Esta investigación fue financiada con fondos de la Universidad de Yale y el Instituto de Clima y Energía de los EE.UU. National Science Foundation.

1. Grasshoppers cría bajo tensión y estrés Condiciones gratis <ol><li> Utilice circular 0,5 m 2, mesocosmos cerrados para prevenir la emigración o la inmigración de especies animales (Figura 1). Construir mesocosmos utilizando longitudes de 2,4 m de 1,5 m de altura ¼ &quot;cerca de malla de aluminio como un andamio. Cubra la esgrima con 2,5 m de largo 1,75 m de altura cribado ventana de aluminio plegada sobre la parte superior e inferior de la esgrima y grapadas a lo largo de veces. Únete a la esgrima extremos para formar un círculo cerrado y grapado la ventana de superposición de cribado para crear un sello. Ajuste el mesocosmos en el suelo en el terreno por excavar unos 10 cm de profundidad por 4 cm de ancho foso alrededor de la base del mesocosom, se hunden en el mesocosmos la zanja y luego apisonar el césped de la zanja alrededor de la parte hundida del mesocosmos. Staple una pieza circular de investigación de la ventana a la parte superior del mesocosmos. </li><li> Mesocosmos matriz en una replica desig emparejado experimentalN en el campo. Ubicaciones parcela debe ser seleccionado para que coincida con la identidad de la especie vegetal y cobertura en planta. Fregadero jaulas de 10 cm en el suelo en el lugar de parcela. </li><li> Utilizando una red de barrido, recoja los primeros (2 ª) instar ninfas de saltamontes y almacenarlos en los mesocosmos con densidades naturales de campo. </li><li> Utilizando una red de barrido, la captura de individuos de una dominante sentarse y esperar la caza (no web tejido) araña especies de depredadores. Cola cerró la araña quelíceros (piezas bucales utilizados para someter a presas) con cemento rápido a efectos de riesgo desconectados de la selección actual favorece la supervivencia saltamontes individuales con mejores habilidades para evadir la depredación de araña. Almacene las arañas a densidades de campo a un mesocosmos de cada par. Este será el tratamiento de estrés. Mesocosmos sin arañas será el tratamiento libre de estrés. </li><li> Permita que las ninfas de saltamontes para desarrollar a finales de (4 º y 5 º) etapas estadio. Recoge todas las personas de las jaulas y RAndomly asignar a los individuos de cada jaula a uno de tres grupos de ensayo siguientes: (1) la validación de estado de estrés fisiológico, (2) la validación del cambio de cuerpo estequiometría elemental, (3) la descomposición microbiana. </li></ol> 2. Validación Saltamontes estado de estrés <ol><li> Medir la tasa metabólica estándar saltamontes (SMR), como la tasa de emisión de dióxido de carbono ( <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> ) En un flujo a través incurrentes sistema de respirometría con un caudal de aire de 200 ml / min. Retirar el vapor de agua haciendo pasar el aire que fluye a través de un agente de secado. </li><li> A raíz de la privación de alimentos de 16 horas (el agua debe estar disponible), pese saltamontes individuales (± 0,1 mg), y colocarlos en transparente 50 ml (9,2 cm de largo x 2,0 cm D) cámaras respirómetro y les permite recuperarse de manejar por lo menos 10 min antes de inicio de las mediciones. </li><li> Bajo constante temperatura ambiente promedio<html> temperatura (temperatura de ± 1% de variación del error estándar) dentro de la cámara respirómetro, analizar aire respirado con una infra-rojo analizador de CO 2 (por ejemplo Qubit S151-1 resolución ppm). Mida la media mínima en estado estacionario <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> durante 10 min. </li><li> El analizador ofrece CO 2 fraccionado concentración (partes por millón), pero SMR debe ser reportado como una tasa, por lo que hay que transformar las grabaciones <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> FR = i ( <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> - <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq3.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq3highres.jpg"/> ) / {1 - <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> [1 - (1/RQ)]}, dondeiles/ftp_upload/50061/50061eq3.jpg &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50061/50061eq3highres.jpg &quot;/&gt; = concentración incurrentes fraccional de CO 2; <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> = Concentración excurrent fraccional de CO 2; FR = caudal (ml min -1); RQ = cociente respiratorio, que se supone igual a 0,85 en los animales herbívoros. </li></ol> 3. Shift validación en Estequiometría Cuerpo Elemental <ol><li> Evaluar carbono: nitrógeno (C: N) contenido de una muestra de saltamontes recogidos de los mesocosmos de campo. </li><li> Reducir la variación en C: N debido al consumo reciente de alimentos mediante la