Este trabajo fue financiado por la Agence Nationale pour la Recherche y por el Consejo Europeo de Investigación.

El ensayo trabaja en varios formatos, sin embargo se recomienda la ampliación por el volumen de la muestra para ahorrar reactivos, particularmente CCF4-AM. Por lo tanto, el siguiente protocolo se describe para las células HeLa fijos o THP-1 células similares a los macrófagos en un formato de 96 pocillos, a continuación, para las células HeLa en vivo en 35 mm en placas de fondo de vidrio. El ensayo se puede adaptar para otros patógenos. Además de la infección por Shigella, se describe el ensayo de THP-1 Phagocytosing diferentes cepas m is cobacterial. Es importante destacar que, después de CCF4-AM de carga, todos los reactivos y tampones incluyendo tampones de lavado requieren la presencia de probenecid a 1 mM. El probenecid es un inhibidor de canal de aniones que promueve la retención citosólica de CCF4 lo largo de todas las etapas del protocolo. Las muestras fijadas deben ser adquiridas en unas pocas horas después del experimento ya que la señal CCF4 no es estable durante largos períodos de tiempo. 1. CCF4 Ensayo de muestras fijas Uso de Shigella flexneri (96 placas) <ol><li> Preparación de las bacterias de cultivos de una noche. Inocular las bacterias pre-cultivos de tipo salvaje (M90T AfaI) y (BS176 AfaI) cepas mutantes 1 día antes de la infección en 8 ml de caldo de soja tríptica de caseína (TCSB) suplementado con ampicilina (50 mg / ml) en un agitador a 37 ° C durante la noche . </li><li> Células en placas de infección. Células HeLa semillas en placas de 96 y 1 día antes de la infección a una densidad de 3 x 10 5 células por pocillo en DMEM que contenía 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 1% de penicilina-estreptomicina en un 5% de CO2 en un volumen final de 100 l. En el caso de las células THP-1 similares a los macrófagos, células chapado se lleva a cabo 2 días antes de la infección a una densidad de 5 x 10 4 células / pocillo, y se incuban con 30 nM de miristato acetato de forbol (PMA) en medio RPMI que contiene 10% suero de ternero fetal (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina y 0,05 mM 2-mercaptoetanol. </li><li> Preparación de las bacterias de la subcultura. Se inoculan cultivos de bacterias durante la nochea una dilución 1/100 en TCSB suplementado con 50 g / ml de ampicilina en un agitador a 37 ° C durante 2,5 horas (DO600 = 0,3 a 0,4). </li><li> Cargando células con CCF4-AM. Preparar la mezcla de CCF4-AM de carga para un volumen final de 25 l por pocillo que contenía 1 mM de probenecid (Sigma), 1,5 mM CCF4-AM (6 mM en el caso de células THP-1) y 1,25 l de carga de la solución B (100 mg / ml Pluronic F127-surfactante en ácido acético DMSO/0.1% previsto a lo largo de CCF4-AM LiveBlazer Kit Carga por Invitrogen) en EM tampón (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 0,8 mM MgCl 2, 5 mM de glucosa, 25 mM de HEPES a pH 7,3). Se lavan las células una vez con PBS y añadir 25 l de CCF4-AM mezcla de carga por pocillo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 2,5 horas. </li><li> Preparación de las bacterias de la infección. Girar 1 ml de subcultivos bacterianas a 9.000 rpm durante 1 min. Lavar una vez con 500 l de PBS, centrifugar a 9000 rpm durante 1 min y resuspender en 500 l de PBS suplementado con 10 mg / ml de poli-L-lisina (Sigma) y 40 mg / ml de β-lacmase (Sigma). Después de 10 min de incubación en una rueda giratoria a temperatura ambiente, se lava una vez con 500 l de PBS y las bacterias se resuspenden en 500 l de tampón EM / 1 mM de probenecid. </li><li> Infección de la célula y la fijación. Se lavan las células una vez con 150 l de PBS mM de probenecid / 1, preparar una mezcla de 10 l de bacterias se resuspendieron en un volumen final de 100 l de tampón de EM / 1 mM de probenecid y distribuirlo a cada pocillo. Después de 15 min de incubación en la oscuridad a temperatura ambiente, cambiar la placa a 37 ° C durante 1 hora (90 min en el caso de células THP-1), se lava con 150 l de PBS / 1 mM de probenecid y fijar con 50 l de paraformaldehído al 4% / 1 mM de probenecid durante 10 min en la oscuridad. A continuación, se lava con 150 l de PBS / 1 mM de probenecid, incubar durante 30 min con 30 l de 10 mM núcleos tinte DRAQ5 (Biostatus), se lava con 150 l de PBS / 1 mM de probenecid y dejar las muestras en 100 l de PBS / 1 mM de probenecid. </li><li> Ajustes de adquisición de muestras fijas. Adquisición se lleva a cabo ya sea usando (i) un micros epifluorescencia invertidahacer frente a un 20x (0,5 apertura numérica (NA), 2,1 Distancia de trabajo (WD)) o 40x (NA 0,75, 0,72 WD) objetivo aire N-Plan o (ii) el uso de un microscopio confocal