Los autores desean agradecer a Norman Krüger por su excelente apoyo técnico.

1. Parte 1: Cultura de hNPCs en PuraMatrix <ol><li> De antelación a la generación de un andamio con una concentración de 0,25% PuraMatrix sin laminina que se necesita para preparar las siguientes soluciones </li><li> Prepare una solución de sacarosa al 20% y una solución que contenga 10% de sacarosa disuelta en agua destilada estéril. </li><li> Para la solución de una mezcla de 120 l de la solución de sacarosa al 20% con 120 l de agua destilada en un tubo de 1,5 ml cónico. </li><li> Para la solución de dos mezcla de 60 l de la solución PuraMatrix con 60 l de solución de sacarosa al 20% en un tubo de 1,5 ml cónico. </li></ol> Para una preparación de un andamio con una concentración de 0,25% PuraMatrix complementado con la laminina (8 mg por cada 100 l Matrix) que se necesita para preparar las siguientes soluciones. <ol class="lroman"><li> Para la solución de una mezcla de 72 l de agua destilada con 120 l de solución de sacarosa al 20% y 48 l laminina en un tubo de 1,5 ml cónico. </li><li>Para la solución de dos mezcla de 60 ml con solución PuraMatrix 60 l de la solución de sacarosa al 20% en un tubo de 1,5 ml cónico. </li></ol><ol start="5"><li> Para el empotramiento de las células en el PuraMatrix preparar un plato de 4 celdas, y la cultura y el lugar de una hoja de cubierta de vidrio esterilizado (diámetro 13 mm) en dos pozos. Guarde la placa en la mesa de trabajo limpia para el uso posterior. Cubierta de cristal se desliza sólo se utilizan para los estudios inmunocitoquímicos. Si no tinciones inmunocitoquímicas se pretende, el paso se puede omitir. </li></ol> Para preparar el hNPCs para la encapsulación de un andamio en 3D tiene que preparar las siguientes soluciones. Diluir el Benzonase en la solución de tripsina / EDTA, utilizando un factor de dilución de 1:10.000. Para una mezcla de la solución Trypsin-Inhibitor/Benzonase: DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl + 1% HSA + inhibidor de tripsina (0.5mg/ml). <ol start="6"><li> Separar las células añadiendo 500 l de tripsina / Benzonase solución e incubar durante 5 minutos en una incubadora (37 ° C CO, 5% 2). Detener la reacción con una solución de Trypsin-Inhibitor/Benzonase. Posteriormente centrifugar las células separadas por 5 min a 3000 x g. Lavar las células con 5 ml de solución de sacarosa al 10% y se centrifuga de nuevo. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en una solución de sacarosa al 10%, la solución final debe contener células 1x10 6 células / ml. </li></ol> Los próximos pasos, desde 1,8 hasta 1,11, debe hacerse lo más rápido posible, debido a el bajo pH de la solución PuraMatrix, lo que podría ser perjudicial para las células. <ol start="8"><li> Mezcla de 60 l de suspensión de células con una solución de 1. </li><li> Añadir 120 l de solución 1, que contiene las células, para el tubo cónico con una solución de 2 y mezclar cuidadosamente. </li><li> Colocar 100 l de la mezcla de inmediato en cada cubierta se desliza residía en la placa de 4 pocillos. </li><li> Agregar lentamente 200 l medio de cultivo de células por pozo y después de 2-3 minutos otro l 200. Esto iniciará el auto-ensamblaje de la matriz. </li><li> Incubar ccodos a 37 ° C, durante 1 hora en la mesa de trabajo limpia en una placa de calefacción o de la zona caliente de la mesa de trabajo limpia. Medida de lo posible no mover la placa, ya que podría dañar el montaje de las matrices. </li><li> Eliminar la mayor parte del medio, pero no todos, para evitar la caída de las matrices seco, con una pipeta de 1000 microlitros. Añadir 500 ul de medio de lavado de matrices durante 10 minutos. Finalmente se elimina el medio y añadir 500 l medio fresco y el lugar de la placa de cultivo en un incubador (37 ° C CO, 5% 2). Como las matrices son sensibles al choque de las placas se debe mover lo menos posible y se almacena, si es posible, en un aparte incubadora. </li><li> El hNPCs aquí utilizados fueron proliferado durante 7 días en los andamios 3D-y la diferenciación se inició con la retirada de los 13 factores de crecimiento. Medio se cambió cada 2-3 días. </li></ol> 2. Parte 2: tinción inmunocitoquímica de las matrices de todo <ol><li> Con antelación al procedimiento de tinción que se necesita para preparar: abtampón de bloqueo solución que consta de suero de cabra normal de 5% y el 0,3% de Triton X-100 (disuelto en PBS, una solución de paraformaldehído al 4% sobre la base de PBS 0,1 M y si es necesario una solución con 4 &#39;,6-Diamidin-2&#39;-phenylindoldihydrochlorid DAPI) para una tinción de núcleos con DAPI 100 ng / ml disuelto en PBS. Las muestras fueron montadas con una mezcla de Mowiol y DABCO. </li><li> Para lavar las matrices de eliminar el medio con una pipeta de 1.000 l, y lavar los andamios de una vez con PBS durante 5 minutos. </li><li> Para solucionar los andamios eliminar el PBS y añadir 400 l de paraformaldehído (4% en PBS 0,1 M) a cada pocillo e incubar las matrices durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los andamios fijos se pueden almacenar en PBS suplementado con 0,02% NaN 3 a 4 º C durante varias semanas hasta varios meses. </li><li> Antes de una tinción de lavar los andamios con PBS durante 5 minutos. </li><li> Incubar los andamios en el bloqueo de la