Los autores desean agradecer a la Dra. Deirdre Nelson por sus valiosos comentarios y para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por el NIH subvenciones DE019244, DE019197 y DE021841 a ML, F32DE02098001 a SJS, y RR015464 C06 a la Universidad de Albany, SUNY.

El protocolo contiene cuatro etapas principales, como se representa en la figura 1. Todos los pasos se describen con todo detalle. Construcción de adenovirus y la purificación viral se debe realizar antes de la extracción de órganos para su uso en la transducción genética de diseccionados rudimentos epiteliales. Todos los estándares BSL-2 medidas de seguridad se deben seguir cuando se trabaja con adenovirus. 1. Embrionarias de ratón glándula submandibular (SMG) Recolección y microdisección <ol><li> Eutanasiar cronometrado embarazadas ratones hembra (cepa consanguínea CD-1 o ICR) utilizando CO 2 narcosis, seguido por dislocación cervical y cadenas de cosecha de embriones de ratón en el día embrionario 13 (E13, 3-5 papilas epiteliales) siguientes procedimientos aprobados por el IACUC institucional comité. El día del descubrimiento de tapón vaginal se designa como E0. Las glándulas salivales también pueden ser cosechados y cultivados en la etapa E12 cuando hay un solo brote primario y tallo con hendiduras empezandoa iniciar. Subfusiles antes de esta etapa requieren diferentes condiciones de cultivo de las indicadas aquí. </li><li> Transferir cadenas de embriones en estériles de 10 placas de cultivo cm de tejido llena de 25 ml de DMEM / Ham &#39;s F12 (F12) que carecen de rojo fenol (Life Technologies) suplementado con 100 U / ml de penicilina, y 100 ug / ml de estreptomicina (pen-strep, Life Technologies). </li><li> Con un bisturí estéril (# 11 cuchillas) y pinzas (# 5, Herramientas de Bellas ciencia, 11252-20), la toma de embriones a partir de los sacos en un plato separado 10 cm que contiene 25 ml de DMEM/F12 + pen-strep. </li><li> Cortar las cabezas de embriones con un corte en ángulo justo debajo de la mandíbula inferior. </li><li> Aislar las mandíbulas inferiores de las cabezas bajo un microscopio de disección estéreo con una base de luz transmitida (Nikon SMZ645 o equivalente) con un corte por debajo de la mandíbula superior. Colocar los tejidos en la parte superior de una pieza extra de vidrio en lugar de directamente sobre el componente de vidrio de la base del microscopio. </li><li> Recoge las mandíbulas inferiores a 3 ml de DMEM/F12 + pen-strep en una estéril 35 mm plato de cultivo de tejidos. </li><li> Colocar una rodaja mandíbula sobre la platina del microscopio de disección para que la lengua está en la parte inferior de la rebanada pero está apuntando hacia la posición de las 12:00. </li><li> Usando un lado de dos pinzas cruzadas en una especie de tijera, retire y deseche la rd 1/3 inferior de la porción mandibular. </li><li> Girar la rebanada 90 ° a la derecha (si es diestro) y, usando un corte de tijera con los fórceps, cortar la parte superior de la rebanada mandíbula (sin cortar la lengua) hasta la mitad en la rebanada. </li><li> Pelar el exceso de tejido y retirar a exponer las metralletas debajo. Habrá una en cada lado cerca de la base de la lengua. </li><li> Con un par de pinzas para sujetar el tejido de la lengua, utilizar las pinzas para molestar a los demás SMG lejos de la lengua. Repita el procedimiento para la otra glándula. </li><li> Recoger las glándulas salivales microdissected en 3 ml de DMEM/F12 + pen-strep en un nuevo tejido estéril mm 35cultura plato. Nota: las glándulas submandibulares más grandes (3-5 yemas epiteliales), junto con la glándula más pequeña conectada sublingual (1 yema) se pueden cultivar intacto por saltarse el paso 4 y de realizar los pasos 4,1, 4,3 y 4,4, como se ha descrito previamente 2,8. </li></ol> 2. SMG Separación rudimento epitelial <ol><li> Place 5 (o más) las glándulas salivales en un fondo de vidrio, 50 mm diámetro del plato de micropocillos (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) que contiene 200 l de solución salina equilibrada de Hank (HBSS carece Ca + + o Mg + +, Life Technologies) que contenía 0,4% (v / v) dispasa (Life Technologies, cat. no. 17,105-041) e incubar durante 15 min a 37 ° C. </li><li> Después de la incubación, usando una punta de pipeta estéril 200 l, aspirar con cuidado a la solución de dispasa sin perturbar las glándulas. Añadir inmediatamente 200 l de medio DMEM/F12 que contiene 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, pre-esterilizado con un filtro de 0,22 micras) para neutralizar la dispasa. </li> &lt;li&gt; Bajo un microscopio de disección, usando un par de pinzas con puntas finas (# 5 Dumostar, herramientas finas Science, 11295-20), suavemente separar el mesénquima alrededor de aflojado de las papilas epiteliales SMG y conductos, teniendo cuidado de dejar el epitelio intacto . </li><li> Humedezca previamente una punta de pipeta estéril 200 ml con DMEM/F12-BSA medios de comunicación y pipetear suavemente los rudimentos epiteliales en un nuevo 50 mm diámetro del plato de micropocillos que contiene 200 l de DMEM/F12 + pen-strep. Utilice una alta calidad de 200 l punta de la pipeta con un borde liso. </li><li> En el plato que contiene las piezas mesénquima, desechar cualquier tejido no-mesenquimal incluyendo las glándulas sublinguales y las glándulas submandibulares yemas separadas. </li></ol> 3. La infección adenoviral de Rudimentos epiteliales <ol><li> Hacer 200 l de medios de infección viral mediante la dilución del adenovirus de interés en DMEM/F12 + pen-strep en un tubo de microcentrífuga de modo que el título de