con un objetivo de 10x. Formación de imágenes de fluorescencia se realiza con excitación a 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) y emisión detectada a través de 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) y filtros de 535 nm (Semrock, FF01-520/35- 25) con tiempos de exposición de 5 ms (luz transmitida), 1000 ms (535 nm) y 500 ms (450 nm). Confocal de imágenes se realiza utilizando el siguiente tiempo de exposición: 240 mseg (450 nm) y 360 mseg (535 nm) para el láser de 405 nm (870 mW), 640 mseg (DRAQ5) para el láser de 640 nm (2.560 mW). </li><li> El análisis post-adquisición. Posteriormente, las imágenes se analizaron mediante un algoritmo informático que permite automatizado de puntuación de la señal de fluorescencia para cada uno de las células individuales. Software como Metamorph 7.1 o Acapella se puede utilizar para crear una secuencia de comandos para la medición de la relación entre las señales de emisión de 450 nm y 535 nm (disponible a petición). De nota, el uso de un dispositivo de calibración del foco junto a la microscopía automatizada durante la adquisición permite la adquisición de docenas de diferentes posiciones en múltiples pozos en el mismo tiempo. </li></ol> 2. CCF4 Ensayo de muestras en directo con Shigella flexneri (35 mm Formato con fondo de vidrio, MatTek) <ol><li> Preparación de las bacterias de cultivos de una noche. Proceder como se ha descrito anteriormente. </li><li> Células en placas de infección. Células HeLa semillas en placas de cultivo de 35 mm con fondo de cristal (10 mm MatTek microplacas, MatTek corporación) 1 día antes de la infección a una densidad de 2 x 10 5 células / placa en un volumen final de 2 ml. </li><li> Preparación de las bacterias de la subcultura. Proceder como se ha descrito anteriormente. </li><li> Cargando células con CCF4-AM. Preparar la mezcla de carga CCF-AM como se ha descrito previamente para un volumen final de 2 ml por plato. Antes de la carga, se lavan las células una vez con PBS. </li><li> Preparación de las bacterias de la infección. Proceder como se ha descrito anteriormente. </li><li> Acquisitconfiguración de iones de muestras vivas. La adquisición se realizó durante 60 min cada 90 segundos con un microscopio de epifluorescencia invertida con un 20x (NA 0.5, 2.1 WD) o (NA 0,75, 0,72 WD) Objetivo de aire N-Plan 40x interior de una cámara de calentamiento ° C 37. Formación de imágenes de fluorescencia se realiza con excitación a 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) y emisión detectada a través de 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) y filtros de 535 nm (Semrock, FF01-520/35- 25) con tiempos de exposición de 5 ms (luz transmitida), 200 ms (535 nm) y 100 ms (450 nm). </li><li> Infección de la célula y la adquisición vivo. Se lavan las células una vez con 2 ml de PBS / 1 mM probenecid, añadir 2 ml de EM / 1 mM probenecid, montar el plato en la platina del microscopio y comenzar la adquisición. Después de 6 min (punto 4 veces), puso la adquisición en espera añadir 250 l de bacterias resuspensión en la parte superior de las células y reiniciar la adquisición. </li><li> El análisis post-adquisición. Las películas pueden ser visualizados utilizando Metamorph o ImageJ. 450/535 nm ratios de intensidad para cada individe doble celda puede ser obtenido usando ImageJ. Como se mencionó anteriormente, el uso de un dispositivo de calibración del foco junto a la microscopía automatizada durante la adquisición permite la adquisición de múltiples posiciones diferentes en función del lapso de tiempo. </li></ol> 3. CCF4 Ensayo de muestras fijas Uso Micobacterias (formato de 96 pocillos) <ol><li> Preparación de las bacterias. Crecer cepas de micobacterias a mediados de la fase de registro de 7H9 que contienen dextrosa albúmina catalasa (ADC) a 30 ° C (por Mycobacterium marinum) o 37 ° C (por Mycobacterium bovis BCG y Mycobacterium tuberculosis). </li><li> Células en placas de infección. Placa THP-1 macrófagos 2 días antes de la infección ellos incubando con 30 nM de PMA en RPMI que contiene 10% de suero fetal bovino (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina y 0,05 mM 2-mercaptoetanol en un 5% de CO 2 incubadora en un volumen final de 100 l a una densidad de 4 x 10 células / pocillo 5. </li><li> Preparación de las bacterias de la infección. Harvculturas forestales, lavar y resuspender con PBS antes de la sonicación y la filtración a través de una jeringa con el fin de evitar la aglutinación. Determinar la concentración de cada cepa por medición de DO600 e infectar THP-1 células a una MOI de 1:01 a 30 ° C (para Mycobacterium marinum) o 37 ° C (para Mycobacterium bovis BCG y Mycobacterium