solución tampón. Solución de bloqueo se ha cambiado tres veces cada 2-3 horas y subsequently andamios se incubaron en solución de bloqueo durante la noche a 4 ° C. </li><li> Eliminar la solución tampón de bloqueo y añadir el anticuerpo primario disuelto en PBS suplementado con suero de cabra 1% de lo normal y se incuban las matrices durante la noche a 4 ° C. </li><li> Eliminar la solución de anticuerpo primario y lavado de andamios 4 veces durante 2 horas y, posteriormente, durante la noche a 4 ° C con PBS. </li><li> Retire la PBS y la solución con el anticuerpo secundario, se disolvió en PBS suplementado con suero de cabra 1% de lo normal, durante 4 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Lavar las muestras con PBS 4-6 veces durante 1 hora y, posteriormente, durante la noche a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Para una tinción nuclear se puede añadir 400 l de la solución de DAPI por 30 min. </li><li> Para montar las muestras que se necesita el microscopio. Añadir 50 l Mowiol / Dabco en el portaobjetos de microscopio. Quite la cubierta se desliza desde la placa de 4 bien y ponerlos cuidadosamente en el medio de montaje. </li><li> Aquí se utilizó un 8000 Biozeromicroscopio (Keyence, Alemania, Karlsruhe) para obtener micrografías individuales y z-pilas. Cada pila contiene 30 fotografías individuales a una distancia de 1.2 micras. Utilizando el software del analizador correspondiente la falta de definición inherentes a la fluorescencia se retiró antes de proyecciones completas de la z-pilas se produjeron. </li></ol> 3. Parte 3: La liberación de hNPCs de los andamios para el análisis de citometría de flujo <ol><li> De antelación a la liberación de las células de los andamios lavar los andamios con 500 l HBSS. </li><li> La transferencia de los andamios por medio de una pipeta de 1.000 l de un tubo cónico de 15 ml que contienen medio de cultivo celular. </li><li> Para interrumpir los andamios mecánica resuspender la solución de células varias veces con una pipeta de 1.000 l, y posteriormente centrifugar la solución a 3000 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante con una pipeta, añadir 500 l de tripsina / Benzonase solución y resuspender el pellet celular veces varios. </li><li> Se incuban las células durante 5 minutosa 37 ° C en la solución de tripsina / Benzonase. Para detener la reacción añadir una solución Trypsin-inhibitor/Benzonase ml y pipeta de arriba y abajo varias veces. </li><li> Se centrifuga la suspensión celular de 5 minutos a 3000 xg, separar el sobrenadante y lavar las células con 2 ml buffer HBSS. Repita este paso dos veces. Este procedimiento será eliminar los restos de la matriz. </li><li> Pasar la suspensión celular a través de un colador solución de células (tamaño de poro 70 micras) para eliminar los agregados y recoger las células en un medio de cultivo celular. Las células obtenidas se pueden sembrar de nuevo por ejemplo, en la cubierta se desliza por los estudios funcionales como patch clamp o mediciones fluometric. Para procesar las células para citometría de flujo, fijar las células de inmediato (ver 4.1). </li></ol> 4. Parte 4: Cuantificación de células tubulina βIII positivos por citometría de flujo <ol><li> Fijar las células lanzado obtenido en el paso 3.7 con 1% PFA durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Se centrifuga la suspensión celular durante 5 minutos a 3000 xg y Remove el sobrenadante. Si es necesario, las células pueden estar preparados para ser almacenados a 4 ° C para su posterior análisis. Por lo tanto, suspender las células en tampón de lavado (PBS suplementado con BSA al 0,5% y 0,02% de Na-azida). </li><li> Para continuar con la preparación para la citometría de flujo, se centrifuga la suspensión celular durante 10 minutos a 350 xg, descartar el sobrenadante y resuspender las células en 25 l de la solución de anticuerpos. Por lo tanto, el primer anticuerpo se mezcla con el tampón de saponina en una concentración de 1:100, por ejemplo βIII-tubulina. El búfer de saponina consiste en PBS con una concentración del 0,5% de saponina, una concentración de BSA del 0,5% y una concentración de Na-azida de 0,02%. </li><li> Incubar la suspensión de células con el primer anticuerpo durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador. Como control negativo preparar una muestra sin el primer anticuerpo. </li><li> Para la etapa de lavado primero añadir 300 l de amortiguación saponina directamente a las células. Se centrifuga la suspensión celular durante 5 minutos a 350 x g. Para la etapa de lavado en segundo lugar, descartarel sobrenadante, añadir 300 l de amortiguación y centrifugar la suspensión celular durante 5 minutos a 350 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 25 l solución que contiene el anticuerpo secundario (por ejemplo, Alexa Fluor 647, 1:1000, se disolvió en un tampón de saponina). Se incuban las células con el anticuerpo secundario 1h a temperatura ambiente, en la oscuridad. </li><li> Para la etapa de lavado primero añadir 300 l de amortiguación saponina directamente a las células. Se centrifuga la suspensión celular durante 5 minutos a 350 x g. Para la etapa de lavado en segundo lugar, descartar el sobrenadante, añadir 300 l de amortiguación y centrifugar la suspensión celular durante 5 minutos