Esta publicación fue financiada por las enzimas de la Investigación Investigación Red de Coordinación para el Medio Ambiente con el apoyo de la Fundación de Ciencia Nacional de EE.UU. (DEB # 1,021,559). Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias de EE.UU. (DEB # 1021559), y el Departamento de la Oficina de Energía de la Ciencia (Biológica y Ambiental de la Investigación) EE.UU.. Las opiniones, resultados y conclusiones o recomendaciones expresadas en este material son las de los autores y no reflejan necesariamente las opiniones de la NSF EE.UU..

1. Ensayo Set-up <ol><li> Label 3 placas de pocillos profundos: &quot;muestra&quot;, &quot;MUB estándar&quot; y &quot;estándar MUC&quot;. </li><li> Verter cada estándar (MUB de 0, 2,5, 5, 10, 25, 50, y 100 mM) y el sustrato (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) en embalses, premarcan limpias separadas (orientada en filas) . </li><li> Pipetear la norma MUB adecuada en pocillos correspondientes de la placa estándar MUB (Tabla 1). <ol><li> Pipetear 200 l de 0 M MUB en la fila A de la placa estándar MUB. </li><li> Pipetear 200 l de 2,5 M MUB en la fila B de la placa estándar MUB. </li><li> Pipetear 200 l de 5 M MUB en la fila C de la placa estándar MUB. </li><li> Pipetear 200 l de 10 mM MUB en la fila D de la placa estándar MUB. </li><li> Pipetear 200 l de 25 mM MUB en la fila E de la placa estándar MUB. </li><li> Pipetear 200 l de 50 mM MUB en la fila F de la placa estándar MUB. </li><li> Pipetear 200 l de 100 μM MUB en la fila G de la placa estándar MUB. </li><li> Repita los pasos 1.3.1 - 1.3.8 de las normas MUC en los correspondientes pocillos de la placa estándar MUC. </li></ol></li><li> Suelos fangosos Prep para cada muestra de suelo. <ol><li> Pesar 2,75 g de campo de tierra húmeda en la licuadora. </li><li> Añadir 91 ml de tampón de 50 mM. Mezclar a temperatura alta durante 1 min. </li><li> Vierta el contenido licuadora en un recipiente de vidrio limpio por lo menos tan grande como la pipeta de 8 canales con una barra de agitación. </li><li> Colocar sobre una placa de agitación, mezcla lechada suelo en baja. </li><li> Pipetear 800 l de suspensión del suelo en la primera columna de la placa de la muestra (Tabla 2). </li><li> Repita en 1 ª columna de la norma MUB y placas estándar MUC (Tabla 1). </li><li> Enjuague batidora, placa de agitación y revuelo bar con DI H2O o tampón entre las muestras de suelo. </li><li> Repita los pasos 1.4.1 - 1.4.7) para cada muestra, para pasar a la siguiente columna con cada muestra posterior suelos (Tablas 1 y2). </li></ol></li><li> Pipetear el sustrato apropiado (en este ejemplo, 200 mM concentraciones) en los correspondientes pocillos de la placa de la muestra (Tabla 2). <ol><li> Pipetear 200 l de sustrato de BG en la fila A de la placa de la muestra. </li><li> Pipetear 200 l de sustrato de CB en la línea B de la placa de la muestra. </li><li> Pipetear 200 l de sustrato NAG en la fila C de la placa de la muestra. </li><li> Pipetear 200 l de sustrato PHOS en la fila D de la placa de la muestra. </li><li> Pipetear 200 l de sustrato XYL en la sección E de la placa de la muestra. </li><li> Pipetear 200 l de sustrato AG en la fila F de la placa de la muestra. </li><li> Pipetear 200 l de sustrato LAP en la fila G de la placa de la muestra. </li><li> Repita los pasos 1.5.1 - 1.5.7 para cada placa muestra la temperatura de incubación. </li></ol></li></ol> 2. La incubación de las placas de ensayo <ol><li> Sellar las placas de pozo profundo (&quot;muestra&quot;, &quot;estándar MUB&quot; y &quot;estándar MUC4 ;) con esteras de placas. </li><li> Invierta cada uno (sellado) placa con la mano hasta que la solución se mezcla a fondo (~ 10 veces). </li><li> Colocar las placas en la incubadora apropiada para el período de tiempo de incubación requerido (Tabla 3). </li><li> Registre el tiempo inicial Tiempo 0. También registre los tiempos de incubación apropiados para que sepa cuándo debe retirar la placa de la incubadora (Tabla 3). </li><li> Al final de cada período de incubación, las placas de centrífuga sellados durante 3 min a ~ 2.900 x g. </li><li> Después de la certificación, transferir 250 l de cada pocillo de las placas de pocillos profundos incubadas en los correspondientes pocillos en placas de 96 pocillos de fondo plano negro (una placa de color negro se utilizará para cada placa de pozo profundo se incubó). Es importante para transferir muestras de las placas de pocillos profundos incubadas en los mismos pozos (es decir, A1 ... A12, etc) en las placas de fondo plano de 96 pocillos negros (Tabla 1, 2). </li></ol> 3. Medidas fluorescentes enun fluorómetro de microplacas <ol><li> Siguiendo las instrucciones del fabricante para el lector de placas fluorométrico utilizado, establecer la longitud de onda de excitación a 365 nm y longitud de onda de emisión de 450 nm (o utilizar filtros adecuados). </li><li> Lea las tres placas en el fluorómetro. Importante: Las muestras y placas estándar (es decir MUB o MUC) deben leerse con la misma ganancia. <ol><li> Ajuste el espectrofotómetro a la ganancia automática y leer las placas MUC y MUB estándar. </li><li> Set de ganancia en manual, y reducir el valor de ser óptima al siguiente número más bajo, redondeados a los cinco más cercano, para cada placa estándar. Repita 2x para cada plato. </li><li> Ajuste la ganancia en automático y ejecutar la Placa de la muestra. Vuelva a ejecutar la placa de muestra de forma manual para que coincida con la mayor ganancia para cada una de las placas estándar (es decir MUB y MUC). </li></ol></li></ol> 4. Análisis de Datos <ol><li> Introduzca datos de la curva de fluorescencia estándar en hoja de cálculo para MUB (Cuadro 4a) Y estándar MUC (Tabla 4b) <ol><li> Convertir (M) a las concentraciones (mol) (Tablas 4a y 4b). </li></ol></li><li> Para los datos de la curva de fluorescencia estándar de cada muestra, calcular la pendiente, intersección, y R 2 valores para MUB y MUC (mol) concentraciones estándar. Aceptable R 2 valores deben exceder 0,98 para cada muestra (Tablas 4a y 4b). Puede ser útil para visualizar las curvas de calibración en un gráfico de dispersión; con fluorescencia se lee representará gráficamente como la variable dependiente (eje y) y la concentración estándar (mol) trazada como la variable independiente (eje x) (Figura 1). </li><li> Usted usará los valores y-intercepción pendiente y curva estándar MUB y MUC para calcular el sustrato datos de fluorescencia cruda muestra + en los EEA potenciales. Primero debe introducir los datos de fluorescencia del sustrato + primas de la muestra en una nueva hoja de cálculo (Cuadro 5a </strong&gt;). También tendrá que introducir el tiempo de incubación (h) y el peso seco del suelo para cada muestra (Tabla 5b). Nota, los tiempos de los valores introducidos en este ejemplo son 3 horas, ya que las muestras se incubaron a 25 ° C (Tabla 3). <ol><li> Restar los valores de intersección de la curva estándar a partir de los valores de fluorescencia de muestras correspondientes y luego dividir por la pendiente de la curva estándar correspondiente (tabla 5c). Para lograr esto, reorganizar la ecuación de línea estándar para resolver para la concentración de enzima de la muestra (x); x = (YB) / m donde: [Y = fluorescencia de la muestra de lectura en bruto, b = intersección de MUB o curva de MUC estándar; m = pendiente de MUB o MUC curva estándar]. </li><li> Multiplique muestra mmol, de la etapa 4.3.1, por 91 ml (volumen tampón usado en suspensión de suelo) (Tabla 5d). </li><li> Divide el valor obtenido en el paso 4.3.2 por el tiempo de incubación de la muestra específica y masa seca del suelo (Cuadro 5e): [amt enzima. (&amp; #956; mol) x 91 ml x incubación (h) x suelo seco (g) x 0,8 ml x 1000] Nota: 0.8 ml es el volumen de estiércol líquido utilizado en cada pocillo, y 1000 corrige por el importe real del suelo en cada