eliminación de los contenidos intestinales saltamontes bajo un microscopio de disección. </li><li> Liofilizar el intestino vacío y el cuerpo durante 48 horas y luego moler la canal individual y tripa a un polvo homogéneo. </li><li> Medida C: contenido de N del polvo usando un autoanalizador CNH. </li></ol> 4.La descomposición microbiana <ol><li> Place replicado pares de collares de PVC (15,4 cm de diámetro., Insertado ~ 4 cm en el suelo) en el sitio de campo (Figura 3C). Quite toda la vegetación en su interior a través de la saturación en la superficie del suelo. Estos collares se usan para las medidas de descomposición. Además, establecer un conjunto de collares de PVC en todo el sitio del campo para que actúe como 13 C natural abundancia controles (ver más abajo), a la que ni los grillos, ni hierba, hojarasca se agregan. </li><li> Para un collar en cada par añadir 2 intactos, liofilizados cadáveres de saltamontes (registrar la biomasa original) criados con riesgo depredador como se ha descrito anteriormente, utilizando jaulas de campo. Al otro collar en cada par añadir 2 intactos liofilizados cadáveres criados sin riesgo depredador. </li><li> Cubra los collares de PVC con una pantalla para evitar la extracción saltamontes por los carroñeros de las parcelas y dejar que los cadáveres se descomponen saltamontes durante 40 días. </li><li> Mientras los cadáveres se descomponen, etiqueta hierba-litter con 13 C. <ol><li> Construir una cámara de plexiglás transparente (60 cm x 60 cm x 1,5 m) con una entrada y una válvula de salida (Figura 3B). </li><li> Hunde un cuadrado de 60 cm x 60 cm marco de madera con un sello de goma cubierta con grasa de silicona 5 cm en el suelo (Figura 3B). </li><li> Deslice la cámara en la parte superior de la estructura de madera de modo que la cámara se vuelve sellado por el caucho (Figura 3B). </li><li> Conectar las entradas de cámara para cilindros de gas comprimidos que contienen 99% átomo de 13 CO 2. Las plantas dentro de la cámara serán etiquetados con 13 C, donde concentraciones de CO 2 se mantienen a los niveles ambientales (ya que las concentraciones elevadoras planta altera la partición de carbono). Los niveles ambientales son mantenidos por sólo pulsante marcado CO 2 durante cortos períodos de tiempo. Además, temperaturas de la cámara se controlan y cámaras se eliminan si las temperaturas alcanzan los 5 ° C unaBove ambiente. </li><li> Una semana después del marcaje, comparar δ 13 C de la hierba de la camada con valores de abundancia naturales obtenidos de una muestra aleatoria de especies de gramíneas idénticas usando un Thermo DELTAplus relación isotópica espectrómetro de masa (Thermo, San Jose, CA, EE.UU.). </li></ol></li><li> Después de 40 días, añadir 10 g de secado al aire 13 C-etiquetados de hierba litera para cada collar que había sido modificado con carcasas saltamontes. </li><li> Monitorear la tasa de mineralización de la hierba-basura in situ en 75 días por cada tapado cuello y el seguimiento tanto de la respiración total del suelo y la respiración de 13 CO 2. Esto se logra utilizando una técnica de flujo a través de la cámara, donde las muestras de gas de cada collar se controlan, en tiempo real, para cada cavidad 8 min utilizando espectroscopia ring-down (CRDS; Picarro Inc., Santa Clara, CA, EE.UU.; Modelo: G1101 -i). CRDS permite a uno seguir simultáneamente tanto el total como δ 13 Cde respiración del suelo. </li><li> Estimar la contribución de 13 C-etiquetados de hierba basura a la respiración total del suelo usando las ecuaciones de isótopos de mezcla. La cantidad de hierba-basura derivada de CO 2 se calcula de la siguiente manera: (. Δ 13 C respiración - δ 13 C nat.abn) C hierba-basura derivada total × = C / (δ 13 C de hierba litera - δ 13 C nat . ABN), donde C total es la cantidad total de C respirado durante una medición dada, δ 13 C de respiración es el δ 13 C de respirado-C para cuellos modificados con litera hierba etiquetados, δ 13 C nat.abn. es la media δ 13 C de C respirado en los tres collares de abundancia natural (es decir, aquellos que no han sido modificados con litera), y δ 13 C hierba-basura es el δ 13 C de la camada hierba agregado a la coLlars. </li><li> Controlar tanto la temperatura y humedad del suelo a través del experimento utilizando sondas de mano para corregir las diferencias en la respiración del suelo debido a las diferencias en la temperatura y la humedad. </li><li> Aunque diseñado para uso en el campo, la cavidad ring-down instrumento de espectroscopia (Picarro Inc., Santa Clara, CA, EE.UU.; Modelo: G1101-i) las lecturas son sensibles al movimiento. Por lo tanto, es necesario erigir una estación de medida base central a todas las parcelas que contienen collares de PVC, y conectar el instrumento a los collares con longitudes de tubos de PVC. </li></ol>