a 350 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 500 l de solución de lavado para el análisis de citometría de flujo. </li></ol> 5. Resultados representante Un ejemplo de hNPCs cultivadas en el auto-montaje de andamios PuraMatrix hidrogel se muestra en la figura 1. El hNPCs crecer en estructuras esféricas, como en el PM sin modificar. En esta condición la culturas, las células no pueden ser reconocidos en una transmisión de luz, a pesar de los paquetes de los procesos entre las esferas son visibles (fig. 1A). Dependiendo de las condiciones de cultivo del tipo de células utilizadas, la matriz se pueden modificar por ejemplo, mediante la adición de la laminina. Para la línea celular hNPC ReNcell VM (Millipore) laminina es necesaria para inducir un patrón de crecimiento de los agregados menos denso, pero una distribución más homogénea de las células (fig. 1B). Independiente de las modificaciones, la matriz se puede utilizar para estudiar la diferenciación neuronal, por ejemplo. Figura 1C presenta una coloración de la hNPCs para el marcador neuronal βIII-tubulina. En este ejemplo, las células fueron cultivadas durante 7 días en la matriz y, posteriormente, diferenciados por 4 días, donde la diferenciación fue inducida por la retirada de la FGE y factores de crecimiento bFGF. 13 cuerpos celulares y una densa red de procesos construidos por las células puede ser fácilmente reconocible. Sin embargo, es evidente que la cuantificación del número de células es mucho tiempo, como un gran número deimágenes de las diferentes regiones de la matriz tiene que ser analizado, para obtener una base de datos fiable para un análisis estadístico. En la figura 1D se puede ver un ejemplo de las células de liberados de la matriz y, posteriormente, platted en cubreobjetos. Estas células podrían ser utilizados para estudios funcionales. La liberación de las células de los andamios 3D ofrece la posibilidad de analizar diferentes parámetros como la expresión de proteínas marcadoras o tasa de supervivencia de las células por AnnexinV / PI tinción o un ensayo de TUNEL. La figura 2 muestra un ejemplo de un análisis de citometría de flujo del porcentaje de células + βIII-tubulina. El control negativo (células que no están marcados para βIII-tubulina) se muestra en la figura 2A. Estos controles se utilizan para determinar la puerta para la detección posterior de + βIII-tubulina células (Fig. 2B). Una comparación de un conteo manual de las células y un análisis por citometría de flujo se muestra en la figura 2C. El porcentaje de células + tubulina βIII-se determexaminado por el recuento del número total de células (por medio de una tinción nuclear con DAPI) y el número de βIII-tubulina + en las células imágenes de fluorescencia. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig1.jpg" /> Figura 1. hNPCs cultivadas en el péptido PuraMatrix auto-montaje de hidrogel. hNPCs A) encapsulado en PuraMatrix (PM) crecen en estructuras esféricas, densa llena, donde el diámetro de las esferas puede ser de hasta varios cientos de micras. En medio de las esferas se pueden reconocer los paquetes de procesos construidos por las células (flechas). B) Las células encapsuladas en PuraMatrix complementado con la laminina (PML) crecen en las estructuras menos densas, más homogéneamente distribuida. En la laminina complementado matriz se pueden reconocer las células individuales en las zonas menos densas (flechas), sin embargo, no es posible cuantificar el número de células. C) hNPCs diferenciadas por 4 días en PML marcador neuronal expresar como βIII-tubulina (verde). De evaluaciónte el porcentaje de células positivas que uno tiene que determinar el número total de células por una tinción nuclear como DAPI (azul). La microfotografía presenta la proyección completa de un z-stack de fotografías tomadas con microscopio Biozero-8000. D) Las células liberados de la matriz pueden ser sembradas en cubreobjetos por ejemplo, para estudios funcionales. La microfotografía muestra células en cultivo para 3d, posteriormente el procedimiento de liberación. La tinción de βIII-tubulina (rojo) muestra una morfología similar a las células alojadas en el andamio 3D. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig2.jpg" /> Figura 2. El flujo de células análisis por citometría de liberado de PuraMatrix. Para superar la cuantificación de tiempo de microfotografías se utilizó un protocolo para liberar las células cultivadas en PuraMatrix que da acceso a un análisis más rápido por citometría de flujo. A las células) sin teñir fueron utilizados como control negativo, para fijar la puerta (marco negro) para el análisis posteriormentepor ejemplo, de la tubulina βIII las células. B) Para cuantificar el porcentaje de βIII-tubulina + células se utilizó la misma puerta, situada en el control negativo,. Células positivas aparecen en la parte derecha del eje x, donde también se observó una población intermedia (marco de puntos), más probable es que los desechos que representan a la célula. C) La comparación de manual de células contadas y células contadas por citometría de flujo reveló una proporción mucho mayor de células positivas, donde la dependencia del tiempo de la cantidad de βIII-tubulina + fue similar, lo que indica la fiabilidad del protocolo de citometría de flujo.