tuberculosis) en medio RPMI con 5% CO 2. Después de 2 horas, eliminar medio, lavar 3 veces con PBS y añadir medio fresco completo durante 1 a 2 días (en el caso de Mycobacterium marinum) o de 3 a 7 días (en el caso de BCG de Mycobacterium bovis y Mycobacterium tuberculosis). </li><li> Cargando células con CCF4-AM y fijación. Se lavan las células una vez con PBS y preparar la mezcla de carga CCF4-AM como se ha descrito previamente para un volumen final de 25 l por pocillo usando un CCF4-AM concentración final de 6 mM. Cargando tiene lugar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 2 horas antes de lavar con 150 l probenecid PBS / 1 mM y fijaración utilizando 50 l de paraformaldehído al 4% suplementado with1 mM de probenecid durante 30 min en la oscuridad. A continuación, lavar con 150 l de PBS mM probenecid / 1 y dejar muestras de 100 l de PBS / 1 mM probenecid. </li><li> Valores de adquisición y análisis posterior a la adquisición. Proceda como se describe anteriormente en el párrafo primero con Shigella flexneri. </li></ol> Protocolo Suplementario Fluorimétrica ensayos se realizan con el fin de comprobar la actividad β-lactamasa en la superficie de las bacterias. Esto debe hacerse para cada cepa bacteriana destinado a ser utilizado en el ensayo descrito. Para este propósito, las bacterias lavadas se pusieron en contacto con 100 nM CCF4-AM (Invitrogen), 50 g / extractos de hígado de esterasa porcina ml (Sigma) en 1 ml de PBS durante 1 hora a 37 ° C en la oscuridad. Soluble lactamasa 1 mg / ml (Invitrogen) se pueden utilizar como un control positivo. Entonces, una emisión de exploración se lleva a cabo a una excitación de 405 nm usando un fluorímetro PTI QuantaMaster y un cuarto 1 mlz cubeta. La pérdida de FRET a 535 nm y la aparición de un alto pico de 450 nm se visualizan en bacterias además de la sonda CCF4.

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	<li>van der Goot, F. G., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-endosomal+membrane+traffic.">Intra-endosomal membrane traffic.</a> Trends Cell Biol. 16, 514-521 (2006).</li><li>Raposo, G., Marks, M. S., Cutler, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosome-related+organelles:+driving+post-Golgi+compartments+into+specialisation.">Lysosome-related organelles: driving post-Golgi compartments into specialisation.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 19, 394-401 (2007).</li><li>van der Wel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M.+leprae+translocate+from+the+phagolysosome+to+the+cytosol+in+myeloid+cells.">M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells.</a> Cell. 129, 1287-1298 (2007).</li><li>Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplication+of+Shigella+flexneri+within+HeLa+cells:+lysis+of+the+phagocytic+vacuole+and+plasmid-mediated+contact+hemolysis.">Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis.</a> Infect Immun. 51, 461-469 (1986).</li><li>Bobard, A., Mellouk, N., Enninga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotting+the+right+location-+imaging+approaches+to+resolve+the+intracellular+localization+of+invasive+pathogens.">Spotting the right location- imaging approaches to resolve the intracellular localization of invasive pathogens.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810, 297-307 (2011).</li><li>Beauregard, K. E., Lee, K. D., Collier, R. J., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH-dependent+perforation+of+macrophage+phagosomes+by+listeriolysin+O+from+Listeria+monocytogenes.">pH-dependent perforation of macrophage phagosomes by listeriolysin O from Listeria monocytogenes.</a> J. Exp. Med. 186, 1159-1163 (1997).</li><li>Shaughnessy, L. M., Hoppe, A. D., Christensen, K. A., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+perforations+inhibit+lysosome+fusion+by+altering+pH+and+calcium+in+Listeria+monocytogenes+vacuoles.">Membrane perforations inhibit lysosome fusion by altering pH and calcium in Listeria monocytogenes vacuoles.</a> Cell Microbiol. 8, 781-792 (2006).</li><li>Zlokarnik, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+transcription+and+clonal+selection+of+single+living+cells+with+beta-lactamase+as+reporter.">Quantitation of transcription and clonal selection of single living cells with beta-lactamase as reporter.</a> Science. 279, 84-88 (1998).</li><li>Charpentier, X., Oswald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+secretion+and+translocation+domain+of+the+enteropathogenic+and+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+effector+Cif,+using+TEM-1+beta-lactamase+as+a+new+fluorescence-based+reporter.">Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter.</a> J. Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).</li><li>Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+effector+translocation+by+the+type+III+secretion+system+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Cell Host Microbe. 3, 104-113 (2008).</li><li>Bish, S. E., Song, W., Stein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+bacterial+internalization+by+host+cells+using+a+beta-lactamase+reporter+strain:+Neisseria+gonorrhoeae+invasion+into+cervical+epithelial+cells+requires+bacterial+viability.">Quantification of bacterial internalization by host cells using a beta-lactamase reporter strain: Neisseria gonorrhoeae invasion into cervical epithelial cells requires bacterial viability.</a> Microbes Infect. 10, 1182-1191 (2008).</li><li>Ray, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+dynamic+interplay+between+bacterial+and+host+factors+during+pathogen-induced+vacuole+rupture+in+real+time.">Tracking the dynamic interplay between bacterial and host factors during pathogen-induced vacuole rupture in real time.</a> Cell Microbiol. 12, 545-556 (2010).</li><li>Blocker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripartite+type+III+secreton+of+Shigella+flexneri+inserts+IpaB+and+IpaC+into+host+membranes.">The tripartite type III secreton of Shigella flexneri inserts IpaB and IpaC into host membranes.</a> J. Cell Biol. 147, 683-693 (1999).</li><li>Mounier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IpaC+carboxyterminal+effector+domain+mediates+Src-dependent+actin+polymerization+during+Shigella+invasion+of+epithelial+cells.">The IpaC carboxyterminal effector domain mediates Src-dependent actin polymerization during Shigella invasion of epithelial cells.</a> PLoS Pathog. 5, e1000271 (2009).</li><li>Nowicki, B., Hart, A., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+consensus+repeat-3+domain+of+recombinant+decay-accelerating+factor+is+recognized+by+Escherichia+coli+recombinant+Dr+adhesin+in+a+model+of+a+cell-cell+interaction.">Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction.</a> The Journal of Experimental Medicine. 178, 2115-2121 (1993).</li><li>Nothelfer, K., Dias Rodrigues, C., Bobard, A., Phalipon, A., Enninga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Shigella+flexneri+vacuolar+escape+by+flow+cytometry.">Monitoring Shigella flexneri vacuolar escape by flow cytometry.</a> Virulence. 2, 54-57 (2011).</li><li>Simeone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosomal+rupture+by+Mycobacterium+tuberculosis+results+in+toxicity+and+host+cell+death.">Phagosomal rupture by Mycobacterium tuberculosis results in toxicity and host cell death.</a> PLoS Pathog. 8, e1002507 (2012).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

El ensayo CCF4-AM/β-lactamase es un método sencillo para realizar un seguimiento interrupción vacuolar intracelular inducida por Shigella flexneri y micobacterias en diferentes tipos de células. Se hace uso de un sensible citoplasmática reportero lactamasa FRET que se escinde por una enzima activa en la superficie de las bacterias. Pérdida del sustrato CCF4-AM se puede evitar fácilmente mediante la adición de probenecid a todas las soluciones después de la carga del sustrato. Como se ha demostrado, el ensayo se puede adaptar a múltiples tipos de células (células epiteliales, células fagocíticas) y formatos (96 pocillos, de 35 mm en placas de fondo de vidrio, placas de pocillos 6/12/24). Para el uso de la placa de 6/12/24, cubreobjetos estériles se distribuyen en la parte inferior de cada pocillo antes de la siembra de las células. Al final del experimento, los cubreobjetos se transfieren en portaobjetos en medio de montaje, tales como Prolong Gold antifade reactivo (Invitrogen). De esta manera la señal es estable durante períodos de tiempo más largos después de que el ensayoen comparación con el formato de 96 pozos donde se conservan las muestras en PBS después de la fijación. El alto costo del sustrato CCF4-AM se debería tener en cuenta antes de la determinación del volumen de muestra. Es por eso que recomendamos escalar hacia abajo. Los experimentos son más caros en 6/12/24 formato bien pero las señales son estables durante días. Por el contrario, los experimentos son más baratos en el formato de 96 pocillos, pero las muestras tienen que ser analizados en el día del experimento. Es de destacar que los experimentos en vivo también se pueden realizar en el 96 o bien 384 formato bien. Esto permite la realización de experimento en vivo usando docenas de condiciones al mismo tiempo (las bacterias mutantes, MOI, transfección de plásmido o ARNsi, productos químicos, etc) con los números de posiciones por pocillo. Aunque adecuado para Shigella