing of X-ray tomographic data of cored and irregularly shaped samples confirms the potential of the technique to improve visualization and analysis of cortical bone microarchitecture. A goal of this protocol is to deliver a reliable and repeatable method for the extraction of cortical bone cores that is adaptable for various types of high-resolution bone imaging experiments. An overarching goal of the work is to create a standardized cortical bone procurement for SR&#181;CT that is affordable, consistent, and straightforward. This procedure may further be adapted by researchers in related fields who commonly evaluate hard composite materials such as in biological anthropology, geosciences, or material sciences.

We employed a geological (coring) sampling protocol to procure cortical bone specimens of uniform size for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This method is minimally destructive, efficient, results in cylindrical specimens that minimize imaging artifacts from irregular sample shapes and improves microarchitectural visualization and analysis.

Una guía de sección, corte y procesamiento de imágenes para adquisición y análisis de muestras óseas corticales de alto rendimiento para Micro-TC sincrotrón

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

Elucidación de la estructura y ocurrencia de glicanos mediante perfiles de polímeros de microarrays

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans and glycoconjugates within a variety of biological samples, including plant and algal tissues, food materials, and human, animal, and microbial samples. Microarray technology underpins the efficacy of this method by providing a miniaturized, high-throughput screening platform, allowing thousands of interactions between glycans and highly specific glycan-directed molecular probes to be characterized concomitantly, using only small amounts of analytes. Constituent glycans are chemically and enzymatically fractionated, before being sequentially extracted from the sample and directly immobilized onto nitrocellulose membranes. The glycan composition is determined by the attachment of specific glycan-recognizing molecular probes to the extorted and printed molecules. MAPP is complementary to conventional glycan analysis techniques, such as monosaccharide and linkage analysis and mass spectrometry. However, glycan-recognizing molecular probes provide insight into the structural configurations of glycans, which can aid in elucidating biological interactions and functional roles.

Autor destacado: Protocolo MAPP - Avance del análisis de glicanos 

Microarray polymer profiling (MAPP) is a high-throughput technique for compositional analysis of glycans in biological samples.

Perfil de polímeros de microarrays (MAPP) para análisis de glicanos de alto rendimiento

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...