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	<li>Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+3D+tissue+cell+cultures.">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures.</a> Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).</li><li>Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+scaffolds+for+3-d+tissue+cell+cultures+and+regenerative+medicine.">Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine.</a> Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).</li><li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture:+building+a+better+matrix.">Cell Culture: building a better matrix.</a> Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).</li><li>Hauser, C. A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+biological+materials.">Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).</li><li>Teng, Y. 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ONE. 1, e119-e119 (2006).</li><li>Taraballi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine-spacers+influence+functional+motifs+exposure+and+self-assembling+propensity+of+functionalized+substrates+tailored+for+neural+stem+cell+cultures.">Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures.</a> Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).</li><li>Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+assembly+of+a+self-complementary+oligopeptide+to+form+a+stable+macroscopic+membrane.">Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. 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No hay conflictos de interés declarado.

El uso de andamios 3D ofrece la oportunidad de estudiar el desarrollo de diferentes tipos de células en una situación de cultivo celular más cercana a la situación in vivo. Sin embargo, en relación con el análisis de la diferenciación neuronal por ejemplo, o estudios funcionales que uno tiene que superar algunos obstáculos para obtener datos fiables para la cuantificación por ejemplo, de tipos de células. Aquí se describe la cultura de hNPCs en el hidrogel basado...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> PuraMatrix péptido hidrogel </td><td> BD Bioscience </td><td> 354250 </td><td></td></tr><tr><td> Ratón laminina I </td><td> Cultrex </td><td> 400-2009090 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Sigma </td><td> S9378-1kg </td><td></td></tr><tr><td> Suero normal de cabra </td><td> Dako </td><td> X0907 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Biochrom AG </td><td> L 1825 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-088 </td><td> Solución salina equilibrada de Hanks 1X </td></tr><tr><td&gt; ΒIII-tubulina de anticuerpos </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-51 670 </td><td> Ratón, monoclonal, 1:500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11029 </td><td> Cabra α del ratón, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11031 </td><td> Cabra α del ratón, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A 21235 </td><td> Cabra α del ratón, 1:1000 </td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 Reactivo </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Aldrich </td><td> D2 ,780-2 </td><td> 1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano 98% </td></tr><tr><td> Células colador </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> 70 micras de tamaño de poro </td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Merck </td><td> 7695 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina/ EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase 250 U / l </td><td> Merck </td><td> 1.01654.0001 </td><td></td></tr><tr><td> Inhibidor de la tripsina </td><td> Sigma </td><td> T6522 (500 mg) </td><td></td></tr><tr><td> 20% de HSA </td><td> Octapharma </td><td> La albúmina humana-Kabi 20% </td><td></td></tr></tbody></table>