flexneri, destacamos que la &quot;verdadera&quot; o en tiempo real los experimentos con lapso de tiempo no son factibles para los estudios de las micobacterias ya que el ciclo de infección supera concentraciones medibles de CCF4 que pueden ser retenidos en el citosol. Paraesta razón, el sustrato CCF4-AM se aplica sobre las células sólo se consigue después de la invasión. En caso de que el software MetaMorph se utiliza para la adquisición y el análisis, se recomienda el uso de la &quot;adquisición de pantalla&quot; módulo que permite la adquisición de toda una 96/384 y placa con un número determinado de imágenes por pocillo. Además, los &quot;datos de pantalla opinión&quot; módulo permite (i) la visualización de la imagen de mosaico cosido de cada pocillo para cualquier canal al mismo tiempo en un &quot;cartel&quot; grande y (ii) un bucle de un algoritmo especializado para la medición de las intensidades en el 535 y los canales de 450 nm. A pesar de que hemos sido capaces de medir la ruptura vacuolar por bacterias individuales mediante microscopía de lapso de tiempo, nos gustaría advertir que la actividad enzimática en la superficie de las bacterias individuales varía lo que hace difícil de correlacionar con precisión el número de bacterias y la eficacia de vacuolas intracelulares ruptura. Dada la robustez del ensayo, que es adecuado para hrendimiento igh se acerca en 96 o 384 formatos así. También se han adaptado con éxito este protocolo para el análisis FACS para estudiar la infección de células en suspensión 16. El ensayo también se puede utilizar para la investigación de otras bacterias o portadores que presentan lactamasa en su superficie, que conduce a una amplia gama de aplicaciones. Por ejemplo, este enfoque puede ser usado para estudiar la ruptura vacuolar inducida por otros agentes patógenos tales como β-lactamasa expresar Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes o Salmonella typhimurium 12. Desde Listeria monocytogenes tiene un corto ciclo de infección comparable a Shigella flexneri, los experimentos con lapso de tiempo son posibles. Por el contrario, debido a Legionella pneumophila y Salmonella typhimurium visualización largos ciclos de infección, sugerimos llevar a cabo experimentos de punto final. La variedad de posibles aplicaciones hace que el ensayo de un CCF4-AM/β-lactamaseinteresante método fluorimétrico para el seguimiento de ruptura vacuolar inducida por patógenos intracelulares en muestras fijas o en tiempo real.

Numerosos patógenos bacterianos se internalizan en los compartimentos de membrana incluidas en las células eucariotas durante su curso de la infección. Entrada a la célula se produce ya sea a través de la fagocitosis por las células huésped especializados, como es el caso de Mycobacterium tuberculosis que son ingeridas por macrófagos, o los patógenos inducen activamente su absorción en las células típicamente no fagocíticas. En el caso de la ingesta inducida, por ejemplo, para Shigella flexneri, el patógeno inyecta proteínas efectoras en el citosol de acogida que secuestrar entre otras funciones de la célula de la maquinaria de clasificación de endomembranas estrechamente regulado que resulta en la localización bacteriana dentro de un 1,2 compartimiento endosomal. Posteriormente, Shigella altera la membrana envolvente conduce a la ruptura vacuolar y acceso citosólica del patógeno interferir con el tráfico de membrana de acogida y evitar la entrega a los lisosomas. Más recientemente, la ruptura fagolisosómico También se ha encontrado como str infecciónategia utilizado por Mycobacterium tuberculosis, un patógeno que se ha pensado durante mucho tiempo para estar localizado exclusivamente dentro de un compartimiento unido a la membrana 3,17. Para investigar la dinámica del tráfico de membrana subcelular de los patógenos invasores, grandes avances se han logrado desde la microscopía electrónica de transmisión (TEM), los estudios de la década de 1980 4,5 base. Por ejemplo, los métodos basados ​​en microscopía de fluorescencia utilizando colorantes, los anticuerpos contra los componentes de la superficie bacteriana, o marcadores para la co-localización con compartimentos subcelulares tomaron más de 6,7. Sin embargo, todavía no se dan precisa resolución espacio-temporal y robustez para medir la ruptura vacuolar por patógenos bacterianos cuantitativamente. Este obstáculo se ha abordado con un ensayo basado en el reportero derivado CCF4-AM FRET cefalosporina que se utilizó primero para estudiar la expresión génica 8. A continuación, se utiliza en el contexto de la infbiología ección para investigar la secreción de efector y para seguir la absorción de Neisseria en células huésped 