pocillo. </li><li> Multiplicar el valor obtenido en el paso 4.3.3 por 1000 para obtener las unidades deseadas (actividad nmol / g suelo seco / hr) (Tabla 5f). </li></ol></li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La medición basada en el laboratorio de potenciales EEA suelo puede proporcionar pistas importantes sobre las respuestas microbianas a su entorno abiótico, así como sus consecuencias para el funcionamiento del ecosistema. Los resultados de este ejemplo conjunto de datos sugieren que existen diferencias mínimas en la actividad enzimática del suelo o la cinética entre las parcelas de tratamiento climático. Sin embargo, las tendencias inversas entre parcelas alentar una mayor investigación de covariables que pueden influir en la producción de los EEA microbianos tales como la humedad del suelo, el pH del suelo o el crecimiento de las plantas. En general, la evaluación de los EEA en términos de (1) a efectos del EEE general en los suelos, (2) la estequiometría del EEE (3) energía gráficas de Arrhenius / activación, y (4) Q 10 proporciona un amplio espectro de enfoques que pueden ser indicativos de procesos a nivel de ecosistema de la que para caracterizar robusta dinámica funcional de los ecosistemas del suelo. Ensayos EEE basadas en la fluorescencia De alto rendimiento son una herramienta útil que se utiliza ampliamente para examinar posibles EEA en los suelos yotros entornos. Es importante destacar que las posibles actividades reflejan el tamaño del grupo de enzimas, pero no por ellos mismos cuantifican las tasas de producción o sobre las ventas de la enzima 46. Aunque la técnica es relativamente sencilla, las diferencias aparentemente menores entre los protocolos de laboratorio pueden dificultan la comparabilidad de los resultados 13. Por desgracia, actualmente no tenemos controles positivos estandarizados adecuados para SEAE. El uso de las relaciones estequiométricas es uno de los enfoques para superar estos desafíos. De lo contrario, el advenimiento de técnicas de alto rendimiento ha avanzado el estudio de las enzimas en el medio ambiente 4. Interpretación cuidadosa de los datos generados por estos ensayos puede aclarar las tendencias importantes en la actividad microbiana. La robustez del protocolo se deriva de la capacidad de seleccionar para las condiciones específicas para las muestras individuales, pero esto también puede dar lugar a limitaciones. Se requerirá una serie de modificaciones para garantizar las muestras se miden con precisión para<html> sitios de campo individuales: Buffer El tampón se selecciona dependerá del pH del suelo. Buffering también estabiliza la intensidad de fluorescencia de las normas fluorescentes, que es altamente dependiente del pH 27,47. El buffer de pH que normalmente utilizamos para hacer la suspensión del suelo es un acetato de sodio 50 mM o tampón Tris que se elige para el ácido particular, la constante de disociación de la memoria intermedia (pKa) al mejor suelo partido - los niveles de pH de la muestra. El acetato de sodio tiene un pKa de 4,76, y tris tiene un pKa de 8,06 por lo que las cantidades de estos dos tampones variará con el fin de alcanzar el pKa deseado para la muestra individual. Tampón fosfato (pKa = 7,2) ha sido sugerido para suelos neutros / ligeramente básicos. Sin embargo, advertimos que la prueba de la variabilidad analítica en los estudios preliminares antes de usar este buffer, como altas concentraciones de fosfatos pueden interferir con la actividad de la enzima. Manipulación y almacenamiento de sustratos fluorescentes jove_content &quot;&gt; ensayos de fluorescencia pueden sufrir interferencias causadas por impurezas y / o inestabilidad de muchos compuestos fluorescentes cuando se exponen a la luz, por lo que debe tener cuidado al manipular sustratos fluorescentes. Recomendamos minimizar cualquier exposición a la luz de la etiqueta fluorescente sustratos y MUB y normas MUC . Uso de botellas de vidrio de color ámbar o cubrir el material de vidrio y recipientes que se utilicen para la fabricación y el almacenamiento de los sustratos y las normas fluorescentes es muy recomendable; papel de aluminio para envolver artículos de vidrio y envases funciona bien la misma manera, la inoculación de las placas de manera eficiente y la transferencia a las incubadoras oscuras es la mejor práctica Recomendamos.. almacenamiento de sustratos y normas (-20 ° C) durante un máximo de dos meses (mientras que los protege de la luz), y sustratos de descongelación (5 ° C) ~ 24-48 horas antes de comenzar el ensayo (s) enzima. Diseño y replicación Para mejor explicar bien a las variaciones de la muestra, así, implementar negative ensayo controles y se recomienda (si es posible) de ensayo se replica. Variación normalmente se produce debido a las diferencias en la cantidad de partículas de suelo en cada pozo y los errores de pipeteo. Por lo tanto, una fuerte mezcla y buena técnica de pipeteo se minimizar sustancialmente bien a la variación también. Por otra parte, es altamente recomendable la implementación de un control de ensayo negativo (solución tampón sustrato +) para supervisar las incoherencias de sustrato a través del tiempo. Esto se puede controlar fácilmente al leer las placas de enzimas mediante la comparación de los pozos de control negativo (que normalmente utilizamos la última columna en las placas de 96 pocillos). Controles de sustrato negativos son típicamente estables, por lo tanto, la señal aumenta muy por encima del límite de detección, que es indicativo de la contaminación o inestabilidad sustrato, que requiere un reemplazo del sustrato y / o soluciones estándar. Para maximizar el rendimiento, el protocolo incluye varios EEA potenciales en un solo micro pozo profundo, aunque otros protocolos realizan un tipo deensayo por placa (es decir, un sustrato por placa), ya que diferentes EEA ocurren a un ritmo diferente. Independientemente, la optimización de la enzima se debe realizar en los suelos antes de realizar esta alta en toda aproximación, o el enfoque de la placa única. Sustratos múltiples pueden ser utilizados en una sola placa si las velocidades de reacción son relativamente consistentes para cada enzima dentro del período de tiempo de la incubación. Nuestro protocolo recomienda ~ 2,75 g de suelo para hacer que la solución en suspensión, mientras que ~ 1 gramo se recomienda en otros protocolos 24. Sugerimos que el uso de más suelo (si es posible) es un método eficaz para mejorar la captura dentro de la muestra la variación del suelo en los niveles de actividad de la enzima. En este protocolo, se incubamos 800 l de suspensión de suelo con 200 l de sustrato, mientras que otros sólo incuban 200 l de suspensión de suelo con 50 l de sustratos. Esto es simplemente una función de ampliación que a la larga no cambia la actividad medida. También hay ventajas prácticaspara el uso de volúmenes más grandes. Uno, es más fácil evitar las partículas del suelo, mientras que el pipeteado en placas de 96 pocillos de fondo plano negro antes de grabar intensidades en el fluorómetro correspondiente. En segundo lugar, el volumen adicional es útil en el caso de derrames accidentales durante la transferencia de las placas negras de 96 pocillos de fondo plano para el fluorómetro antes de grabar intensidades de fluorescencia relacionados con las enzimas. Incluso las pequeñas desviaciones en el volumen se reducirá significativamente la fluorescencia entre pozos. Por último, debido a la naturaleza de alto rendimiento de este protocolo, que comúnmente elegimos confiar en la replicación experimental para representar la variación en los niveles de actividad de la enzima en lugar de realizar el ensayo se replica. Siempre es buena práctica incluir repeticiones analíticas, pero en la práctica, sentimos nuestro protocolo proporciona una compensación equilibrada entre repeticiones analíticas y experimentales