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No tenemos nada que revelar.

La secuencia de los métodos presentados aquí deben permitir la medición sistemática de la manera estrés en especies que comprenden por encima del suelo redes alimentarias pueden principales comunidades microbianas del suelo en caminos que conducen a la alteración de la descomposición de residuos vegetales posterior. Los métodos son ideales para el estudio de los ecosistemas formados por consumidores de artrópodos y plantas herbáceas redes intactas porque los alimentos pueden estar espacialmente delimitado y contenido en mesocosmos. Variabilidad espacial pueden existir debido a los gradientes de humedad fondo del suelo, temperatura del suelo, el contenido de nutrientes de las plantas, etc El diseño del estudio permite mescosms matriz y collares de PVC para bloquear a lo largo de gradientes ambientales espaciales y por lo tanto en cuenta la variación ambiental, al analizar los efectos. Aunque diseñado para uso en el campo, la cavidad ring-down instrumento de espectroscopia (Picarro Inc., Santa Clara, CA, EE.UU.; Modelo: G1101-i) las lecturas son en sínsitive al movimiento. Por lo tanto, es necesario erigir una estación de medida base central a todas las parcelas que contienen collares de PVC, y conectar el instrumento a los collares con longitudes de tubos de PVC. Descomposición del suelo camada se ha medido tradicionalmente por encerrar cantidades conocidas de basura en bolsas de malla de fibra de vidrio, depositando las bolsas sobre la superficie del suelo en el campo y volver a medir periódicamente las bolsas de basura para cuantificar tasa de desaparición (descomposición). La limitación de este método es que uno no es capaz de rastrear el destino de la materia descompuesta o para determinar la contribución al CO 2 mineralizado de la enmienda del suelo (humus añadido) de suelo de fondo CO 2 mineralizado. El método trazador marcado con CO 2 se presenta aquí ayuda a aliviar esta restricción logístico. Ecología de Ecosistemas y la biogeoquímica han operado bajo el paradigma de trabajo que, debido a planta sin comer-Basura comprende la mayoría de los detritus, los procesos de los ecosistemas están debajo del suelo sólo marginalmente influida por los insumos de biomasa de los niveles tróficos más altos en las cadenas tróficas superficiales, como los herbívoros propios 6. Sin embargo, existe una creciente evidencia de que las especies de los niveles tróficos superiores de los ecosistemas puede tener una profunda influencia en los procesos de 1,4,5 subterránea. El método que aquí se presenta se destaca para mejorar la cuantificación de la contribución de los niveles tróficos superiores, ya sea directamente a través de la biomasa a partir de la canal (por ejemplo, 12, 13) o la excreción y egestión (por ejemplo, 14, 15) o indirectamente a través de la alteración de la composición de la comunidad vegetal (por ejemplo, 9 ) sobre el ciclo de nutrientes del ecosistema. Dicha cuantificación puede ayudar a revelar los mecanismos por los que los animales de control dinámica de los ecosistemas como parte de un esfuerzo concertado para mejorar y revisar el paradigma actual de trabajo de control biótico sobre el funcionamiento del ecosistema.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo o equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Cavidad anillo hacia abajo espectroscopio </td><td> Picarro Inc., Santa Clara, CA, EE.UU. </td><td> # Modelo G1101-i </td><td></td></tr><tr><td> CO2 respirómetro </td><td> Qubit Systems, Kingston, ON, Canadá </td><td> Modelo # S151 </td><td></td></tr><tr><td> 13C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 372382 </td><td></td></tr><tr><td> Espectrofotómetro </td><td> Thermo, San Jose CA, EE.UU. </td><td> Modelo: Delta V Plus Espectrómetro de masas de relación isotópica </td><td></td></tr></tbody></table>