la solución resultante es 1x10 8 -10 9 PFU. Latítulo óptimo requerido para diferentes virus puede variar. Es importante utilizar cloruro de cesio (CsCl)-preparaciones purificadas virales para la eficacia de la absorción óptima. </li><li> Retire el material de la cápsula que contiene las cinco rudimentos epiteliales. Añadir rápidamente 200 l de los medios de comunicación de infección, manteniendo los rudimentos húmedo en todo momento. Tome las precauciones necesarias al manipular el virus y la eliminación de puntas de pipeta contaminados. Desinfecte las superficies contaminadas con virus con la solución de lejía al 10%. </li><li> Mover los rudimentos epiteliales lejos el uno del otro con pinzas para evitar que se peguen entre sí y permitir que se depositen en el fondo de la placa. Incubar rudimentos en medios virales durante 1 hora a temperatura ambiente. Durante la incubación, separar los rudimentos, si se mueven juntos. Balanceo excesivo o movimiento permitirá a las glándulas para agruparse. </li><li> Después de la incubación, retire con cuidado los medios de comunicación viral que contienen y deseche adecuadamente, teniendo cuidado de no alterar la rudiments. Añadir 200 l de DMEM/F12 + pen-strep. Repita este lavado por lo menos dos veces más y reemplazar con 200 l de DMEM/F12 + pen-strep medios de comunicación. Estos lavados son fundamentales para eliminar cualquier virus que no está fuertemente unida al epitelio y para prevenir la infección del mesénquima. </li><li> Incubar rudimentos epiteliales con 200 ml de DMEM/F12 que contiene 2% (v / v) de Matrigel (BD Biosciences, 356.231) durante 20 min. Encontramos que este corto de incubación en Matrigel minimiza la regresión de las hendiduras existentes durante el período inicial de cultivo, pero este paso puede obviarse si la exposición a Matrigel no se desea. </li></ol> 4. Ex Culture in vivo de subfusiles recombinados <ol><li> Colocar cada rudimento, uno a la vez, usando una pre-mojado punta de pipeta 200 l, en la parte superior de una muesca (pequeño corte) 13 mm, 0,1 micras Nuclepore Track-Etch membrana de filtro (Whatman) flotando sobre 200 l de medio de cultivo ( 5 rudimentos / filtro) en una placa de vidrio con fondo de pocillos de microtitulación. Los medios de cultivoes: DMEM/F12 + pen-strep que contenía 50 mg / ml de transferrina y 150 ug / ml de ácido ascórbico, como se ha descrito previamente 2,8. La transferrina se sabe que estimula la supervivencia y morfogénesis de ramificación de explantes de glándula salival y otros órganos 9. La adición de ácido ascórbico se ha demostrado que estimula la ramificación SMG. 10 Se sabe que actúa como un cofactor en muchas reacciones de hidroxilación de vías metabólicas (tales como hidroxilación de prolina durante la formación de fibras de colágeno 11) y también estimula la producción de fibronectina y la laminina en explantes de otros órganos 12. </li><li> Eliminar como muchos medios en la parte superior del filtro como sea posible después de añadir cada rudimento epitelial. Medios demasiado en la parte superior del filtro puede hacer que el filtro a hundirse, mientras que menos medios de comunicación hace que la colocación de los rudimentos y mesénquima mucho más fácil. El exceso de medios de comunicación se puede eliminar con una punta de pipeta o utilizando pinzas para sujetar el papel entre las puntas. </li><li> Coloque las piezas de mesénquima derivado from tres y cincuenta y siete glándulas en la parte superior y / o alrededor de cada rudimento epitelial. Quite todos los medios adicionales que se rodean las glándulas para evitar el movimiento del mesénquima lejos de los rudimentos. Mesénquima derivado de más glándulas no es beneficiosa, pero puede ser menos perjudicial para el crecimiento rudimento epitelial. </li><li> Incubar metralletas recombinados en un incubador humidificado (95% aire / 5% CO 2) a 37 ° C durante 48 -72 horas, según se desee. </li><li> Adquirir claro y / o imágenes fluorescentes de glándulas en vivo a 0 horas (si se desea), 2 h después de la recombinación y cada 24 horas a partir de entonces en un microscopio de luz invertida, en posición vertical, o estéreo equipado con una cámara digital con un objetivo de aumento 4X o 5X para capturar la glándula recombinada todo en un solo marco de vista. Las imágenes de la glándula salival mostrar el mejor contraste utilizando el ajuste campo claro o el anillo de fase apropiado colocado a medio camino en la trayectoria de la luz (lo cual no es posible en totalmente automatizados microscopios). Contraste de fase estándar es not necesario ya que la glándula esté espesa y crea contraste. </li><li> En los puntos de tiempo deseados, subfusiles recombinados se puede fijar durante 20 minutos con la solución de fijación hechos de 2% de paraformaldehído (PFA) en 1X PBS que contenía 5% (w / v) de sacarosa (para mantener la mejor estructura celular interna, manteniendo las células en un estado isotónico). A diferencia de PFA al 4%, 2% PFA conservará una cantidad significativa de la señal de GFP si el fijador se elimina por completo después de la fijación. Las glándulas se pueden almacenar durante hasta 1 semana en 1X PBS en la oscuridad a 4 ° C hasta que toda la inmunocitoquímica y montaje de imagen confocal se lleva a cabo, como se informó anteriormente 3,6,13-15. Idealmente, inmunocitoquímica y de imagen se debe realizar poco después de la fijación de obtener imágenes con la mejor calidad. Glándulas también pueden ser lisadas en tampón RIPA por SDS-PAGE seguida por análisis de Western Blot. </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