9,10,11. Hemos desarrollado un ensayo de tomar ventaja de este reportero para el estudio de la ruptura vacuolar inducida por Shigella flexneri 12 y Mycobacterium tuberculosis 17. El principio de este método se describe en la Figura 1 usando Shigella flexneri. En primer lugar, las células huésped se cargan con el sustrato de FRET CCF4-AM que está atrapado en el interior del citoplasma después de la escisión de los restos éster AM. Luego, las células se infectan con Shigella flexneri. β-lactamasa presente en la superficie de la bacteria es capaz de escindir el sustrato CCF4 tan pronto como se produce la ruptura vacuolar. Esto conduce a una pérdida de FRET señal de conmutación del pico de emisión de 535 nm a 450 nm después de la excitación de la sonda a 405 nm. La medición radiométrica de los 450/535 nm intensidades destaca la integridad vacuolar: bajas tasas reflejan membrana-enbacterias cerrados o extracelular, mientras que altas proporciones reflejan el contacto entre las bacterias y el citosol de acogida. Nos informan también una adaptación de este método para el estudio de la ruptura phagosomal inducida por Mycobacterium tuberculosis en macrófagos THP-1. Los principios experimentales siguen siendo la misma a pesar de la secuencia se invierte, CCF4-AM carga se aplica sólo después de la infección bacteriana. Por lo tanto, por las medidas de fluorescencia ratiometric cuantitativos en el nivel de células individuales, la ruptura vacuolar de Shigella flexneri se puede seguir en tiempo real y en muestras fijas de diferentes tipos de células 12,13,14. Además, este método puede ser adaptado a un número de otros patógenos invasivos como se muestra en este estudio utilizando Mycobacterium bovis y Mycobacterium tuberculosis. Por último, la miniaturización de nuestro protocolo de 96 pocillos (o 384 pocillos) permite formatos de proyección de numerosas condiciones de alto rendimiento.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K1089</td>
			<td>Protect from light, stock in - 80 &deg; aliquots</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Draq5</td>
			<td>Biostatus</td>
			<td>DR50050</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&mu;CLEAR-PLATE, BLACK, 96 well </td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655090</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8761</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&beta;-lactamase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0389</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens

Shigella flexneri son bacterias patógenas que invaden las células huésped que entran en una vacuola endocítica. Posteriormente, la ruptura de la membrana de este compartimiento cerrado permite que las bacterias se mueven dentro del citosol, proliferar e invadir más células vecinas. Mycobacterium tuberculosis es fagocitado por las células inmunes, y se ha demostrado recientemente que la ruptura de la membrana phagosomal en los macrófagos. Hemos desarrollado un sólido ensayo para el seguimiento de disrupción de la membrana phagosomal después de la entrada célula huésped de Shigella flexneri o Mycobacterium tuberculosis. El enfoque hace uso de CCF4, un reportero de FRET sensible a la β-lactamasa que se equilibra en el citosol de las células huésped. Tras la invasión de las células huésped por patógenos bacterianos, la sonda permanece intacta, siempre y cuando las bacterias residen en los compartimentos de membrana-cerrados. Después de la interrupción de la vacuola actividad, β-lactamasa en la superficie de los patógenos intracelulares escinde CCF4 instante conducirción a una pérdida de señal de FRET y la conmutación de su espectro de emisión. Este ensayo radiométrico robusta produce información precisa sobre el tiempo de ruptura vacuolar inducida por las bacterias invasoras, y puede estar acoplado a la microscopía automatizada y el procesamiento de imágenes por medio de algoritmos especializados para la detección de las señales de emisión de la donante y aceptor de FRET. Además, permite la investigación de la dinámica de la interrupción vacuolar provocada por bacterias intracelulares en tiempo real en células individuales. Por último, es ideal para análisis de alto rendimiento con una resolución espacial y temporal superior a los métodos anteriores. Aquí, proporcionamos los detalles experimentales de protocolos ejemplares para el ensayo de rotura CCF4 vacuolar en las células HeLa y células THP-1 macrófagos para los experimentos de lapso de tiempo o puntos finales experimentos utilizando Shigella flexneri, así como múltiples cepas de micobacterias tales como Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, y Mycobacterium tuberculosis.