cultivation of human neural progenitor cells in a 3-dimensional self-assembling peptide hydrogel

La influencia de tres dimensiones (3D) los andamios en la diferenciación de crecimiento, la proliferación neuronal y por último es de gran interés con el fin de encontrar nuevos métodos de terapias basadas en células y estandarizada en las enfermedades neurológicas o enfermedades neurodegenerativas. Estructuras 3D se espera que proporcionen un ambiente mucho más cercano a la situación in vivo de las culturas en 2D. En el contexto de la medicina regenerativa, la combinación de biomateriales con madre neurales y las células progenitoras es una gran promesa como una herramienta terapéutica. 1.5 Los sistemas de cultivo que simula un entorno tridimensional se ha demostrado que influyen en la proliferación y diferenciación en diversos tipos de células madre y las células progenitoras. En esto, la formación y funcionalización de la 3D-microenviroment es importante para determinar la supervivencia y el destino de las células incrustado. 6-8 Aquí usamos PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), un péptido de hidrogel a base de andamios,que está bien descrito y utilizado para estudiar la influencia de un entorno 3D en diferentes tipos celulares. 7,11-14 PuraMatrix se pueden personalizar fácilmente y la fabricación sintética de la nano-fibras proporciona un sistema de cultivo en 3D de alta fiabilidad, que es, además de xeno-libre. Recientemente se ha estudiado la influencia de la concentración de PM-en la formación del andamio. 13 En este estudio las concentraciones utilizadas de PM tuvo un impacto directo sobre la formación de la estructura 3D, que fue demostrado por microscopía de fuerza atómica. Un posterior análisis de la supervivencia y la diferenciación de la hNPCs reveló una influencia de las concentraciones utilizadas de PM en el destino de las células incrustado. Sin embargo, el análisis de la supervivencia o la diferenciación neuronal por medio de técnicas de inmunofluorescencia poseen algunos obstáculos. Para obtener datos fiables, hay que determinar el número total de células en una matriz para obtener el número relativo de ejemplo. células neuronales marcados por βIII-tubulina. Este pre-requisitos de una técnica para analizar los andamios en todas las dimensiones de 3 por un microscopio confocal o una técnica comparable como los microscopios de fluorescencia capaces de tomar z-pilas de la muestra. Además, este tipo de análisis es extremadamente lento. Aquí se demuestra un método para liberar las células de los andamios en 3D-por ejemplo, para el posterior análisis por citometría de flujo. En este protocolo las células progenitoras neurales (hNPCs) de la línea celular ReNcell VM (Millipore EE.UU.) se cultivaron y se diferencian en 3D andamios que consiste en PuraMatrix (PM) o PuraMatrix complementado con la laminina (PML). En nuestras manos un PM-concentración de 0,25% fue óptimo para el cultivo de las 13 células, sin embargo, la concentración puede ser adaptado a otros tipos de células. 12 Las células liberadas pueden ser utilizados para, por ejemplo estudios inmunocitoquímicos y posteriormente analizados por citometría de flujo. Esto acelera el análisis y la movolver otra vez, el resto de datos obtenidos sobre una base más amplia, la mejora de la fiabilidad de los datos.