dados los recursos limitados. Asimismo, nuestro enfoque utiliza un suelo relativamente más bien homogeneizada (2,75 g) por ensayo 25, que es inherentently disminuye dentro del suelo variaciones. La decisión de utilizar réplicas de análisis debe ser considerado cuidadosamente mediante pruebas de error analítico en estudios preliminares 48. Sin embargo, se recomienda que los diseños experimentales con menos de 4 repeticiones del tratamiento del grupo deberían considerar seriamente el uso de ensayo repeticiones. Suelos, Volúmenes Buffer, y la optimización de concentración de sustrato El tampón de suelo: relación de la concentración de sustrato es una variable importante que influye fuertemente en la fluorescencia medida cuando se realizan ensayos de la enzima. La cantidad de suelo en la suspensión añadida a ensayar o la concentración de sustrato puede ser necesario ajustar en función de la actividad de las enzimas en la muestra de suelo. Las cantidades seleccionadas para este ejemplo se basaron en pruebas anteriores de estos suelos para garantizar que la disponibilidad de sustrato fue limitante, y que estábamos midiendo las tasas potenciales máximas bajo las condiciones de ensayo (V max) 44,45. Sin embargo, para muestras de suelo que tienen altas concentraciones de enzimas, la cantidad de suelo o de la concentración de sustrato debe ser aumentada. Hemos encontrado que el aumento de las concentraciones de sustrato (y el ajuste de la curva estándar en consecuencia) puede afectar a la linealidad de la curva. Por lo tanto, se recomienda la reducción de las cantidades de suelo y / o ajustes proporcionales para amortiguar el volumen según sea necesario. No obstante, es importante optimizar la concentración de sustrato para cada tipo de suelo ensayado porque EEA medidos pueden variar en un orden de magnitud mayor entre las concentraciones de sustrato saturado y sub-26 saturados. Por lo tanto, las diferencias entre los tratamientos experimentales (etc.) son susceptibles de tipo II error estadístico y menos probable que se detecten en condiciones sub-saturación, y el error estadístico 27,35. Para optimizar las concentraciones de sustrato, enzima ensayos preliminares deben realizar en muestras de suelo representativas utilizando una amplia gama de concentraciones de sustrato. Despuésel registro de la fluorescencia, simplemente trazar los datos (de manera similar al ejemplo curva estándar; Figura 1) para identificar la concentración de sustrato (eje x) que corresponde a la actividad enzimática (eje y) donde los niveles fuera de pendiente (~ 0). Del mismo modo, la concentración de sustrato que corresponde al punto donde los niveles de pendiente fuera (~ 0) es una buena indicación de la concentración de sustrato óptima para que el suelo en particular. Este ensayo mide la fluorescencia en última instancia, en un momento dado producido por el resto fluorogénico que se escinde del sustrato como resultado de la despolimerización sustrato mediada por enzima. Por lo tanto, el paso 5 (la adición del sustrato) es crítico y debe llevarse a cabo tan eficientemente como sea posible a fin de minimizar el tiempo entre cuando se añade el sustrato a los suelos y cuando se incuban los ensayos. Del mismo modo, una vez que el sustrato entra en contacto con la muestra, las reacciones enzimáticas empezarán a producirse. Se recomienda utilizar un multi-canalpipetear por esta razón. Se recomienda encarecidamente a ser eficientes con la pipeta multicanal antes del día va a realizar sus ensayos enzimáticos. Para lograr esto, se puede practicar el pipeteo con agua hasta que usted puede transferir fácilmente los volúmenes en las placas de 96 pocillos con su pipeta. Suelo Quenching El enfriamiento se refiere a la disminución de la intensidad de fluorescencia causada por partículas y / o materia orgánica en los suelos lodos-incubaciones 26. El enfriamiento se puede influir mediante el ajuste de la tierra: relaciones de amortiguamiento 25. Debido a la fluorescencia de fondo a partir de muestras individuales, es crítico para funcionar con muestras estándares para tener en cuenta para el fondo (enfriamiento rápido) de fluorescencia. Aunque algunos protocolos pueden usar una sola concentración después de la prueba de que la señal es lineal, se recomienda encarecidamente la implementación de un control de enfriamiento estándar para cada muestra para el mejor control de los efectos de la extinción. El no hacerlo resultará en un soportecurva de ARD no aplicable a la muestra, y una estimación incorrecta de la actividad enzimática. La adición de estándares para suelos fangosos no es sensible al tiempo, como la adición estándar no afecta a la fluorescencia de fondo de la muestra. Además NaOH La adición de NaOH se utiliza en algunos protocolos para optimizar las mediciones de actividad enzimática fluorométricos porque el colorante fluorescente liberado de los sustratos sintéticos exhibe fluorescencia pico a pH&gt; 9,0 26,49. Al considerar esta sugerencia, la concentración de NaOH necesaria para el pH de la suspensión del suelo (es decir, a pH&gt; 9) variará dependiendo de la particular de suelo y el tampón de pH utilizado 26. Sin embargo, otros argumentan que NaOH puede no ser necesario debido a la intensidad de la señal es en general muy alta, incluso a pH más bajo, y porque introduce una fuente adicional de error de medición. Por ejemplo, el efecto de las adiciones de NaOH en pH de la suspensión y por lo tanto Fluore MUB o MUCcambios scence en el tiempo 25. Sustratos MUB enlaces se han mostrado para demostrar el aumento de la fluorescencia constante durante 20 minutos después de las adiciones de NaOH antes de los niveles de conicidad; mientras MUC ha demostrado constante disminución de la fluorescencia durante un máximo de 60 min 26. Por lo tanto, es importante para estandarizar el tiempo entre NaOH adición y medición de fluorescencia. Alternativamente, si los niveles de fluorescencia son suficientemente detectable sin la adición, la realización de los ensayos sin adición de NaOH ha sido sugerido como una alternativa igualmente aceptables 26. Temperatura Sensibilidad a la temperatura debería tenerse en cuenta a la hora de decidir la temperatura de incubación. Si el principal interés es entender la cinética de enzimas, utilizando tres o más temperaturas, como se ilustra mediante los gráficos de Arrhenius (en la sección de resultados) es un enfoque sólido. Si el sitio muestra tiene característicamente baja temperatura, tales como suelos de permafrost, entonces el duration de incubación puede necesitar ser ampliado para permitir a las enzimas para reaccionar en las temperaturas de incubación más fríos. Mientras que la cinética de enzimas tradicionales sugiere que un aumento en la temperatura debe resultar en aumento de la actividad de la enzima, hemos encontrado que las enzimas pueden ser específicos en términos de sensibilidad a la temperatura 50 sitio. Por lo tanto, para comprender la actividad enzimática potencial específica del sitio es muy importante que la temperatura de incubación y la duración se ajustan para reflejar los valores del sitio de campo. Conclusión EEs son conductores críticos de los procesos biogeoquímicos en los suelos, y por lo tanto tenemos que ser capaces de medir sus actividades. Hay muchos retos para la medición de los EEA en los suelos, incluyendo la interferencia y la inhibición. A pesar de estos desafíos, los protocolos estandarizados (como el que se describe aquí) se pueden aplicar universalmente para medir EEA para una amplia gama de enzimas. Si bien es bastante fácil para generar datos de calidad siguiendo estos protocolos, el deinterpretación de estos datos en un contexto ecológico requiere una cuidadosa consideración de lo que estos ensayos son realmente midiendo, y cómo los EEA en condiciones de ensayo puede ser diferente a los menores en condiciones in situ.