El ex vivo epitelial-mesenquimal técnica de recombinación fue publicado por primera vez por las glándulas salivales submandibulares en 1981 16. En este protocolo, se expanda en el método original, usando infección adenoviral para manipular la expresión génica de células epiteliales en el contexto de una glándula recombinado. Se demuestra que un porcentaje de las células epiteliales están infectadas con el adenovirus, mientras que el porcentaje de células que están infectadas depende de l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DMEM / Ham &#39;s F12 medio sin rojo de fenol </td><td> Life Technologies </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina y Estreptomicina </td><td> Life Technologies </td><td> 15070-163 </td><td> Valores 10 veces </td></tr><tr><td> Dispasa </td><td> Life Technologies </td><td> 17105-041 </td><td> Congele solo uso alícuotas a -20 º C. </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A2934-100G </td><td> Fracción V, endotoxinas bajo </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> Debe ser alto título (1x10 10 pfu / ml). CsCl virus purificados son más eficaces que la columna virus purificados en este ensayo. </td></tr><tr><td> 16% de paraformaldehído </td><td&gt; Ciencias de Microscopía Electrónica </td><td> 15710 </td><td> Diluido al 2% en PBS con 5% de sacarosa (w / v) </td></tr><tr><td> 1X tampón fosfato salino (PBS) </td><td> Life Technologies </td><td> 70011-044 </td><td> Preparado a partir de valores 10 veces </td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hank </td><td> Life Technologies </td><td> 14175095 </td><td> sin calcio, magnesio no, no rojo de fenol </td></tr><tr><td> Transferrina </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td> 25 mg / ml de solución madre en medio DMEM/F12. Congelar solo uso alícuotas a -20 º C. </td></tr><tr><td> L-ácido ascórbico (vitamina C) </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td> 75 mg / ml de solución madre en DMEM/F12 media.Freeze solo uso alícuotas a -20 º C. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 1. Lista de los reactivos necesarios para SMG protocolo de recombinación. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 cm de platos de plástico estériles </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Placas de cultivo de tejido no-tratados también se puede utilizar. </td></tr><tr><td> Microscopio de disección estéreo con base de luz transmitida </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> Cualquier estéreo microscopio de disección puede ser utilizado que tiene una base de luz transmitida. </td></tr><tr><td> 35 mm placas de cultivo de tejidos </td><td> Halcón </td><td> 353001 </td><td> Placas de cultivo de tejido no-tratados también se puede utilizar. </td></tr><tr><td> 50 mm de diámetro micropocillos platos </td><td> MatTek Corporación </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch filtros de membrana </td><td> Whatman </td><td> 110405 </td><td> 13 mm de diámetro, 0,1 mm de tamaño de poro </td></tr><tr><td> Widefield microscopio de fluorescencia </td><td> Carl Zeiss, EE.UU. </td><td> Axio Observer Z1 </td><td> Cualquier microscopio de fluorescencia (vertical, inverted o estéreo microscopio de disección) se puede utilizar para controlar la expresión de GFP a bajo aumento con una cámara digital conectada. </td></tr><tr><td> Microscopio confocal </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> La microscopía confocal es necesario ver estructuras detalladas celulares. Cualquier microscopio confocal se puede utilizar. </td></tr><tr><td> El tiempo-ratones hembra embarazadas, cepa CD-1 o ICR </td><td> Charles River Labs </td><td></td><td> Los embriones se recogieron en el día 13 (día de descubrimiento con enchufe designado como día 0). </td></tr><tr><td> Hoja de bisturí # 11 </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Mango de bisturí n º 3 </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 pinzas inox aleación, 0.05mm 0.02mm X </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11252-20 </td><td> Ideal para la recolección de glándulas a partir de embriones </td></tr><tr><td&gt; Dumont # 5 fórceps dumostar aleación, 0.05mm 0.01mm X </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11295-20 </td><td> Puntas finas son necesarias para la eliminación de mesénquima de epitelio. Agujas de tungsteno también se puede utilizar. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 2. Equipos utilizados en SMG protocolo de recombinación. </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

