وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الوكالة الوطنية من أجل الديمقراطية وبحوث من قبل مجلس البحوث الأوروبي.

يعمل الفحص في أشكال مختلفة، إلا أننا نوصي في خفض حجم العينة لحفظ الكواشف، وخاصة CCF4-AM. لذلك، يتم وصف بروتوكول التالية للخلايا هيلا ثابت أو THP-1 الخلايا الشبيهة بلعم في شكل جيد 96، ثم لخلايا هيلا الحية في 35 ملم أطباق أسفل الزجاج. ويمكن تكييف مقايسة لمسببات الأمراض الأخرى. وإلى جانب عدوى الشغيلة، ونحن تصف مقايسة لTHP-1 phagocytosing مختلف م ذ سلالات cobacterial. الأهم من ذلك، بعد CCF4-AM جار، كل الكواشف ومخازن بما في ذلك غسل مخازن تتطلب وجود البروبينسيد في 1 ملم. البروبينسيد هو قناة أنيون المانع أن يعزز الاحتفاظ عصاري خلوي من CCF4 في جميع الخطوات من البروتوكول. ينبغي الحصول على عينات ثابتة في غضون ساعات قليلة بعد التجربة منذ CCF4 إشارة ليست مستقرة لفترات زمنية طويلة. 1. CCF4 الفحص على عينات الثابتة باستخدام الشغيلة وlexneri (96 لوحات جيدة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البكتيريا للثقافات بين عشية وضحاها. تطعيم البكتيرية قبل الثقافات النوع البري (M90T الفجر العالمية) ومتحولة (BS176 الفجر العالمية) سلالات قبل الإصابة 1 يوم في 8 مل زيتية الكازين الصويا مرق (TCSB) تستكمل مع الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل) في شاكر عند 37 درجة مئوية خلال الليل . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا تصفيح للعدوى. البذور خلايا هيلا في 96 لوحات جيدة قبل الإصابة 1 يوم في مناطق ذات كثافة من 5 × 10 3 خلايا لكل بئر في DMEM تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) و 1٪ البنسلين، الستربتوميسين في 5٪ CO 2 الحاضنة في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر. في حالة الخلايا THP-1-بلعم مثل، يتم طلي الخلية قبل 2 أيام عدوى في مناطق ذات كثافة من 5 × 10 4 خلايا / جيد، ويتم تحضين أنها مع 30 نانومتر Phorbol خلات ميريستيت (سلطة النقد الفلسطينية) في RPMI تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 1٪ البنسلين streptomycine و 0.05 مم 2 المركابتويثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البكتيريا لثقافة فرعية. تطعيم الثقافات البكتيرية بين عشية وضحاهافي 1/100 التخفيف في TCSB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين في شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة (OD600 = 0،3-0،4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الخلايا مع CCF4-AM. تحضير مزيج CCF4 آم التحميل عن الحجم النهائي من 25 ميكرولتر لكل بئر تحتوي على 1 ملم البروبينسيد (سيغما)، و 1.5 ميكرومتر CCF4-AM (6 ميكرومتر في حالة THP-1) و 1.25 ميكرولتر من التحميل الحل B (100 ملغ / مل بلورونيك-F127 السطحي في حامض الخليك DMSO/0.1٪ قدمت على طول CCF4-AM LiveBlazer كيت التحميل بواسطة إينفيتروجن) في EM العازلة (120 ملي مول كلوريد الصوديوم، 7 ملم بوكل، 1.8 مم CaCl 2، 0.8 ملم MgCl 2، 5 ملي الجلوكوز، 25 HEPES ملم على الرقم الهيدروجيني 7.3). غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وإضافة 25 ميكرولتر من CCF4-AM المزيج التحميل لكل بئر في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعة 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البكتيريا لعدوى. تدور 1 مل من ثقافات فرعية البكتيرية في 