Enzimas extracelulares (EEE) producidos por las bacterias del suelo, hongos y arqueas están involucrados en los procesos biogeoquímicos innumerables, y son fundamentales para la transformación, estabilización y desestabilización de la materia orgánica del suelo y el ciclo de nutrientes en los ecosistemas terrestres 1. Mediante la producción de EE, los microbios del suelo descomponen y transforman la materia orgánica polimérica en moléculas solubles más pequeños, liberando de ese modo consolidados anteriormente micro y macronutrientes, lo que permite a las plantas y los microbios para asimilar los nutrientes disponibles en el suelo. EEs se han estudiado durante décadas, principalmente mediante la medición de sus actividades en ensayos de laboratorio 2-4, ya que es muy difícil de detectar y cuantificar directamente las enzimas. Actividad de la enzima extracelular (EEE) está más fuertemente controlada por la concentración de enzimas y sustratos correspondientes. La abundancia de diferentes C-, N-, y P-enzimas de degradación en suelos es controlado por numerosos factores including biomasa microbiana, composición de la comunidad, la disponibilidad de sustrato, el microclima, y las demandas estequiométricas 5,6. Sin embargo, en los EEA situ dentro del ambiente del suelo también se ven afectados por la temperatura 7,8, la unión de las enzimas a las arcillas del suelo y propiedades húmicos 2, y las limitaciones de difusión 9, que en última instancia regulan la piscina enzima activa, en términos de tamaño, la disponibilidad de sustrato y tasas de rotación de 10 a 12. Por lo tanto, el reconocimiento de las condiciones del suelo in situ es fundamental cuando se utilizan ensayos enzimáticos de laboratorio para interpretar la función microbiana del suelo a través de diferentes sitios ambientales. Muchas clases diferentes de EEE se pueden cuantificar en ensayos de laboratorio utilizando una variedad de sustratos sintéticos (por favor, consulte la sección &quot;Lista de Reactivos Table&quot; para más detalles). Algunos protocolos utilizan sustratos en ensayos que se acoplan a una reacción colorimétrica que se puede detectar con un espectrofotómetro, Wientras que otros, incluido el protocolo como se describe aquí, utilizan sustratos que se unen a un resto fluorescente. Ensayos de EE fluorescencia son típicamente más sensibles (por un orden de magnitud) que los ensayos colorimétricos (que utilizar un resto cromogénico ligado con un sustrato sintético) 12-14. La sensibilidad en la detección del EEE incluye dos aspectos: uno está relacionado con la cantidad del compuesto de interés detectados y el otro relacionado con la actividad de la enzima potencial detectable más bajo. Métodos para colorimétrico P-nitrofenol ensayos (PNP) con sede en se pueden encontrar en las obras del pasado 15,16. En breve, el suelo (típicamente tamizada a &lt;2 mm y se seca al aire) se incuba a la temperatura óptima y o-campo relevante de pH. La velocidad a la que el producto de reacción liberada se determina colorimétricamente con un espectrofotómetro 14. La mayor sensibilidad de los ensayos enzimáticos de fluorescencia se debe en parte a la detección más sensible de la separación resto fluorogénico asociado con substrcomió la degradación en lugar de absorbancia grabación después de la separación de un resto cromogénico específico a una longitud de onda específica. Los dos indicadores fluorescentes sintéticos más utilizados son 4-metilumbeliferona (MUB) 17 y 7-amino-4-metil-cumarina (MUC) 18,19. Sustratos MUC vinculados son comúnmente asociados con la N-ricos sustratos sintéticos tales como proteínas y / o aminoácidos. Técnicas fluorescentes se desarrollaron por primera vez para las muestras acuáticas 20,21, y su aplicación a los suelos requiere controles para el enfriamiento de la señal y la interferencia 22,23. Ensayos Puede llevarse a cabo utilizando la química tradicional &quot;de sobremesa&quot;, con grandes volúmenes, o puede ser empleado en protocolos basado en una microplaca, con un mayor rendimiento, pero posiblemente el error más alto de medición. Si bien hay varios protocolos ampliamente citados para la detección fluorescente de los EEA en los suelos 24, muchos laboratorios emplean variaciones sutiles en estos protocolos, a menudo sin darse cuenta, o debido a la diferencias en el equipo de laboratorio o reactivos. Aparentemente pequeñas diferencias en los detalles de los protocolos fuertemente pueden afectar medido EEA 25,26 y la falta de enzimas estandarizados hace que sea difícil para calibrar ensayos entre diferentes laboratorios. Por lo tanto, existe una necesidad importante para la difusión de protocolos detallados para fomentar la normalización de los análisis del EEE. En nuestro protocolo, muestras de suelo se preparan mediante la combinación de muestras de suelo con un tampón de pH y homogeneizando con un mezclador. Las suspensiones se inoculan a continuación con una cantidad no limitante de marcado fluorescentemente C-, N-, o sustrato de la P-rico, elegido en función de la pregunta específica de investigación de interés. Uso de suelos fangosos en los ensayos de la enzima sirve como un control para reducir al mínimo las limitaciones de difusión sustrato. Los restos fluorescentes se enfriaron rápidamente hasta que se escinden de sus respectivos sustratos, y por lo tanto la actividad de la enzima se pueden detectar como el colorante fluorescente se libera del sustrato BY una reacción catalizada por la enzima. El aumento de la intensidad de fluorescencia a través del tiempo refleja la velocidad de la reacción catalizada por la enzima. El concepto general de la enzima de ensayo de fluorescencia es que los sustratos sintéticos unidos con un resto fluorogénico (tinte fluorescente), se añaden a las muestras de suelo 27. Durante la degradación de sustrato catalizada por la enzima, el enlace se rompe entre el colorante fluorescente y el sustrato. El colorante fluorescente liberado del sustrato se utiliza en consecuencia como una evaluación indirecta de la actividad enzimática, y se puede cuantificar usando un lector de microplacas para detectar la intensidad de la fluorescencia del colorante. En resumen, la cuantificación de la fluorescencia se logra cuando el tinte liberado emite luz de una longitud de onda después de absorber la luz de una longitud de onda diferente. La intensidad de fluorescencia se registra por un lector de placas capaz tanto de excitación y de detección. La actividad enzimática puede ser cuantificado posteriormente en base al conocido conce fluorescente-dyentrations del sustrato (es decir, cantidades conocidas de sustrato sintético añaden a muestras de suelo) junto con referencia a una curva de dilución estándar de las intensidades de fluorescencia para el resto fluorogénico específico del sustrato usada en el ensayo (es decir, 4-metilumbeliferona (MUB) o 7-amino -4-metil-cumarina (MUC)). (Por favor refiérase a la sección de protocolo para detalles específicos sobre la actividad enzimática de la cuantificación). Ensayos de enzimas del suelo Laboratorio son útiles para evaluar la función de la comunidad microbiana, pero hay varias limitaciones técnicas que los usuarios deben reconocer 10. Ensayos de fluorescencia pueden sufrir interferencias causadas por impurezas y / o inestabilidad de muchos compuestos fluorescentes cuando se exponen a la luz, por lo que debe tener cuidado al manipular sustratos fluorescentes 25. Partículas de suelo y / o material orgánico en los suelos fangosos también pueden interferir con la intensidad de fluorescencia, conocido como el efecto de extinción 26.Por otra parte, los ensayos enzimáticos de laboratorio sólo evalúa a los EEA potenciales en condiciones de laboratorio. Ensayos in vitro miden los EEA en condiciones donde la difusión del sustrato y la abundancia se limitantes. Por lo tanto, los datos aportados por estos ensayos pueden no ser un buen indicador de la EEA en virtud de las condiciones del suelo in situ 10. En general, la actividad enzimática es muy útil para comparaciones relativas en las que los tipos de suelo son similares. Sin embargo, cuando se utiliza este método para comparar las actividades de los suelos que difieren en sus propiedades físicas o químicas, debe utilizarse precaución. Esto es debido al hecho de que las diferencias en el tipo de suelo y la temperatura pueden alterar drásticamente el estado de en la cinética de enzimas in situ. Otra limitación es que relativamente pocos sustratos están disponibles comercialmente (en comparación con el medio ambiente natural). Además, los sustratos sintéticos utilizados para los ensayos de enzimas son relativamente simples (fácilmente soluble) puede no representar con precisión los sustratos de suelo presentes o dise in situ. Otro factor a considerar es que el uso de suelos fangosos incorporará la actividad de algunas enzimas estabilizadas (es decir, inmovilizados por la materia orgánica o arcillas) que pueden no ser activo en condiciones in situ 2. Ensayos enzimáticos Laboratorio también no proporcionan información sobre la persistencia de las enzimas en el suelo (las tasas de rotación de la enzima) o información sobre las especies de microbios específicos que están produciendo las enzimas del suelo.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents: </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#945;-D-glucopyranoside (AG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9766</td>
			<td>Sugar degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#946;-D-glucopyranoside (BG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3633</td>
			<td>Sugar degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#946;-D-cellobioside (CB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6018</td>
			<td>Cellulose degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2145</td>
			<td>Protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl N-acetyl-&#946;-D-glucosaminide (NAG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2133</td>
			<td>Chitin degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8883</td>
			<td>Phosphorus mineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl-&#946;-D-xylopyranoside (XYL)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7008</td>
			<td>Hemicellulose degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferone (MUB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-4-methylcoumarin (MUC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Sodium acetate anhydrous buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>acidic and neutral soils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris base buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td>basic soils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-65</td>
			<td>pipetting reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-684-265</td>
			<td>8-channel pipette, range: 50-1,200 &#956;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 101-1,250 &#956;l extended length natural tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1112 - 1720</td>
			<td>10 racks of 96 tips (960 tips)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-100SH</td>
			<td>Lab disc magnetic stir plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring blender</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-509-7P</td>
			<td>Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Dispensette III bottle-top dispensers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-688-231</td>
			<td>Dispenser; range: 5-50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Unispense &#956;P peristaltic pumps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-683-7</td>
			<td>Optional dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1451363SIX</td>
			<td>Used to stirr soil slurry afer blending</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass bowls</td>
			<td>World Kitchen</td>
			<td>5304218</td>
			<td>Pyrex 10 oz rimmed custard cup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96-well black solid plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-590</td>
			<td>Used for plate reader step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96-well assay blocks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-700</td>
			<td>V-bottom; 2 ml; sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-387-93</td>
			<td>Sterile 96-well cap mat for square wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge equipped with holders for deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3121</td>
			<td>Centra-GP8 (this model is no longer available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30016058</td>
			<td>Plate reader (this model is no longer available)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput fluorometric measurement of potential soil extracellular enzyme activities