El enfoque CCF4-AM/β-lactamase es un método robusto y sensible para el seguimiento de ruptura vacuolar de patógenos intracelulares tales como Shigella flexneri (Figura 1). Las cepas de Shigella que se utilizan en este estudio se denominan M90T AfaI y BS176 AfaI. M90T AfaI es una cepa de Shigella flexneri que expresa la adhesina AFAE, que es capaz de unirse de manera eficiente CD55 en la superficie de las células epiteliales 15. Cepas que expresan tanto AFAE muestran habilidades invasión mucho mayor en comparación con la cepa de tipo salvaje M90T en las células epiteliales. BS176 AfaI es un mutante que expresa AFAE Shigella flexneri cepa carente de la virulencia de Shigella plásmido. Esta cepa es incapaz de invadir células HeLa. Sin embargo, esta cepa es capaz de entrar en las células THP-1 desde la absorción en esta línea celular se basan sólo en la fagocitosis clásica y no requiere un sistema de tipo-3 secreción funcional. Ambas cepas expresan β-lactamasa, Y la pantalla de la actividad β-lactamasa en su superficie debido a la presencia de la codificación AFAE plásmido. Tras la infección de células HeLa con el AfaI cepa no-invasivo BS176 durante 1 hora, el CCF4 sonda FRET permanece intacta, como se muestra en la Figura 2A por la señal de verde (535 nm). Por el contrario, la infección con la cepa virulenta M90T AfaI durante 1 hora conduce a un conmutador de señal hacia el azul (450 nm) destaca la escisión de la sonda en el citosol. Con el fin de cuantificar esto, hemos desarrollado una secuencia de comandos para el software Metamorph y Acapella que permite la detección automatizada de las células y la medición de las intensidades en los canales 535 y 450 nm para la determinación de la señal radiométrica. Como se muestra en la Figura 2B, núcleos y el citosol de las células se dividen en segmentos utilizando el canal de DRAQ5. Entonces, el algoritmo es capaz de detectar los 450 nm y las poblaciones de células positivas 535 nm para el cálculo de las proporciones entre las dos intensidades para cada celda individual que esrepresentado como un histograma en la Figura 2C. Bajas relaciones se obtienen para la cepa mutante en comparación con altos coeficientes de la cepa virulenta. Si bien este experimento representativo infección fue adquirida mediante microscopía confocal, microscopía de epifluorescencia también es adecuado para esta tarea Figuras 3 y 4 muestran ejemplos utilizando 2 tipos diferentes de células humanas:. Células epiteliales HeLa y THP-1 células similares a los macrófagos. Tras la infección con la cepa virulenta M90T AfaI Shigella durante 1 hora y 90 min para HeLa y células THP-1, un interruptor de la señal de verde (535 nm) a azul (450 nm) se observa en comparación con las células infectadas BS176 afai (Figuras 3A y 4A). La secuencia de comandos que hemos desarrollado en el software MetaMorph detecta directamente la población positiva CCF4 de las células y calcular la relación de las intensidades en 450 y 535 nm para cada uno de los canales de las células individuales. Luego, las células se clasifican en función de su relación con una macro desarroped en Excel, lo que se obtiene histogramas muestran la distribución de las células. Como lo ha sido el caso para la otra secuencia de comandos desarrollado para Acapella, BS176 células infectadas afai se caracterizan por proporciones bajas, mientras que las células infectadas afai M90T muestran altas proporciones utilizando el algoritmo de MetaMorph en células HeLa y células THP-1 macrófagos (Figuras 3B y 4B) . Por último, una adaptación de este método para el estudio de las micobacterias se muestra en la Figura 5. Mycobacterium bovis BCG reside en el fagosoma para todo el curso del experimento, tal como se refleja por la fuerte señal de 535 nm detectado durante todo el curso de tiempo del experimento. Por el contrario, Mycobacterium tuberculosis provoca la rotura de membranas phagosomal en THP-1 macrófagos después de más de 3 días de la infección que se destacan por una señal de 450 nm a los 7 días de la infección (Figura 5A y 5B). Usando el mismo algoritmo que para el estudio de la ruptura vacuolar por Shigella </em&gt;, encontramos que las células infectadas de Mycobacterium tuberculosis de pantalla más altas 450/535 nm proporciones que Mycobacterium bovis BCG después de 7 días de la infección (Figuras 5C y 5D). <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema que representa el principio del ensayo CCF4-AM/β-lactamase para el seguimiento de Shigella flexneri vacuolar ruptura. CCF4-AM difunde libremente a través de la membrana plasmática al citoplasma, donde restos éster se escinden fuera por las esterasas citosólicas productoras CCF4 aniones. Esta reacción evita que CCF4 de penetrar en cualquier compartimiento de la membrana incrustado. En este paso, CCF4 provoca FRET a 535 nm después de la excitación a 405 nm. La sonda se mantiene intacta hasta que las bacterias que expresan β-lactamasa rupture La vacuola endocítica. En este paso, la señal de FRET se pierde porque CCF4 se escinde mediante la activación de β-lactamasa de un interruptor en la emisión de 535 nm a 450 nm después de la excitación a 405 nm. <img alt="La figura 2" fo:content-width="2.