Generar modelos celulares primarios o estructuras organoides es clave para responder a muchas preguntas contemporáneas en biología. Por ejemplo, hemos estado interesados durante bastante tiempo en los mecanismos utilizados por los virus humanos para facilitar la replicación en la glándula salival, ya que es un sitio importante para la transmisión horizontal. El desarrollo del sistema basado en salisfera descrito en este protocolo es un avance crucial en nuestra búsqueda de responder a este tipo de preguntas.
Esta técnica nos permite generar células primarias a partir de una variedad de muestras de pacientes diferentes. Los modelos celulares recuerdan más a la situación del tipo in vivo, ya que las células no se modelan ni transforman como muchos tipos de células comúnmente utilizados para experimentos in vitro. Hemos utilizado este protocolo para generar células similares a partir de la glándula submandibular primaria del ratón y el protocolo probablemente sería útil para otros órganos con estructuras celulares similares.
Dentro de dos a cuatro horas después de la extracción del paciente, en una placa de cultivo, utilice tijeras diseccionadas esterilizadas autoclaves y fórceps quirúrgicos para picar el tejido de la glándula salival en trozos finos del tamaño de uno a dos milímetros. Añadir seis mililitros de la solución de Dispase/Collagenase al tejido picado. Luego incubar a 37 grados centígrados durante aproximadamente 30 minutos a una hora.
Interrumpir el tejido pipeteando con una pipeta serológica de cinco mililitros de 15 a 20 veces. Incubar a 37 grados centígrados durante otros 30 minutos a una hora. Repita el pipeteo y la incubación paso de dos a tres veces más o hasta que el tejido se asemeje a una suspensión y pueda pasar fácilmente a través de la abertura de la pipeta.
Para cubrir pozos con BMM, pipetee lentamente 500 microlitros de BMM descongelado durante la noche en cada pozo de una placa de seis pozos. Gire lentamente la placa para distribuir uniformemente el BMM sobre los pozos. A continuación, incubar las placas recubiertas a 37 grados Centígrados durante al menos 15 minutos antes de su uso para permitir que la MMC se solidifique.
En primer lugar, transfiera la solución dispase/Collagenase que contiene tejido homogeneizado a un tubo cónico de 15 mililitros. Lave la pared de la placa una vez con seis mililitros de DPBS para transferir las células restantes al tubo cónico. Luego, a través de un colador de células de malla de nylon de 70 micrómetros, filtre el homogeneato en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros para eliminar el tejido no digerido.
Centrifugar las células tensadas durante cinco minutos a 500 veces g. Aspirar al sobrenadante. A continuación, resuspender el pellet celular en 10 mililitros de 1X tólilis de RBC tampón.
Incubar durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Luego agregue de 20 a 25 mililitros de DPBS para neutralizar el búfer de la lesis RBC y minimizar la lysis de las células salivales. Centrifugar durante cinco minutos a 500 veces g.
El pellet de células blancas indica la lelisis completa de todo el RBC. Si el pellet tiene color rojo, repita el tratamiento con tampón de lyis RBC. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en uno a dos mililitros de BEGM y luego transferir las células resuspendidas a pozos recubiertos de BMM.
Incubar a 37 grados centígrados. Una vez chapadas en BMM, las células se formarán en estructuras esféricas o saliesferas durante un período de dos a tres días. Las células se pueden mantener como saliesferas durante unos cinco a siete días antes de que el BMM comience a degradarse permitiendo que las células accedan y se adhieran al plástico y crezcan como una monocapa.
En primer lugar, aspirar los medios de los pozos y añadir un mililitro de solución dispase/Collagenase a cada pozo. Incubar a 37 grados centígrados durante aproximadamente 15 minutos o hasta que BMM se haya disuelto en su mayoría. Luego transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros y lave los pozos una vez con uno a tres mililitros de DPBS para obtener las células restantes.
Centrifugar durante cinco minutos a 500 veces g. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en dos mililitros de Trypsin. Incubar de nuevo a 37 grados centígrados durante 15 minutos.
A continuación, agregue al tubo cualquier medio completo que contenga 10% de suero para neutralizar la Tripsina. Centrifugar durante cinco minutos a 500 veces g. Aspirar el sobrenadante para eliminar los medios residuales, la trippsina y el suero y luego resuspender las células en DPBS.
Centrifugar durante cinco minutos a 500 veces g. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en BEGM. Para mantener el pellet como esferas, plato las células resuspendidas en platos de cultivo recubiertos de BMM solidificados.
Cultivo de todas las células en una incubadora humidificada mantenida a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante cinco a siete días antes de la subcultor. Alimentar con BEGM fresco cada dos o tres días. Para proliferar las células como monocapa en platos de cultivo plástico, aspirar los medios BEGM del plato y lavar una vez con DBPS para eliminar los medios residuales.
Añadir dos mililitros de Trypsin e incubar a 37 grados Celsius durante 15 minutos o hasta que las células se hayan desprendido por completo. Neutralizar la trippsina utilizando cuatro mililitros de cualquier medio completo que contenga 10% de suero. Luego incline suavemente el plato y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros.
Lave la placa una vez con aproximadamente cinco mililitros de DPBS para recoger las células restantes. Centrifugar durante cinco minutos a 500 veces g. Aspirar al sobrenadante.
Para eliminar medios residuales, resuspender las células en seis a 10 mililitros de DPBS. Centrifugar durante cinco minutos a 500 veces g. Aspirar el sobrenadante y resuspend en BEGM.
A continuación, plato de las células en los platos de cultivo de tejido plástico tratado. Cultivo de las células en una incubadora humidificada mantenida en 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante cinco a siete días antes de la subcultor. Alimentar con BEGM fresco cada dos o tres días.
En este protocolo, después de enchapar las células del tejido digerido en BMM durante dos a tres días, las células formaron fácilmente pequeños racimos que continuaron expandiéndose en tamaño hasta 15 a 20 células por racimo. Las células saliesferas fueron chapadas en plástico tratado cultivado en células y cultivadas como una monocapa donde exhiben morfología consistente con células de origen epitelial. Se necesita una técnica y un cuidado asépticos adecuados para evitar la contaminación bacteriana o fúngica.
Ninguna cantidad de antibióticos o antimicóticos salvará un cultivo lleno de microbios. Estamos respondiendo preguntas sobre la patogénesis viral y la transmisión. Pero para otros, esto proporciona una manera de estudiar las células salivales humanas para cualquier número de aplicaciones tales como terapias de regeneración de tejidos.
Para nosotros que estudiamos el citomegalovirus humano, esta técnica nos ha permitido comenzar a explorar los mecanismos moleculares que el virus utiliza para infectar y, en última instancia, transmitir a nuevos huéspedes. Nada de lo utilizado en este protocolo es inherentemente peligroso, pero siempre se debe tener precaución al manipular el tejido humano y cualquier tipo de reactivos químicos.
