Este proyecto fue financiado por el NIH (R21EB013717) y IUPUI OVCR (RSFG). El autor agradece a la Sra. Han Tzu por su asistencia técnica.

A. Síntesis de péptidos y Macrómero <ol><li> Sintetizar 4-brazo PEG-norborneno (PEG4NB) y arylphosphanate fotoiniciador de litio (LAP) utilizando protocolos establecidos. 18,19 </li><li> Sintetizar bis-cisteína que contiene quimotripsina sensible al péptido CGGY ↓ C (la flecha indica el sitio de escisión quimotripsina) utilizando estándar de síntesis de péptidos en fase sólida en un sintetizador de péptidos de microondas (CEM Discover SPS). <ol class="lalpha"><li> Calcular la cantidad de resina (Rink-amida resina MBHA) necesario en base a la relación de sustitución de la resina y la escala de síntesis. Hinchar la resina en dimetilformamida (DMF) en un recipiente de reacción (RV) durante 15 min. </li><li> Eliminar el grupo protector Fmoc de la resina usando una solución de desprotección que contiene 20% de piperidina y 0,1 M de HOBt en DMF. Utilizar los parámetros enumerados en la tabla siguiente para asistida por microondas Fmoc-desprotección (para todos los ácidos Fmoc-aminoácidos): <table border="1"><tbody><tr><td> Síntesis escala </strong&gt; </td><td> 0,1 mmol </td><td> 0,2 mmol </td></tr><tr><td> Poder </td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td> Temperatura </td><td> 75 ° C </td><td> 75 ° C </td></tr><tr><td> Tiempo </td><td> 3 min </td><td> 3 min </td></tr></tbody></table></li><li> Después de la desprotección, enjuague de la resina con DMF y realizar la prueba de ninhidrina para confirmar la eliminación de Fmoc (exposición de amina N-terminal). Resina debe ponerse azul después de 2 min a 95 ° C. </li><li> Después de la desprotección con éxito par, la primera Fmoc-aminoácido en el extremo C-terminal (síntesis va de C a N-terminal) en una solución de base activador (0,28 M diisopropiletilamina (DIEA) en DMF) con los parámetros enumerados en la tabla siguiente . <table border="1"><tbody><tr><td> Síntesis escala </td><td> 0,1 mmol </td><td> 0,2 mmol </td&gt; </tr><tr><td> Poder </td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td> * Temperatura </td><td> 75 ° C </td><td> 75 ° C </td></tr><tr><td> Tiempo * </td><td> 5 min </td><td> 5 min </td></tr></tbody></table> * Para quiste y Su, use 50 ° C y 10 minutos para reducir la racemización. </li><li> Enjuagar la resina y realizar una prueba de ninhidrina para confirmar cualitativamente la finalización de acoplamiento (desaparición de amina N-terminal). Resina debe ser clara después de 5 min a 95 ° C. Repita el paso de acoplamiento (A.2.d) si la prueba de ninhidrina devuelve un resultado positivo (color azul). </li><li> Desprotección repetición (paso A.2.b) y el acoplamiento (A.2.d paso) para aminoácidos adicionales en la secuencia termina con una etapa de desprotección final. </li><li> Escurrir la RV, enjuague resina con 25 ml de diclorometano (DCM). Este paso es para enjuagar DMF, que es una base y obstaculizará escisión del péptido. </li><li> Preparar un cocktail de escisión mediante la mezcla de 250 mfenol en 4,75 ml de ácido trifluoroacético (TFA), 0,125 ml de triisopropilsilano (TIS) y 0,125 ml ddH 2 O. g </li><li> Añadir solución de escisión en el RV y escindir durante 30 minutos en el sintetizador de péptidos de microondas (potencia = 20 W; Temperatura = 38 ° C). </li><li> Recoger la solución de péptido en un tubo de centrífuga de 50 ml utilizando colector de vacío. </li><li> Péptido escindido precipitado en 40 ml de éter, el tubo vortex y se centrifuga a 3.000 rpm durante 5 min para recoger el péptido. </li><li> Vaciar el sobrenadante y repetir A.2.k paso dos veces. </li><li> Recoger y secar péptido en el vacío. </li><li> Se purifica el péptido mediante HPLC y caracterizar con espectrometría de masas. </li></ol></li></ol> B. Preparación de Material y Esterilización <ol><li> Preparar solución en peso PEG4NB 20% en PBS, vórtice la mezcla hasta que se disuelve completamente el macrómero, y esterilizar la solución de macrómero utilizando un filtro de jeringa. Guarde la solución se esterilizó a -20 ° C (preparar alícuotaspara almacenamiento a largo plazo). </li><li> Preparar y esterilizar fotoiniciador 2% en peso (LAP) en solución de PBS. Almacenar la solución esterilizada a temperatura ambiente protegido de la luz. </li><li> Disolver el péptido (CGGYC) en PBS, la mezcla de vórtice y filtro de jeringa de la solución para la esterilización. Alícuota de la solución de péptido y se almacena a -20 ° C hasta su uso (evitar ciclos de congelación-descongelación). </li><li> Determinar tiol (-SH) concentración en la solución de péptido preparado usando el reactivo de Ellman (seguir el protocolo del fabricante). Este paso dará la concentración de péptido exacta (es decir, [SH] / 2) que se requiere para el cálculo de la cantidad de péptidos a usar en tiol-eno de fotos clic reacciones. </li><li> Preparar los moldes de gelificación por el corte de la porción superior fuera de jeringas de 1 ml estériles desechables usando una hoja de afeitar (punta abierta para la eliminación de gel). Esterilizar los moldes de jeringa por autoclave. </li><li> Basado en la formulación de gel deseada (relación de tiol a eno = 1) y las concentraciones de compañero de stockriales, calcular el volumen requerido de polímero, agente reticulante péptido, fotoiniciador, y soluciones de tampón requerido. </li></ol> C. Preparación de la célula <ol><li> Equilibrar medio de cultivo celular (alta glucosa DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino; antibiótico-antimicótico con 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 250 ng / ml de Fungizone, y 50 mM β mercaptoetanol-), Hank de solución salina equilibrada ( HBSS, Ca 2 +, Mg 2 + libre) y tripsina-EDTA a 37 º C. </li><li> Retirar frascos que contienen MIN6 β-células de CO 2 incubadora y colocar los frascos en la campana de flujo laminar. </li><li> Aspirar los medios de cultivo de células de los matraces y lavar la cubeta con HBSS. </li><li> Tripsinizar las células utilizando 3 ml de 2X (0,1%) Tripsina-EDTA y se incuban los matraces durante 4 min a 37 ° C y 5% CO 2. <ul><li> Nota: Utilice 2X solución de tripsina permite la disociación completa de MIN6 β-células en suspensión de células individuales. </li></ul> &lt;/ Li&gt; <li> Después de la incubación, los matraces toque en la superficie de la campana suavemente para desprender completamente las células. Confirmar el desprendimiento y la disociación de las células utilizando un microscopio. </li><li> Añadir un volumen igual de medio de cultivo celular para neutralizar la tripsina. Mezclar bien la solución mediante pipeteo suave, a continuación, transferir la mezcla a un tubo de centrífuga y canónica durante 5 min a 1.000 rpm. </li><li> Aspirar el sobrenadante y volver a suspender suavemente las células en 4 - 5 ml de medios de cultivo. </li><li> Determinar la densidad celular usando Trypan 50% tampón azul en un hemocitómetro. </li></ol> D. Fabricación de hidrogel y encapsulación de células <ol><li> Una vez que las células están listas, mezcla (basado en una relación de 1:1 a tiol eno) los volúmenes requeridos de PEG4NB, CGGYC, LAP, solución de células, y HBSS en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Mezclar la solución suavemente con una pipeta para obtener una mezcla homogénea y añadir 25 ml de la solución resultante a un molde de jeringa. Exponer la jeringa a la luz UV (365nm, 5 mW / cm 2) durante 2 min. </li><li> Después de fotopolimerización, geles de inmersión en una solución estéril de 24 pocillos placa que contiene medio de cultivo celular y se incuban los hidrogeles en 37 º C y 5% de CO 2. </li><li> Lavar los hidrogeles de células cargadas en medio de cultivo celular durante 30 minutos para enjuagar las células poco adheridas y macrómeros no reticulado. Transferir los geles en medio fresco. </li><li> Actualizar medios de cultivo celular cada 2 a 3 días. </li></ol> E. Ensayo de Viabilidad Celular Morfología celular encapsulado se puede observar al microscopio de luz (ya que los hidrogeles sintetizados son transparentes). La viabilidad celular se puede visualizar y medir cualitativamente usando Live / Dead manchas y cuantitativamente utilizando el reactivo AlamarBlue. E.1. Live / Dead tinción <ol><li> Descongelar Live / Dead reactivos de tinción a temperatura ambiente. </li><li> En un tubo canónica añadir PBS de acuerdo con el número de muestras (n) a ser teñido: <strong&gt; volumen total de PBS = n × 500 l </li><li> Pipetear 0,25 l de calceína AM y 2 l de EthD-1 por 1 ml de PBS al tubo canónica que contiene PBS. Vortex la solución para mezclar los componentes. </li><li> Incubar células cargadas de hidrogeles en solución de tinción LIVE / DEAD (0,5 ml / muestra) durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador orbital. </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur, se retira la solución colorante y enjuagar la muestra dos veces con PBS. </li><li> Colocar la muestra en un cubreobjetos o portaobjetos de vidrio. Observar y celdas de imagen con un microscopio confocal. </li></ol> E.2. AlamarBlue Ensayo <ol><li> Preparar 10 v / v% AlamarBlue solución en medio de cultivo celular. </li><li> Eliminar los hidrogeles de la incubadora y aspirar los medios de comunicación de cada pocillo sin hacer contacto con el hidrogel. </li><li> Incubar células cargadas de hidrogeles y un (control negativo) se vacía bien en 500 l de 10% de solución de AlamarBlue durante 16 horas. </li><li> Después de la incubación, pipeta 200 lde la solución de AlamarBlue en una placa de 96 pocillos y la fluorescencia medida usando un lector de microplacas (excitación: 560 nm, emisión: 590 nm). <ul><li> Actividad metabólica celular Superior reduce el tinte para dar mayor lectura de fluorescencia. </li><li> Asegúrese de incluir por lo menos dos pozos de solución al 10% alamarBlue como espacios en blanco. Al analizar los datos, se resta el valor de fluorescencia promedio en blanco de la lectura de la fluorescencia de las muestras. </li></ul></li></ol> F. La quimotripsina mediada Gel Erosión y recuperación Esferoide <ol><li> Preparar 1 mg / ml de tripsina libre de α-quimotripsina solución en HBBS y solución estéril de filtro. </li><li> Incubar hidrogeles en solución quimotripsina (500 l para cada gel) a temperatura ambiente con agitación suave hasta que la erosión del gel completo se logra. <ul><li> Para un gel de 25 l, el tiempo para la erosión total es de aproximadamente 5 min. </li></ul></li><li> Colocar la placa en hielo durante unos minutos para reducir la actividad de losquimotripsina. </li><li> Transferir la solución de células en un tubo de 1 ml y se centrifuga a 300 rpm, 4 º C durante 2 min. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de pastos y resuspender suavemente los esferoides en HBSS. </li><li> Transferir la solución recuperada esferoide a una placa de 24 pocillos y coloque la placa en hielo para permitir que los esferoides para establecerse. </li><li> Para el análisis de tamaño, adquirir imágenes de contraste de fase de los esferoides se establecieron utilizando un microscopio óptico. Medida recuperado diámetro esferoidal utilizando un programa como elemento de Nikon o software ImageJ. </li></ol> G. Ensayo Funcional de esferoides recuperados G.1. Glucosa estimulada por insulina, la secreción de los esferoides de células recuperadas <ol><li> En una placa de 24 pocillos, se incuban los geles en 500 l de 2 mM de glucosa bajo Kerbs-Ringer (KRB) durante 1 hora. </li><li> Erode el gel y recuperar esferoides celulares usando pasos F.1 a F.6. </li><li> Aspirar el sobrenadante cuidadosamente sin hacer ningúncontacto con los esferoides de células y resuspender los esferoides en 500 l de 2 KRB mM glucosa baja. </li><li> Transferir 100 l de solución de células esferoides a un tubo de 0,6 ml y colocarlo en hielo durante intracelular cuantificación ATP. </li><li> Dividir la solución de células restante esferoide en un medio (en dos tubos de microcentrífuga) y centrifugar durante 2 minutos a 300 rpm y 4 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante (casi hasta el fondo) y resuspender el medio primero de esferoides de células en 1 ml de 25 mM glucosa KRB alto y medio segundo en 1 ml de 2 mM KRB bajo en glucosa. </li><li> Suavemente la pipeta y transferir la solución que contiene recuperados esferoides de células a una placa de 24 pocillos. Incubar la placa durante 1 hora a 37 ° C y 5% CO 2. </li><li> Después de la incubación, transferir la solución a un tubo de microcentrífuga y se centrifuga durante 2 min a 1.000 rpm y 4 ° C. </li><li> Transferir 500 l del sobrenadante del tubo se centrifugó a otro tubo de microcentrífuga y se almacena a 4 ° C durante la insulinaELISA. </li><li> Realizar protocolo de insulina fabricante ELISA siguiente. </li></ol> G.2. CellTiter Glo Ensayo <ol><li> Normas ATP: Preparar una solución de 10 mM ATP y realizar diluciones en serie para obtener una serie de soluciones estándar 8. </li><li> Para un color blanco placa de 96 pocillos, se añaden 50 l de solución de células esferoide (del paso G.1.6) y las normas. </li><li> A cada pocillo que contiene muestras y estándares, se añaden 50 l de reactivo CellTiter Glo e incubar a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Después de la incubación, el recuento de medida de la luminiscencia de las muestras y estándares utilizando un lector de microplacas y calibrar muestra las concentraciones de ATP utilizando una curva de regresión lineal generado por los estándares de ATP. </li><li> Determine el total de la concentración de ATP en la muestra y se multiplica por el factor de dilución de la muestra para obtener la concentración intracelular de ATP en una célula cargada de hidrogel. </li></ol> G.3. Determinar la secreción de insulina <ol><li> Calcular la amount de insulina secretada a partir de los esferoides recuperados tomando la relación de la cantidad de insulina secretada en el medio de glucosa mayor a la cantidad de insulina secretada en el medio de glucosa baja. </li><li> Normalizar el contenido de insulina cuantificada de esferoides de células con cantidad respectiva de ATP intracelular de los esferoides de células recuperadas. </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

El protocolo descrito presenta detalles sobre la encapsulación fácil de células en tiol-eno hidrogeles formados por fotopolimerización por crecimiento en etapas. Mientras que una relación estequiométrica de 1:1 de norborneno de grupos funcionales tiol se utilizó en este protocolo, la relación puede ser ajustada dependiendo de los experimentos. Además de una formulación correcta, es importante para mantener la homogeneidad en la solución de pre-polímero. En particular, el uso pipeteo suave para asegurar que l...

Los hidrogeles son polímeros hidrófilos reticulados con un potencial excepcional como los materiales del armazón para tejidos reparación y regeneración. 1-3 El alto contenido de agua de los hidrogeles permite la fácil difusión de oxígeno y el intercambio de nutrientes y productos metabólicos celulares, todas las cuales son cruciales para mantener la viabilidad celular. Además, los hidrogeles son excelentes portadores para la liberación controlada y suministro de células debido a su alta capacidad de ajuste. 2 hidrogeles sintéticos tales como los preparados a partir de poli (etilenglicol) (PEG) se utiliza cada vez más en aplicaciones de ingeniería de tejidos, en gran parte debido a su cytocompatibility, tejido- como elasticidad, y capacidad de sintonización de alta en el material de propiedades físicas y mecánicas. 4-6 Aunque una plataforma de hidrogel de uso común, los estudios han demostrado que el PEG diacrilato (PEGDA) hidrogeles formados por photopolymerizations crecimiento de cadena tienen una tendencia a dañar las células encapsuladas during reticulación de la red y en la encapsulación de células in situ. 7 El daño celular se atribuyó en gran medida a las especies de radicales generados por las moléculas de fotoiniciador, que se propagan a través de los grupos vinilo sobre PEGDA para reticular las cadenas de polímero en hidrogeles. Desafortunadamente, estas especies de radicales también causar tensiones y daño celular durante la encapsulación de células, especialmente para las células sensibles a radicales tales como el de páncreas β-células. 8-10 Con el fin de obtener un tamaño de malla más alta para una mejor difusión y la supervivencia celular, pesos moleculares más altos PEGDA se utilizan a menudo para la encapsulación de células. Esto, sin embargo, compromete la cinética de polimerización y causa sub-óptimas propiedades de gel biofísicos. 7,11,12 Además de las desventajas anteriormente mencionadas, es muy difícil de recuperar las estructuras celulares a partir de hidrogeles PEGDA debido a la naturaleza heterogeneidad y no degradable de las redes reticuladas. Mientras sensibles a la proteasa péptidos pueden ser incorporadosen esqueleto de PEG macrómero para hacer que los hidrogeles PEGDA otra parte inertes sensibles a la escisión enzimática, la conjugación a menudo usa reactivos caros y las redes resultantes contienen todavía alto grado de heterogeneidad debido a la naturaleza de la polimerización de crecimiento de cadena. 13-15 Recientemente, PEG-péptido hidrogeles formados a través de tiol-eno por crecimiento en etapas de fotopolimerización se ha demostrado que exhiben propiedades preferentes para la encapsulación de células a través de los hidrogeles formados por fotopolimerización crecimiento de cadena. 7 La cinética de gelificación superiores de tiol-eno hidrogeles se atribuye al clic &quot; &quot;la naturaleza de la reacción entre tiol y funcionalidades ENE. En comparación con la polimerización de crecimiento de cadena PEGDA, tiol-eno de reacción es menor de oxígeno inhibe la que los resultados de la tasa de gelificación más rápido. 16,17 tiol-eno hidrogeles también tienen una mayor eficiencia de polimerización y mejores propiedades biofísicas de gel en comparación con PEGDA crecimiento de cadena hidrogeles, 7 , 18 &lt;/ Sup&gt;, que se traduce en un daño limitado celular causada por especies de radicales durante la fotopolimerización. Anteriormente, tiol-eno hidrogeles formados por PEG-norborneno 4-brazo (PEG4NB) macrómero y bis-cisteína que contienen reticulantes de péptidos, tales como péptidos sensibles a proteasa se ​​han utilizado para encapsulación de células. 7,18 tunability alta de las redes de hidrogel de PEG ofrece una microambiente 3D flexible y controlable para investigar la supervivencia celular y la actividad, mientras que el uso de proteasa sensible a la secuencia del péptido proporciona una manera suave para la recuperación de las construcciones de células formadas naturalmente dentro de los hidrogeles. En este protocolo, se utilizan por crecimiento en etapas fotopolimerizado tiol-eno hidrogeles fabricados usando 4-brazo PEG-norborneno (PEG4NB) y un agente de reticulación péptido con quimotripsina sensible (CGGY ↓ C) para la encapsulación de las células MIN6 β. Este protocolo sistemáticamente elabora técnicas para el estudio de la formación de la supervivencia, proliferación y esferoide de MIN6β-células en tiol-eno hidrogeles. Además proveímos método para la recuperación de las células β esferoide y caracterización biológica de los esferoides recuperados.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 4-brazo PEG (20 kDa) </td><td> Jenkem Tecnología de EE.UU. </td><td> 4ARM-PEG-20K </td><td></td></tr><tr><td> Fmoc-aminoácidos </td><td> Anaspec </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Live / Dead celular kit de viabilidad </td><td> Invitrogen </td><td> L3224 </td><td> Incluye calceína AM y homodímero de etidio-1 </td></tr><tr><td> AlamarBlue reactivo </td><td> AbD Serotec </td><td> BUF012 </td><td></td></tr><tr><td> CellTiter Glo reactivo </td><td> Promega </td><td> G7570 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td> Sin Ca +2 y Mg +2 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Lonza </td><td> 10547F </td><td> SinCa +2 y Mg +2 </td></tr><tr><td> DMEM alto en glucosa </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000-044 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7522-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 15400-054 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina libre de α-quimotripsina </td><td> Worthington Biochemical Corp </td><td> LS001432 </td><td></td></tr><tr><td> Ratón Inusin kit ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml jeringa desechable </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation and recovery of &beta;-cell spheroids from step-growth peg-peptide hydrogels

Los hidrogeles son polímeros reticulados hidrófilos que proporcionan un microentorno tridimensional con tejido-como elasticidad y alta permeabilidad para el cultivo de células o tejidos terapéuticamente relevantes. Los hidrogeles preparados a partir de poli (etilenglicol) (PEG) derivados se utilizan cada vez más para una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos, en parte debido a sus propiedades sintonizables y citocompatible. En este protocolo, se utilizó tiol-eno de crecimiento paso a photopolymerizations para fabricar PEG-péptido hidrogeles para encapsular pancreático MIN6 células b. Los geles fueron formados por PEG-norborneno 4-brazo (PEG4NB) macrómero y un agente de reticulación péptido con quimotripsina sensible (CGGYC). La naturaleza hidrófila y no la formación de incrustaciones de PEG ofrece un microambiente citocompatible para la supervivencia y la proliferación celular en 3D, mientras que el uso de la secuencia del péptido con quimotripsina sensible (C GGY ↓ C, flecha indica el sitio de escisión de enzima, mientras que el quiste terminalesresiduos eine se añadieron para tiol-eno reticulación) permite una rápida recuperación de los constructos de células que forman dentro del hidrogel. El siguiente protocolo elabora técnicas para: (1) La encapsulación de MIN6 β-células en tiol-eno hidrogeles, (2) ensayos de células cualitativos y cuantitativos de viabilidad para determinar la supervivencia y la proliferación celular; (3) Recuperación de esferoides de células usando quimotripsina mediada gel erosión, y (4) Análisis estructural y funcional de los esferoides recuperados.

<html> Las figuras 1-4 muestran los resultados representativos para la encapsulación, la supervivencia, la proliferación, la formación de esferoides, y la recuperación esferoide en tiol-eno hidrogeles. Figura 1 muestra el esquema de reacción de (1) por crecimiento en etapas tiol-eno fotopolimerización usando PEG4NB y CGGYC, y ( 2) quimotripsina erosión gel mediada que sigue un mecanismo de erosión de la superficie. Figuras 2 y 3 los resultados de...

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Generation and Recovery of &amp;#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

El siguiente protocolo proporciona técnicas para encapsular las células β del páncreas en PEG-péptido crecimiento paso a hidrogeles formados por tiol-eno clic en la foto-reacciones. Esta plataforma de material no sólo ofrece un microambiente citocompatible para encapsulación de células, sino que permite también controlada por el usuario rápida recuperación de las estructuras celulares formadas dentro de los hidrogeles.

Generación y Recuperación de β-células esferoides de PEG-péptido de crecimiento Paso hidrogeles

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

generation-recovery-cell-spheroids-from-step-growth-peg-peptide

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

14.1K vistas.  Indiana University - Purdue University at Indianapolis. El siguiente protocolo proporciona técnicas para encapsular las células β del páncreas en PEG-péptido crecimiento paso a hidrogeles formados por tiol-eno clic en la foto-reacciones. Esta plataforma de material no sólo ofrece un microambiente citocompatible para encapsulación de células, sino que permite también controlada por el usuario rápida recuperación de las estructuras celulares formadas dentro de los hidrogeles.

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A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Investigación

Bioingeniería

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Los hidrogeles de alginato para la cultura del órgano en tres dimensiones de los ovarios y oviductos

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formación luz mediada y el patrón de hidrogeles para aplicaciones de cultivo celular

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Producción de la proteína elastina como hidrogeles para encapsulación y el Immunostaining de células en 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Cepa controlada de hidrogeles 3D bajo imágenes de microscopía en vivo

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

Biofabricación asequible asistida por microscopía de oxígeno de esferoides multicelulares

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have many advantageous properties, including injectability, microscale porosity, and tunability by mixing multiple microgel populations. Methods to fabricate microgels often rely on water-in-oil emulsions (e.g., microfluidics, batch emulsions, electrospraying) or photolithography, which may present high demands in terms of resources and costs, and may not be compatible with many hydrogels. This work details simple yet highly effective methods to fabricate microgels using extrusion fragmentation and to process them into granular hydrogels useful for biomedical applications (e.g., 3D printing inks). First, bulk hydrogels (using photocrosslinkable hyaluronic acid (HA) as an example) are extruded through a series of needles with sequentially smaller diameters to form fragmented microgels. This microgel fabrication technique is rapid, low-cost, and highly scalable. Methods to jam microgels into granular hydrogels by centrifugation and vacuum-driven filtration are described, with optional post-crosslinking for hydrogel stabilization. Lastly, granular hydrogels fabricated from fragmented microgels are demonstrated as extrusion printing inks. While the examples described herein use photocrosslinkable HA for 3D printing, the methods are easily adaptable for a wide variety of hydrogel types and biomedical applications.

This work describes straightforward, adaptable, and low-cost methods to fabricate microgels with extrusion fragmentation, process the microgels into injectable granular hydrogels, and apply the granular hydrogels as extrusion printing inks for biomedical applications.

Fragmentación de hidrogeles a granel y procesamiento en hidrogeles granulares para aplicaciones biomédicas

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Esferoides hepáticos humanos de sangre periférica para estudios de enfermedad hepática

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

Generación, detección de alto rendimiento y biobancos de esferoides cardíacos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...