Los microbios en suelos y otros entornos producen enzimas extracelulares despolimerizar y hidrolizar macromoléculas orgánicas para que puedan ser asimilados por la energía y los nutrientes. Medición de la actividad enzimática microbiana del suelo es crucial para entender la dinámica de los ecosistemas funcionales del suelo. El concepto general de la enzima de ensayo de fluorescencia es que sintético C-, N-, o sustratos de P-rica unidos con un tinte fluorescente se añaden a las muestras de suelo. Cuando intacta, los sustratos marcados no son fluorescentes. La actividad enzimática se mide como el aumento en la fluorescencia como los colorantes fluorescentes se separan de sus substratos, lo que permite una fluorescencia. Mediciones de enzimas se pueden expresar en unidades de molaridad o actividad. Para realizar este ensayo, suelos fangosos se preparan mediante la combinación de suelo con un tampón de pH. El tampón de pH (típicamente un acetato de sodio 50 mM o 50 mM de tampón de Tris), se elige para la constante del tampón particular ácido de disociación (pKa) para adaptarse mejor a la SA suelopH mple. Los suelos fangosos se inoculan con una cantidad no limitante de marcado con fluorescencia (es decir, C-, N-, o P-rica) sustrato. Uso de suelos fangosos en el ensayo sirve para reducir al mínimo las limitaciones de enzima y sustrato de difusión. Por lo tanto, este ensayo para los controles de las diferencias en la limitación de sustrato, las velocidades de difusión, y condiciones de pH del suelo; detectando así posibles tasas de actividad enzimática como una función de la diferencia de concentraciones de la enzima (por muestra). Ensayos enzimáticos Fluorescencia suelen ser más sensibles que los (es decir colorimétricos) ensayos espectrofotométricos, pero pueden sufrir interferencias causadas por las impurezas y la inestabilidad de muchos compuestos fluorescentes cuando se exponen a la luz, por lo que se requiere precaución al manipular sustratos fluorescentes. Del mismo modo, este método sólo evalúa actividades enzimáticas potenciales bajo condiciones de laboratorio cuando los sustratos no son limitantes. Se debe tener precaución al interpretar los datos que representa la cruz-sitio comparaciones con diferentes temperaturas y tipos de suelo, como in situ el tipo de suelo y la temperatura pueden influir en la cinética enzimática.