linking predation risk, herbivore physiological stress and microbial decomposition of plant litter

La cantidad y calidad de detritus que entran en el suelo determina la velocidad de descomposición por comunidades microbianas así como las tasas de reciclado de nitrógeno (N) y carbono (C) 1,2 secuestro. Basura de la planta comprende la mayoría de los detritus 3, y así se supone que la descomposición es sólo ligeramente influenciada por entradas de biomasa procedentes de animales tales como herbívoros y carnívoros 4,5. Sin embargo, los carnívoros pueden influir en la descomposición microbiana de los desechos de las plantas a través de una cadena de interacciones en las que el riesgo de depredación altera la fisiología de su presa herbívoro que a su vez altera el funcionamiento microbiana del suelo cuando los cadáveres de herbívoros se descomponen 6. Una respuesta fisiológica al estrés por los herbívoros al riesgo de depredación puede cambiar el C: composición elemental N de la biomasa de herbívoros 7,8,9 porque el estrés de la depredación de riesgo aumenta las demandas de energía que herbivore basales en nutrientes limitado sistemas herbívoro fuerzass de cambiar su consumo de N-ricos recursos para apoyar el crecimiento y la reproducción de los recursos de hidratos de carbono C-ricos para apoyar el metabolismo aumentado 6. Los herbívoros tienen una capacidad limitada para almacenar el exceso de nutrientes, por lo que hizo hincapié en los herbívoros excretan N, ya que aumentan el consumo de hidratos de carbono-C 7. En última instancia, presa destacó por el riesgo de depredación aumentar su cuerpo relación C: N 7,10, lo que los pobres recursos de calidad para la piscina microbiana del suelo probablemente debido a la menor disponibilidad de N lábil para la producción de enzimas microbianas 6. Por lo tanto, la descomposición de los restos de herbívoros estrés tiene un efecto de sensibilización sobre el funcionamiento de las comunidades microbianas que disminuye posterior capacidad de los microbios para descomponer residuos vegetales 6,10,11. Se presenta la metodología para evaluar los vínculos entre el riesgo de depredación y la descomposición de la hojarasca de los microbios del suelo. Se describe cómo: inducir estrés en los herbívoros de riesgo de depredación; meaque esas respuestas de estrés y medir las consecuencias sobre la descomposición microbiana. Utilizamos ideas de un ecosistema de pastizal modelo que comprende la caza araña depredador (Pisuarina mira), un herbívoro dominante saltamontes (Melanoplus femurrubrum), y una variedad de plantas herbáceas y gramíneas 9.