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig2.jpg" /> Figura 2. Seguimiento de Shigella flexneri vacuolar ruptura mediante microscopía confocal. (A) Después de 2 h 30 min de CCF4-AM carga, células HeLa están infectados con el β-lactamasa cepa que expresa Shigella flexneri BS176 AfaI mutante o la cepa virulenta M90T AfaI durante 1 hora y fijo usando 4% de paraformaldehído durante 10 min. A continuación, los núcleos se tiñeron con DRAQ5 y las células se imagen usando un microscopio confocal con un objetivo de 10x. Representante imágenes se eligieron a los siguientes canales combinados: la sonda intacta CCF4 aparece a 535 nm (gradon), la sonda escindida CCF4 aparece a 450 nm (azul). (B) Los ejemplos de imágenes que destacan el sistema de detección de nuestro algoritmo automatizado en el software Acapella. La segmentación de los núcleos de las células (+ citosol) se obtiene utilizando el canal de DRAQ5. CCF4 células positivas se obtienen utilizando los canales 450 y 535 nm agrupados juntos. (C) Histograma que muestra el resultado de nuestro análisis automatizado de Acapella con Shigella flexneri BS176 AfaI cepa mutante o cepa virulenta M90T AfaI. La proporción media representa la relación entre la intensidad de los canales 450 y 535 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50116/50116fig2large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig3.jpg" /> Figura 3. Seguimiento de Shigella flexneri vacuolar ruptura en células HeLa utilizando microscopía de epifluorescencia. (A) Después de 2 h 30 min de CCF4-AM de carga, las células HeLa se infectan con la β-lactamasa cepa que expresa Shigella flexneri BS176 AfaI mutante o la cepa virulenta M90T AfaI durante 1 hora y fijado utilizando paraformaldehído al 4% durante 10 min. Entonces, las células son imágenes utilizando un microscopio de epifluorescencia con un objetivo de 20x. Representante imágenes se eligieron los siguientes medios:. CCF4 sonda intacta 535 nm (verde) y CCF4 troceados sonda 450 nm (azul) (B) Histograma que representa el resultado de nuestro análisis automatizado de software MetaMorph. Las células individuales se distribuyen en función de su relación de las intensidades en los canales 450 y 535 nm. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig4.jpg" /> &gt; Figura 4. Seguimiento de Shigella flexneri vacuolar ruptura en las células THP-1 utilizando microscopía de epifluorescencia. (A) Después de 2 h 30 min de CCF4-AM carga, THP-1 células se infectan con el β-lactamasa cepa que expresa Shigella flexneri BS176 AfaI mutante o el M90T AfaI cepa virulenta durante 1 h 30 min y se fija con paraformaldehído al 4% durante 10 min. Entonces, las células son imágenes utilizando un microscopio de epifluorescencia con un objetivo de 20x. Representante imágenes se eligieron los siguientes medios:. CCF4 sonda intacta 535 nm (verde) y CCF4 troceados sonda 450 nm (azul) (B) Histograma que representa el resultado de nuestro análisis automatizado mediante el software MetaMorph. Las células individuales se distribuyen en función de su relación de las intensidades en los canales 450 y 535 nm. ghres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50116/50116fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Seguimiento de BCG de Mycobacterium bovis y Mycobacterium tuberculosis ruptura phagosomal en THP-1 macrófagos utilizando microscopía de epifluorescencia (A, B). THP-1 células se infectan con β-lactamasa expresar Mycobacterium bovis BCG o Mycobacterium tuberculosis durante 2 horas y se cultivaron durante 3 a 7 días . Después del lavado, las células se cargan con CCF-4-AM durante 2 horas y fija usando 4% de paraformaldehído durante 30 min antes de la formación de imágenes utilizando un microscopio de epifluorescencia con un objetivo de 40x. Representante imágenes se eligieron los siguientes canales: intacta sonda CCF4, 535 nm (verde), escindido CCF4, sonda de 450 nm (azul) (C, D) histogramas presentan los resultados de nuestro análisis automatizado mediante el software MetaMorph.. Las células individuales se distribuyen como función de la relación entre la intensidad en los canales 450 y 535 nm.

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Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Se describe un método para el seguimiento de la ruptura del endomembrane provocada por las bacterias intracelulares<em&gt; Shigella flexneri<em&gt;</em</em&gt; Y<em<em&gt;<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt;</em</em&gt; Sobre la invasión de células huésped. Nuestro ensayo hace uso de CCF4, una serie citoplasmática sonda FRET en células vivas o fijas. Este reportero es degradado por una actividad de la enzima presente en la superficie bacteriana.

Sola célula Medidas de Ruptura Vacuolar causadas por patógenos intracelulares

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K vistas.  Institut Pasteur, Paris, France. Se describe un método para el seguimiento de la ruptura del endomembrane provocada por las bacterias intracelulares Shigella flexneri