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High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Para medir las tasas potenciales de la actividad de las enzimas extracelulares del suelo, se añaden sustratos sintéticos que se unen a un tinte fluorescente para las muestras de suelo. La actividad enzimática se mide como el colorante fluorescente se libera del sustrato por una reacción catalizada por la enzima, donde mayor fluorescencia indica más degradación del sustrato.

De Alto Rendimiento Fluorometric Medición de Potencial del Suelo extracelulares enzimáticos Actividades

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

high-throughput-fluorometric-measurement-potential-soil-extracellular

Research

JoVE Journal

Environment

46.0K vistas.  Colorado State University.  Para medir las tasas potenciales de la actividad de las enzimas extracelulares del suelo, se añaden sustratos sintéticos que se unen a un tinte fluorescente para las muestras de suelo. La actividad enzimática se mide como el colorante fluorescente se libera del sustrato por una reacción catalizada por la enzima, donde mayor fluorescencia indica más degradación del sustrato. 

Video: High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Much of the nutrient cycling and carbon processing in natural environments occurs through the activity of extracellular enzymes released by microorganisms. Thus, measurement of the activity of these extracellular enzymes can give insights into the rates of ecosystem level processes, such as organic matter decomposition or nitrogen and phosphorus mineralization. Assays of extracellular enzyme activity in environmental samples typically involve exposing the samples to artificial colorimetric or fluorometric substrates and tracking the rate of substrate hydrolysis. Here we describe microplate based methods for these procedures that allow the analysis of large numbers of samples within a short time frame. Samples are allowed to react with artificial substrates within 96-well microplates or deep well microplate blocks, and enzyme activity is subsequently determined by absorption or fluorescence of the resulting end product using a typical microplate reader or fluorometer. Such high throughput procedures not only facilitate comparisons between spatially separate sites or ecosystems, but also substantially reduce the cost of such assays by reducing overall reagent volumes needed per sample.

Microplate based procedures are described for the colorimetric or fluorometric analysis of extracellular enzyme activity. These procedures allow for the rapid assay of such activity in large numbers of environmental samples within a manageable time frame.

Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Investigación

Medio ambiente

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes and soil organic matter formation to small-scale stable-isotope biomarker probing. Coupling multiple stable isotopes such as 13C with 15N, 18O or&#160;2H has the potential to reveal even more information about complex stoichiometric relationships during biogeochemical transformations. Isotope labeled plant material has been used in various studies of litter decomposition and soil organic matter formation1-4. From these and other studies, however, it has become apparent that structural components of plant material behave differently than metabolic components (i.e. leachable low molecular weight compounds) in terms of microbial utilization and long-term carbon storage5-7. The ability to study structural and metabolic components separately provides a powerful new tool for advancing the forefront of ecosystem biogeochemical studies. Here we describe a method for producing 13C and 15N labeled plant material that is either uniformly labeled throughout the plant or differentially labeled in structural and metabolic plant components.
Here, we present the construction and operation of a continuous 13C and 15N labeling chamber that can be modified to meet various research needs. Uniformly labeled plant material is produced by continuous labeling from seedling to harvest, while differential labeling is achieved by removing the growing plants from the chamber weeks prior to harvest. Representative results from growing Andropogon gerardii Kaw demonstrate the system&#39;s ability to efficiently label plant material at the targeted levels. Through this method we have produced plant material with a 4.4 atom%13C and 6.7 atom%15N uniform plant label, or material that is differentially labeled by up to 1.29 atom%13C and 0.56 atom%15N in its metabolic and structural components (hot water extractable and hot water residual components, respectively). Challenges lie in maintaining proper temperature, humidity, CO2 concentration,&#160;and light levels in an airtight 13C-CO2 atmosphere for successful plant production. This chamber description represents a useful research tool to effectively produce uniformly or differentially multi-isotope labeled plant material for use in experiments on ecosystem biogeochemical cycling.

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

This method explains how to build and operate a continuous 13C and 15N isotope labeling chamber for uniform or differential plant tissue labeling. Representative results from metabolic and structural labeling of Andropogon gerardii are discussed.

Diseño y aplicación de un continuo<sup&gt; 13</sup&gt; C y<sup&gt; 15</sup&gt; N Cámara Etiquetado de Uniforme o Diferencial, metabólico y estructural, Planta de isótopos de etiquetado

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to two families: Steinernematidae and Heterorhabditidae. Until now, more than 70 species have been described in the Steinernematidae and there are about 20 species in the Heterorhabditidae. The nematodes have a mutualistic partnership with Enterobacteriaceae bacteria and together they act as a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species.
Herein, we focus on the most common techniques considered for collecting EPN from soil. The second part of this presentation focuses on the insect-baiting technique, a widely used approach for the isolation of EPN from soil samples, and the modified White trap technique which is used for the recovery of these nematodes from infected insects. These methods and techniques are key steps for the successful establishment of EPN cultures in the laboratory and also form the basis for other bioassays that consider these nematodes as model organisms for research in other biological disciplines. The techniques shown in this presentation correspond to those performed and/or designed by members of S. P. Stock laboratory as well as those described by various authors.

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Entomopathogenic nematodes are soil-inhabiting roundworms that parasitize a wide range of insects. We demonstrate sampling methods used for the isolation of these nematodes from the soil using two techniques: the insect baiting and the modified White trap, for the recovery of nematodes from soil samples and infected insect cadavers, respectively.

Muestreo de suelos y aislamiento de nematodos entomopatógenos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the biogeochemical drivers of climate change and to the development and evaluation of GHG mitigation strategies based on modulation of landscape management practices. The static chamber-based method described here is based on trapping gases emitted from the soil surface within a chamber and collecting samples from the chamber headspace at regular intervals for analysis by gas chromatography. Change in gas concentration over time is used to calculate flux. This method can be utilized to measure landscape-based flux of carbon dioxide, nitrous oxide, and methane, and to estimate differences between treatments or explore system dynamics over seasons or years. Infrastructure requirements are modest, but a comprehensive experimental design is essential. This method is easily deployed in the field, conforms to established guidelines, and produces data suitable to large-scale GHG emissions studies.

This article showcases the static chamber-based method for measurement of greenhouse gas flux from soil systems. With relatively modest infrastructure investments, measurements may be obtained from multiple treatments/locations and over timeframes ranging from hours to years.

Medición de Flujo de Gas de efecto invernadero procedentes de los suelos agrícolas Usando cámaras estáticas

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely drought-tolerance traits. Fresh water availability for agricultural use is a growing concern across the United States as well as many regions of the world. Short-term drought events along with regulatory intervention in the regulation of water availability coupled with the looming threat of long-term climate shifts that may lead to reduced precipitation in many important agricultural regions has increased the need to hasten the development of crops adapted for improved water use efficiency in order to maintain or expand production in the coming years. This protocol is not meant as a step-by-step guide to identifying at either the physiological or molecular level drought-tolerance traits in lettuce, but rather is a method developed and refined through the screening of thousands of different lettuce varieties. The nature of this screen is based in part on the streamlined measurements focusing on only three water-stress indicators: leaf relative water content, wilt, and differential plant growth following drought-stress. The purpose of rapidly screening a large germplasm collection is to narrow the candidate pool to a point in which more intensive physiological, molecular, and genetic methods can be applied to identify specific drought-tolerant traits in either the lab or field. Candidates can also be directly incorporated into breeding programs as a source of drought-tolerance traits.

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

This protocol was developed to screen a large germplasm collection of the leafy vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) for drought-tolerance, in order to identify a small candidate pool of lettuce for use in physiological, molecular, and genetic studies to identify underlying drought-tolerance traits along with breeding programs.

Semi-Alto rendimiento para Screening Potencial Sequía-tolerancia en lechuga (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) colecciones de germoplasma

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a series of incubators. A temperature gradient is passively established across the surface of the table between the heated and cooled ends and is lost quickly at distances above the surface. Since temperature is only controlled on the table surface, experiments are restricted to shallow containers, such as Petri dishes, placed on the table. Welding continuous aluminum vertical strips or gussets perpendicular to the surface of a table enables temperature control in depth via convective heat flow. Soil in the channels between gussets was maintained across a gradient of temperatures allowing a greater diversity of experimentation. The gusseted design was evaluated by germinating oat, lettuce, tomato, and melon seeds. Soil temperatures were monitored using individual, battery-powered dataloggers positioned across the table. LED lights installed in the lids or along the sides of the gradient table create a controlled temperature chamber where seedlings can be grown over a range of temperatures. The gusseted design enabled accurate determination of optimum temperatures for fastest germination rate and the highest percentage germination for each species. Germination information from gradient table experiments can help predict seed germination and seedling growth under the adverse soil conditions often encountered during field crop production. Temperature effects on seed germination, seedling growth, and soil ecology can be tested under controlled conditions in a laboratory using a gusseted thermogradient table.