Un gráfico de ejemplo de saltamontes estándar tasas metabólicas en condiciones de estrés y sin estrés se presentan en la Figura 2. Debido a las diferencias de masa corporal entre los saltamontes individuales, y el hecho de que la tasa metabólica varía con la masa corporal, las parcelas deben presentar tasas metabólicas en relación a la masa corporal saltamontes. Tendencias paralelas para los diferentes tratamientos indican que la tasa metabólica se eleva como un múltiplo constante de la tasa metabólica estándar (es decir, no hay masa corporal x interacción tasa metabólica) para todas las personas estresadas. Saltamontes cuerpo C y contenidos de N elementales de riesgos y condiciones libres de riesgo se presentan en la Tabla 1. Es de notar que hay una muy pequeña (4%) diferencia en el cuerpo de C: N entre los tratamientos. Sin embargo, estas pequeñas diferencias pueden traducirse en grandes diferencias en la descomposición hierba camada de la piscina microbiana del suelo (Figura 3). </p&gt; Adición de basura hierba a los collares de PVC previamente modificadas con saltamontes estrés o sin estrés conduce a diferentes grados de descomposición de la hojarasca, como se refleja en las curvas que describen acumular CO 2 liberado del suelo debido a la respiración microbiana (Figura 3). Los experimentos deben controlarse hasta acumular las curvas comienzan a saturarse. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Estrés </td><td> Stress Free </td></tr><tr><td> Carbono (%) </td><td> 48,44 ± 0,32 </td><td> 44,73 ± 0,46 </td></tr><tr><td> Nitrógeno (%) </td><td> 12,11 ± 0,08 </td><td> 11,62 ± 0,12 </td></tr><tr><td> Carbono: Nitrógeno </td><td> 4,00 ± 0,03 </td><td> 3,85 ± 0,04 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Comparación de la composición química de coche herbívoro saltamontesquiebras de las condiciones en las que se enfrentaban el riesgo de depredación (estrés) y en la que estuvo ausente el riesgo de depredación (sin estrés). Los valores son la media ± 1 error estándar. <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Ilustración del diseño del campo mesocosmos usado en el experimento y el esquema general de la evaluación experimental de los efectos de riesgo en descomposición de la hojarasca. <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Una parcela de la tasa metabólica estándar herbívoro en relación con la masa corporal herbívoro. Los datos se dividen en dos clases de acuerdo con el tratamiento experimental: saltamontes de mesocosmos contienen depredadores (depredación) para inducir el estrés, y mesocosmos sin depredadores (control) y por lo tanto no inducida por el estrés. Los datos proceden de D. HalwenaDO y Schmitz 2010, inédito. <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061fig3highres.jpg"/> Figura 3. Curvas que describen CO 2 acumulado liberación junto a la piscina mientras descomposición microbiana experimentales aportes de hojarasca hierba en collares de PVC. Valores representados son la media ± 1 error estándar. El gráfico demuestra que los suelos cebado con estrés cadáveres saltamontes (depredador) dan como resultado menor del 19% (ANOVA F 1,6 = 9,06, P &lt;0,05) de las plantas tasas de descomposición de la hojarasca de los suelos a prueba con estrés canales libres saltamontes (control). El recuadro muestra el aparato de collar de PVC en el campo. Figura reproducida de Hawlena et al. 6 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50061/50061fig3large.jpg" target="_blank">Cick aquí para ampliar la cifra</a> .

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Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

Se presentan métodos para evaluar cómo el riesgo de depredación puede alterar la calidad química de las presas herbívoro mediante la inducción de cambios en la dieta para satisfacer las demandas de mayor estrés, y cómo la descomposición de los cadáveres de estos herbívoros estrés retarda la descomposición posterior residuos vegetales por microorganismos del suelo.

Vinculación de riesgo de depredación, Estrés Fisiológico herbívoro y descomposición microbiana de los desechos de las plantas

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

linking-predation-risk-herbivore-physiological-stress-microbial

Research

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Biology

12.9K vistas.  Yale University. Se presentan métodos para evaluar cómo el riesgo de depredación puede alterar la calidad química de las presas herbívoro mediante la inducción de cambios en la dieta para satisfacer las demandas de mayor estrés, y cómo la descomposición de los cadáveres de estos herbívoros estrés retarda la descomposición posterior residuos vegetales por microorganismos del suelo.