La morfogénesis de ramificación se produce durante el desarrollo de muchos órganos, y la glándula submandibular del ratón embrionario (SMG) es un modelo clásico para el estudio de la morfogénesis de ramificación. En la SMG desarrollo, este proceso implica pasos iterativos de brote epitelial y la formación del conducto, en última instancia, para dar lugar a una compleja red ramificada de acinos y conductos, que sirven para producir y modificar / transportar la saliva, respectivamente, en la cavidad oral de 1 - 3. La membrana basal epitelial asociada y los aspectos de la compartimiento mesenquimal, incluyendo las células del mesénquima, factores de crecimiento y la matriz extracelular, producidas por estas células, son críticos para el mecanismo de ramificación, aunque la forma de los acontecimientos celulares y moleculares están coordinados sigue siendo poco conocida 4 . El estudio de los mecanismos moleculares de conducción avances epiteliales morfogénesis nuestra comprensión de los mecanismos de desarrollo y da una idea de posible regeneraraproximaciones creativas medicina. Tales estudios se han visto obstaculizados por la falta de métodos eficaces para la manipulación genética del epitelio salival. Actualmente, la transducción adenoviral representa el método más eficaz para atacar a las células epiteliales de las glándulas adultos in vivo 5. Sin embargo, en los explantes de embriones, mesénquima y densa de la membrana basal que rodea las células epiteliales impide el acceso viral a las células epiteliales. Si el mesénquima se retira, el epitelio puede ser transfectadas utilizando adenovirus, y rudimentos epiteliales puede reanudar la morfogénesis de ramificación en presencia de Matrigel o laminina-111 6,7. Mesénquima crecimiento libre de rudimento epitelial también requiere suplementos adicionales con factores de crecimiento solubles y no completamente recapitular la morfogénesis de ramificación ya que se produce en las glándulas intactas 8. Aquí se describe una técnica que facilita la transducción adenoviral de las células epiteliales y la cultura de la e transfectadaspithelium con mesénquima asociado. Después de la microdisección de los subfusiles embrionarias, la eliminación de la mesénquima, y ​​la infección viral del epitelio con un adenovirus que contiene GFP, se muestra que el epitelio espontáneamente recombina con mesénquima no infectada, recapitulando intacta la estructura glandular SMG y la morfogénesis de ramificación. La población de células epiteliales modificadas genéticamente pueden controlarse fácilmente utilizando métodos estándar de microscopía de fluorescencia, si fluorescentemente etiquetados construcciones adenovirales se utilizan. El método de recombinación de tejidos descrito aquí es actualmente el método más eficaz y accesible para la transfección de células epiteliales con un vector de tipo salvaje o mutante dentro de una construcción de tejido complejo 3D que no requiere la generación de animales transgénicos.