Traditional thermogradient tables create a range of temperatures across the surface. Welding gussets perpendicular to the surface of a thermogradient table will control temperature in depth increasing possible research applications.

Una tabla de fuelle Thermogradient para controlar las temperaturas del suelo para evaluar el crecimiento de la planta y Seguimiento de los procesos del suelo

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related research fields. Thanks to its unique features, including large fecundity, embryo translucency, rapid and simultaneous development, etc., zebrafish embryos are often used for large scale toxicity assessment of chemicals and drug/compound screening. A typical screening procedure involves adult zebrafish spawning, embryos selection, and arraying the embryos into multi-well plates. From there, embryos are subjected to exposure and the toxicity of chemical, or the effectiveness of the drugs/compounds can be evaluated relatively quickly based on phenotypic observations. Among these processes, embryos arraying is one of the most time-consuming and labor-intensive steps that limits the throughput level. In this protocol, we present an innovative approach that makes use of a 3D-printed arraying template coupled with vacuum manipulation to speed up this laborious step. The protocol herein describes the overall design of the arraying template, a detailed experimental setup and step-by-step procedure, followed by representative results. When implemented, this approach should prove beneficial in a variety of research applications using zebrafish embryos as testing subjects.

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Here, we present a protocol to design and fabricate a zebrafish embryo arraying template, followed by a detailed procedure on the use of such template for high throughput zebrafish embryo arraying into a 96-well plate.

3 dimensiones (3D)-impreso la plantilla para alto rendimiento embrión de pez cebra matriz

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Use of Principal Components for Scaling Up Topographic Models to Map Soil Redistribution and Soil Organic Carbon

Landscape topography is a critical factor affecting soil formation and plays an important role in determining soil properties on the earth surface, as it regulates the gravity-driven soil movement induced by runoff and tillage activities. The recent application of Light Detection and Ranging (LiDAR) data holds promise for generating high spatial resolution topographic metrics that can be used to investigate soil property variability. In this study, fifteen topographic metrics derived from LiDAR data were used to investigate topographic impacts on redistribution of soil and spatial distribution of soil organic carbon (SOC). Specifically, we explored the use of topographic principal components (TPCs) for characterizing topography metrics and stepwise principal component regression (SPCR) to develop topography-based soil erosion and SOC models at site and watershed scales. Performance of SPCR models was evaluated against stepwise ordinary least square regression (SOLSR) models. Results showed that SPCR models outperformed SOLSR models in predicting soil redistribution rates and SOC density at different spatial scales. Use of TPCs removes potential collinearity between individual input variables, and dimensionality reduction by principal component analysis (PCA) diminishes the risk of overfitting the prediction models. This study proposes a new approach for modeling soil redistribution across various spatial scales. For one application, access to private lands is often limited, and the need to extrapolate findings from representative study sites to larger settings that include private lands can be important.

Landscape processes are critical components of soil formation and play important roles in determining soil properties and spatial structure in landscapes. We propose a new approach using stepwise principal component regression to predict soil redistribution and soil organic carbon across various spatial scales.

Uso de componentes principales para el escalado de modelos topográficos a mapa de redistribución de la tierra y el suelo de carbono orgánico

Landscape topography is a critical factor affecting soil formation and plays an important role in determining soil properties on the earth surface, as it ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling in soils, to pathogen competition, plant growth promotion, and cross-kingdom signaling. Furthermore, siderophores are also of commercial interest in bioleaching and bioweathering of metal-bearing minerals and ores. A rapid, cost effective, and robust means of quantitatively assessing siderophore production in complex samples is key to identifying important aspects of the ecological ramifications of siderophore activity, including, novel siderophore producing microbes. The method presented here was developed to assess siderophore activity of in-tact microbiome communities, in environmental samples, such as soil or plant tissues. The samples were homogenized and diluted in a modified M9 medium (without Fe), and enrichment cultures were incubated for 3 days. Siderophore production was assessed in samples at 24, 48, and 72 hours (h) using a novel 96-well microplate CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar assay, an adaptation of the traditionally tedious and time-consuming colorimetric method of assessing siderophore activity, performed on individual cultivated microbial isolates. We applied our method to 4 different genotypes/Lines of wheat (Triticum aestivum L.), including Lewjain, Madsen, and PI561725, and PI561727 commonly grown in the inland Pacific Northwest. Siderophore production was clearly impacted by the genotype of wheat, and in the specific types of plant tissues observed. We successfully used our method to rapidly screen for the influence of plant genotype on siderophore production, a key function in terrestrial and aquatic ecosystems. We produced many technical replicates, yielding very reliable statistical differences in soils and within plant tissues. Importantly, the results show the proposed method can be used to rapidly examine siderophore production in complex samples with a high degree of reliability, in a manner that allows communities to be preserved for later work to identify taxa and functional genes.

We present a protocol for rapid screening of environmental samples for siderophore potential contributing to micronutrient bioavailability and turnover in terrestrial systems.

Pseudobactina high-throughput Screening de muestras ambientales: los tejidos, a granel suelos y rizosfera de suelos de la planta

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a significant role in plant growth and development by providing strength, rigidity, rate and direction of cell growth, cell shape maintenance, and protection from biotic and abiotic stressors. The cell wall is primarily composed of cellulose, lignin, hemicellulose and pectin. Recently plant cell walls have been targeted for the second-generation biofuel and bioenergy production. Specifically, the cellulose component of the plant cell wall is used for the production of cellulosic ethanol. Estimation of cellulose content of biomass is critical for fundamental and applied cell wall research. The Updegraff method is simple, robust, and the most widely used method for the estimation of crystalline cellulose content of plant biomass. The alcohol insoluble crude cell wall fraction upon treatment with Updegraff reagent eliminates the hemicellulose and lignin fractions. Later, the Updegraff reagent resistant cellulose fraction is subjected to sulfuric acid treatment to hydrolyze the cellulose homopolymer into monomeric glucose units. A regression line is developed using various concentrations of glucose and used to estimate the amount of the glucose released upon cellulose hydrolysis in the experimental samples. Finally, the cellulose content is estimated based on the amount of glucose monomers by colorimetric anthrone assay.

The Updegraff method is the most widely used method for the cellulose estimation. The main purpose of this demonstration is to provide a detailed Updegraff protocol for estimation of cellulose content in plant biomass samples.

Estimación del contenido de celulosa cristalina de biomasa vegetal utilizando el método Updegraff

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...