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Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Prueba de las barreras fisiológicas a la transmisión del virus en los áfidos con microinyección

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

Investigación

Biología

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. Among the most severe stresses are insect herbivory, pathogen infection, and drought stress. For each of these stresses a specific set of hormones and/or combinations thereof are known to fine-tune the responses, thereby ensuring the plant's survival. The major hormones involved in the regulation of these responses are jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and abscisic acid (ABA). To better understand the role of individual hormones as well as their potential interaction during these responses it is necessary to monitor changes in their abundance in a temporal as well as in a spatial fashion. For the easy, sensitive, and reproducible quantification of these and other signaling compounds we developed a method based on vapor phase extraction and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis (1, 2, 3, 4). After extracting these compounds from the plant tissue by acidic aqueous 1-propanol mixed with dichloromethane the carboxylic acid-containing compounds are methylated, volatilized under heat, and collected on a polymeric absorbent. After elution into a sample vial the analytes are separated by gas chromatography and detected by chemical ionization mass spectrometry. The use of appropriate internal standards then allows for the simple quantification by relating the peak areas of analyte and internal standard.

A simple method is provided that allows for the rapid extraction and analysis of multiple plant hormones from small tissue samples. The procedure uses vapor phase extraction as the solemn purification step. Samples are analyzed by GC/MS with chemical ionization that produces mainly (M+1)+ ions.

Monitoreo hormonas vegetales en las respuestas de estrés

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo perfiles Misa (OLIMP) de polisacáridos extracelulares

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; agar-block). It is well-accepted that soil-block microcosms yield higher decay rates, fewer moisture issues, lower variability among studies, and higher thresholds of preservative toxicity. Soil-block testing is thus the more utilized technique and has been standardized by American Society for Testing and Materials (ASTM) (method D 1413-07). The soil-block design has drawbacks, however, using locally-variable soil sources and in limiting the control of nutrients external (exogenous) to the decaying tissues. These drawbacks have emerged as a problem in applying this method to other, increasingly popular research aims. These modern aims include degrading lignocellulosics for bioenergy research, testing bioremediation of co-metabolized toxics, evaluating oxidative mechanisms, and tracking translocated elements along hyphal networks. Soil-blocks do not lend enough control in these applications. A refined agar-block approach is necessary.
Here, we use the brown rot wood-degrading fungus Serpula lacrymans to degrade wood in agar-block microcosms, using deep Petri dishes with low-calcium agar. We test the role of exogenous gypsum on decay in a time-series, to demonstrate the utility and expected variability. Blocks from a single board rip (longitudinal cut) are conditioned, weighed, autoclaved, and introduced aseptically atop plastic mesh. Fungal inoculations are at each block face, with exogenous gypsum added at interfaces. Harvests are aseptic until the final destructive harvest. These microcosms are designed to avoid block contact with agar or Petri dish walls. Condensation is minimized during plate pours and during incubation. Finally, inoculum/gypsum/wood spacing is minimized but without allowing contact. These less technical aspects of agar-block design are also the most common causes of failure and the key source of variability among studies. Video publication is therefore useful in this case, and we demonstrate low-variability, high-quality results.

This video demonstrates a controlled environment approach to study degradation of lignocellulosic plant tissues by aerobic fungi. The ability to control nutrient sources and moisture is a key advantage of agar-block microcosms, but the approach often yields mixed success. We address critical pitfalls to yield reproducible, low-variability results.

Bloque de agar-microcosmos de descomposición controlada de Tejidos Vegetales de hongos aerobios

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; ...

Herbivore-induced Blueberry Volatiles and Intra-plant Signaling

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2. These HIPVs are mainly regulated by the defensive plant hormone jasmonic acid (JA) and its volatile derivative methyl jasmonate (MeJA)3,4,5. Over the past 3 decades researchers have documented that HIPVs can repel or attract herbivores, attract the natural enemies of herbivores, and in some cases they can induce or prime plant defenses prior to herbivore attack. In a recent paper6, I reported that feeding by gypsy moth caterpillars, exogenous MeJA application, and mechanical damage induce the emissions of volatiles from blueberry plants, albeit differently. In addition, blueberry branches respond to HIPVs emitted from neighboring branches of the same plant by increasing the levels of JA and resistance to herbivores (i.e., direct plant defenses), and by priming volatile emissions (i.e., indirect plant defenses). Similar findings have been reported recently for sagebrush7, poplar8, and lima beans9..
Here, I describe a push-pull method for collecting blueberry volatiles induced by herbivore (gypsy moth) feeding, exogenous MeJA application, and mechanical damage. The volatile collection unit consists of a 4 L volatile collection chamber, a 2-piece guillotine, an air delivery system that purifies incoming air, and a vacuum system connected to a trap filled with Super-Q adsorbent to collect volatiles5,6,10. Volatiles collected in Super-Q traps are eluted with dichloromethane and then separated and quantified using Gas Chromatography (GC). This volatile collection method was used n my study6 to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants. These methods are described here. Briefly, undamaged blueberry branches are exposed to HIPVs from neighboring branches within the same plant. Using the same techniques described above, volatiles emitted from branches after exposure to HIPVs are collected and analyzed.