El flujo de las etapas experimentales principales se describen en la Figura 1. Un ejemplo de un SMG intacto, un rudimento epitelial aislado, y su mesénquima correspondiente se muestra en la Figura 2. Imágenes de campo claro subfusiles recombinados, que siguen a someterse a la morfogénesis de ramificación cuando cultivadas ex vivo durante los tiempos indicados, se muestran en la Figura 3. Glándulas recombinados cultivadas durante 48 horas epitelial que expr...

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Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Una técnica para manipular genéticamente las células epiteliales dentro de toda<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivadas de embriones de ratón glándulas submandibulares (SMG) con transferencia génica viral se describe. Este método se aprovecha de la capacidad innata de SMG epitelio y el mesénquima para recombinarse espontáneamente después de la separación y la infección de rudimentos epiteliales con vectores adenovirales.

Modificación genética y recombinación de las Glándulas Salivales culturas de órganos

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

genetic-modification-recombination-salivary-gland-organ

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K vistas.  University at Albany, SUNY. Una técnica para manipular genéticamente las células epiteliales dentro de toda Ex vivo Cultivadas de embriones de ratón glándulas submandibulares (SMG) con transferencia génica viral se describe. Este método se aprovecha de la capacidad innata de SMG epitelio y el mesénquima para recombinarse espontáneamente después de la separación y la infección de rudimentos epiteliales con vectores adenovirales.

Video: Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

La disección de las glándulas salivales y del intestino medio de Ae. aegypti

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Investigación

Biología

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Preparación de 2-dGuo cultivos tratados con órganos timo

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Aislamiento de células de la glándula salival del ratón madre

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

La metilación del ADN: Bisulfito de modificación y análisis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Culturas alternativas para Pluripotentes Stem Cell Production, mantenimiento y análisis genético

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

ADN electroporación, aislamiento e Imagen de miofibras

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.

Modificación genética de las cianobacterias por conjugación utilizando el kit de herramientas de clonación modular CyanoGate

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and the Plasmodium parasites that cause malaria, accumulate in the secretory cavities of SG cells. Here, they are poised for transmission to their vertebrate hosts during a subsequent blood meal. As adult glands form as an elaboration of larval SG duct bud remnants that persist beyond early pupal SG histolysis, the larval SG is an ideal target for interventions that limit disease transmission. Understanding larval SG development can help develop a better understanding of its morphology and functional adaptations and aid in the assessment of new interventions that target this organ. This video protocol demonstrates an efficient technique for isolating, fixing, and staining larval SGs from Anopheles gambiae mosquitoes. Glands dissected from larvae in a 25% ethanol solution are fixed in a methanol-glacial acetic acid mixture, followed by a cold acetone wash. After a few rinses in phosphate-buffered saline (PBS), SGs can be stained with a broad array of marker dyes and/or antisera against SG-expressed proteins. This method for larval SG isolation could also be used to collect tissue for in situ hybridization analysis, other transcriptomic applications, and proteomic studies.

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

The adult mosquito salivary gland (SG) is required for the transmission of all mosquito-borne pathogens to their human hosts, including viruses and parasites. This video demonstrates efficient isolation of the SGs from the larval (L4) stage Anopheles gambiae mosquitoes and preparation of the L4 SGs for further analysis.

Disección e inmunotinción de glándulas salivales larvales de mosquitos Anopheles gambiae

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...