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Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

A continuación se describe el uso de un auto-montaje de andamios de 3 dimensiones para cultivo de células progenitoras neurales humanas. Se presenta un protocolo para liberar las células de los andamios para ser analizados posteriormente por ejemplo, mediante citometría de flujo. Este protocolo puede ser adaptado a otros tipos de células para llevar a cabo estudios detallados de manera mecánica.

Cultivo de Células progenitoras neurales en un hidrogel de péptidos 3-dimensional de auto-montaje

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

cultivation-human-neural-progenitor-cells-3-dimensional-self

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.5K vistas.  University of Rostock. A continuación se describe el uso de un auto-montaje de andamios de 3 dimensiones para cultivo de células progenitoras neurales humanas. Se presenta un protocolo para liberar las células de los andamios para ser analizados posteriormente por ejemplo, mediante citometría de flujo. Este protocolo puede ser adaptado a otros tipos de células para llevar a cabo estudios detallados de manera mecánica.

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A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Un método para la encapsulación de los folículos ováricos y la Cultura en un proteolíticamente degradables tres dimensiones del sistema

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Investigación

Bioingeniería

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

El colágeno organotípicos I del ensayo: Una plataforma maleable para evaluar el comportamiento celular en un contexto de 3 dimensiones

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing radiation, millimeter spatial accuracy of anatomical and functional data 2, and nearly real-time analyses 3. Haptic robots provide precise measurement and control of position and force of a cursor in a reasonably confined space. Here we combine these two technologies to allow precision experiments involving motor control with haptic/tactile environment interaction such as reaching or grasping. The basic idea is to attach an 8 foot end effecter supported in the center to the robot 4 allowing the subject to use the robot, but shielding it and keeping it out of the most extreme part of the magnetic field from the fMRI machine (Figure 1).
The Phantom Premium 3.0, 6DoF, high-force robot (SensAble Technologies, Inc.) is an excellent choice for providing force-feedback in virtual reality experiments 5, 6, but it is inherently non-MR safe, introduces significant noise to the sensitive fMRI equipment, and its electric motors may be affected by the fMRI's strongly varying magnetic field. We have constructed a table and shielding system that allows the robot to be safely introduced into the fMRI environment and limits both the degradation of the fMRI signal by the electrically noisy motors and the degradation of the electric motor performance by the strongly varying magnetic field of the fMRI. With the shield, the signal to noise ratio (SNR: mean signal/noise standard deviation) of the fMRI goes from a baseline of &tilde;380 to &tilde;330, and &tilde;250 without the shielding. The remaining noise appears to be uncorrelated and does not add artifacts to the fMRI of a test sphere (Figure 2). The long, stiff handle allows placement of the robot out of range of the most strongly varying parts of the magnetic field so there is no significant effect of the fMRI on the robot. The effect of the handle on the robot's kinematics is minimal since it is lightweight (&tilde;2.6 lbs) but extremely stiff 3/4" graphite and well balanced on the 3DoF joint in the middle. The end result is an fMRI compatible, haptic system with about 1 cubic foot of working space, and, when combined with virtual reality, it allows for a new set of experiments to be performed in the fMRI environment including naturalistic reaching, passive displacement of the limb and haptic perception, adaptation learning in varying force fields, or texture identification 5, 6.

The adaptation and use of a haptic robot in a 3T fMRI is described.

Adaptación de un Robot Haptic en un fMRI 3T

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

Campo eléctrico controlado por migración dirigida de células progenitoras neurales en entornos 2D y 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

Síntesis de una proteína artificial mediada Intein hidrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

El cultivo de células de mamífero utilizando un solo uso Sistema Neumático biorreactor

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Mejora 3D hidrogel culturas de células Glial primarias para In Vitro modelado de neuroinflamación

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Cultivo de células de mamífero en andamios tridimensionales péptido

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Ácido hialurónico basado en hidrogeles de 3 dimensiones cultura de células de Glioblastoma derivados del paciente

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...