A push-pull method for collecting plant volatiles is described. The method allows for a comparison of volatiles induced by herbivore feeding, exogenous methyl jasmonate, and mechanical damage. This technique is also used to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants.

Inducida por herbívoros-Volátiles Blueberry y señalización dentro de la planta

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2.  These HIPVs are mainly regulated by the defensive ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Using two methods to estimate gene expression in the major gustatory appendages of Aedes aegypti, we have identified the set of genes putatively underlying the neuronal responses to bitter and repulsive compounds, as determined by electrophysiological examination.

Fisiológicos Grabaciones y RNA Secuenciación de los apéndices gustativas del mosquito de la fiebre amarilla<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

La visualización de frecuencia Stromule con microscopía de fluorescencia

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Mediciones de las respuestas fisiológicas de estrés en C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls requires cellular reprogramming and changes in the metabolism of the infected plant. This is necessary to establish a pathogen-oriented physiological sink toward which the host nutrients are redirected. For a complete understanding of this particular plant-pathogen interaction and the mechanisms by which host growth and development are subverted and repatterned, it is essential to track and observe the internal changes accompanying gall formation with cellular resolution. Methods combining fluorescent stains and fluorescent proteins are often employed to study anatomical and physiological responses in plants. Unfortunately, the large size of galls and their low transparency act as major hurdles in performing whole-mount observations under the microscope. Moreover, low transparency limits the employment of fluorescence microscopy to study clubroot disease progression and gall formation. This article presents an optimized method for fixing and clearing galls to facilitate epifluorescence and confocal microscopy for inspecting P. brassicae-infected galls. A tissue-clearing protocol for rapid optical clearing was used followed by vibratome sectioning to detect anatomical changes and localize gene expression with promoter fusions and reporter lines tagged with fluorescent proteins. This method will prove useful for studying cellular and physiological responses in other pathogen-triggered structures in plants, such as nematode-induced syncytia and root knots, as well as leaf galls and deformations caused by insects.

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

The present protocol describes an optimized method for the histological observation of galls induced by Plasmodiophora brassicae. Vibratome sections of hypocotyls are cleared before fluorescence imaging to study the involvement of transcription factors and phytohormones during disease progression. This protocol overcomes resin embedding limitations, enabling in planta visualization of fluorescent proteins.

Combinación de microscopía de limpieza y fluorescencia para visualizar cambios en la expresión génica y respuestas fisiológicas a Plasmodiophora brassicae

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls ...

Scalable, Flexible, and Cost-Effective Seedling Grafting

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage seedlings of the small model plant, Arabidopsis thaliana, is technically challenging and time consuming due to the size and fragility of its seedlings. A growing collection of published methods describe this technique with varying success rates, difficulty, and associated costs. This paper describes a simple procedure to make an in-house reusable grafting device using silicone elastomer mix, and how to use this device for seedling grafting. At the time of this publication, each reusable grafting device costs only $0.47 in consumable materials to produce. Using this method, beginners can have their first successfully grafted seedlings in less than 3 weeks from start to finish. This highly accessible procedure will allow plant molecular genetics labs to establish seedling grafting as a normal part of their experimental process. Due to the full control users have in the creation and design of these grafting devices, this technique could be easily adjusted for use in larger plants, such as tomato or tobacco, if desired.

This protocol describes a robust seedling grafting method that requires no prior experience or training and can be executed at a very low cost using materials easily accessible in most molecular biology labs.

Injerto de plántulas escalable, flexible y rentable

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage ...