Nuestro protocolo es importante porque permite la producción eficiente a gran escala de esferoides de tejidos homogéneos, que son fundamentales para nuestras aplicaciones avanzadas de ingeniería de tejidos, desarrollo de fármacos y modelado de enfermedades. La principal ventaja de esta técnica es su capacidad para producir grandes cantidades de esferoide de tejido uniforme de forma rápida y rentable, garantiza la alta viabilidad celular y la calidad del esferoide, que es crucial en nuestras diversas aplicaciones biomédicas. Al producir esteroides específicos para cada paciente, esta técnica ofrece un modelo fisiológicamente preciso, lo que permite un modelado preciso de la enfermedad y la comprensión de los mecanismos moleculares y conductuales. incluido el cáncer. Este método puede proporcionar información sobre la investigación del cáncer, las enfermedades neurodegenerativas y la ingeniería de tejidos, y se puede aplicar al desarrollo de fármacos y a la medicina personalizada, mejorando nuestra comprensión de diversos sistemas biológicos.
Nuestra demostración de visión es fundamental, ya que ilustra claramente los pasos intrincados, como la inserción del dispositivo y la siembra de células, lo que ayuda a prevenir errores comunes y garantiza que la técnica adecuada sea un colchón para obtener resultados consistentes. Comience agregando el polvo de agarosa en un x PBS para preparar gel de agarosa al 2% en un recipiente de vidrio. Homogeneizar la suspensión con movimientos circulares.
Coloque el recipiente de vidrio en un horno de microondas y ajuste el tiempo a 30 segundos. Detenga el microondas cada cinco segundos, retire la botella de vidrio y homogeneice manualmente la solución con movimientos circulares. Realice el proceso de calentamiento, hasta que la solución alcance un estado límpido líquido.
A continuación, agregue seis mililitros de la solución de agarosa a cada pocillo de una placa de seis pocillos y espere 15 minutos o hasta que la agarosa se solidifique. A continuación, inserte suavemente el biodispositivo impreso en 3D sobre la agarosa líquida y espere 30 minutos o hasta que la agarosa se solidifique. A continuación, retire suavemente el dispositivo de la agarosa y añada dos mililitros de medios DMEM.
Espere 10 minutos antes de desechar el medio y reemplazarlo con DMEM nuevo. Repite el lavado tres veces. Una vez hecho esto, agregue dos mililitros de DMEM y coloque la placa de seis pocillos para la siembra de células a 37 grados centígrados en una incubadora con 5% de dióxido de carbono y 80% de humedad.
Cultivar las células de fibroblastos de ratón en matraces de cultivo celular y mantenerlas a 37 grados centígrados en una incubadora con 5% de dióxido de carbono, hasta alcanzar el 80% de confluencia. A continuación, lavar las células con un x PBS y añadir la enzima de disociación. Incubar las células durante dos a cinco minutos a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y un 80% de humedad.
Una vez que las células se separan del matraz de cultivo celular, agregue un medio de crecimiento para neutralizar la enzima de disociación celular. Centrifugar la suspensión celular a 400 G durante cinco minutos a temperatura ambiente y contar las celdas. A 50 por 10 a la potencia de cinco pilas tomadas en un tubo, agregue cinco mililitros de un x PBS.
A continuación, centrifugar la suspensión celular a 400 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retirar el sobrenadante con una pipeta antes de añadir un mililitro del medio de cultivo celular y homogeneizar la solución. De la placa de seis pocillos preparada anteriormente, retire dos mililitros de medio y agregue un mililitro de la suspensión celular al centro del molde de agarosa formado por el biodispositivo impreso en 3D.
Espere de 20 a 30 minutos para que las células se sedimenten en las micro resecciones antes de agregar un mililitro de medio de cultivo celular en el pocillo. Coloque la placa de seis pocillos en la incubadora a 37 grados centígrados durante aproximadamente 24 a 48 horas para la formación de esferoides de tejido. El dispositivo similar a un sello impreso en 3D, compuesto por micro alfileres cilíndricos, se fabricó con éxito mediante el método de estereolitografía utilizando una resina fotocurable.
El dispositivo era simple, fácil de esterilizar, reutilizable y ajustable para diferentes tamaños de placas de pocillos y placas de Petri. Generó 750 pocillos de micro resecciones homogéneas o 4.716 por placas de seis pocillos. La retirada temprana del dispositivo de la placa alteró el molde no adherente y deformó la geometría de la microrresección.
Las células sembradas en los mohos de agarosa no adherentes se sedimentaron y formaron los esferoides tisulares aproximadamente después de 24 horas. Esta metodología demostró con éxito la producción a gran escala de los esferoides manteniendo su forma, tamaño y viabilidad, y apoyó el cultivo de esteroides durante meses. Lo más importante que hay que recordar cuando pienso en este procedimiento es insertar con cuidado el dispositivo para evitar burbujas de aire y añadir suavemente el medio de cultivo para evitar perturbar las células.
Después de este procedimiento, se pueden realizar pruebas de drogas y análisis de expresión génica. Responder preguntas sobre la eficacia de los medicamentos, la saboradez y la respuesta genética a los tratamientos. Esta técnica permitirá nuevas investigaciones en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa al permitir la producción de esferoides a gran escala y de alta calidad, fundamentales para la bioimpresión 3D, y mejorar la calidad y cantidad de las células para las pruebas de toxicidad farmacéutica y cosmética.