9،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. يغسل مرة واحدة مع 500 ميكرولتر PBS، وتدور في 9،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة و resuspend في 500 ميكرولتر PBS تستكمل مع 10 ميكروغرام / مل بولي-L-يسين (سيغما) و 40 ميكروغرام / مل β-ألبانماس (سيغما). بعد 10 دقيقة من الحضانة على عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مرة واحدة مع 500 ميكرولتر PBS والبكتيريا resuspend في 500 ميكرولتر العازلة EM / 1 ملي البروبينسيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدوى الخلية والتثبيت. غسل خلايا مرة واحدة مع 150 ميكرولتر PBS / 1 ملي البروبينسيد، وإعداد مزيج من 10 ميكرولتر من البكتيريا معلق في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر من العازلة EM / 1 ملي البروبينسيد وتوزيعها على كل بئر. بعد 15 دقيقة حضانة في الظلام في درجة حرارة الغرفة، وتبديل لوحة إلى 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (90 دقيقة في حالة THP-1)، ويغسل مع 150 ميكرولتر PBS / 1 ملي البروبينسيد وإصلاح مع 50 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ / 1 ملي البروبينسيد من أجل 10 دقيقة في الظلام. ثم، يغسل مع 150 ميكرولتر PBS / 1 ملي البروبينسيد، واحتضان لمدة 30 دقيقة مع 30 ميكرولتر من 10 ميكرومتر نوى صبغ Draq5 (Biostatus)، ويغسل مع 150 ميكرولتر PBS / 1 ملي البروبينسيد وترك العينات في 100 ميكرولتر PBS / 1 ملي البروبينسيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعدادات اقتناء عينات ثابتة. يتم تنفيذ الاستحواذ إما باستخدام (ط) على صغار جدا epifluorescence مقلوبالتعامل مع 20X (0.5 الفتحة العددية (NA)، 2.1 العمل عن بعد (WD)) أو 40X (NA 0.75، 0.72 WD) الهدف الهواء N-خطة أو (II) باستخدام مجهر متحد البؤر مع الهدف 10X. يتم تنفيذ مضان التصوير مع الإثارة في 405 نانومتر (Semrock، FF01-387/11-25) والانبعاثات الكشف عن 450 نانومتر عبر (Semrock، FF02-447/60-25) و 535 نانومتر الفلاتر (Semrock، FF01-520/35- 25) استخدام مرات التعرض من 5 ميللي ثانية (الضوء المرسل)، 1،000 مللي ثانية (535 نانومتر) و 500 ميللي ثانية (450 نانومتر). يتم إجراء التصوير متحد البؤر باستخدام وقت التعرض التالية: 240 ميللي ثانية (450 نانومتر) و 360 ميللي ثانية (535 نانومتر) لنانومتر ليزر 405 (870 μW)، 640 ميللي ثانية (Draq5) لنانومتر ليزر 640 (2560 μW). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل ما بعد الاستحواذ. وفي وقت لاحق، ويتم تحليل الصور بواسطة خوارزمية الكمبيوتر الذي يسمح التهديف الآلي للإشارة مضان لكل الخلايا الفردية. البرمجيات مثل Metamorph 7.1 أو Acapella يمكن استخدامها لإنشاء برنامج نصي لقياس النسبة بين إشارات الانبعاثات 450NM و535nm (متوفر عند الطلب). من المذكرة، واستخدام جهاز معايرة التركيز بالإضافة إلى المجهر الآلي خلال اقتناء يسمح الحصول على عشرات من المواقف المختلفة في الآبار متعددة في نفس الوقت. </li></ol> 2. CCF4 الفحص على عينات حية باستخدام الشيجلا الفلكسنرية (35 ملم تنسيق زجاج القاع، ماتيك) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البكتيريا للثقافات بين عشية وضحاها. المضي قدما كما هو موضح سابقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا تصفيح للعدوى. البذور خلايا هيلا في 35 ملم أسفل الزجاج أطباق ثقافة (ماتيك 10 ملم Microwell، ماتيك شركة) قبل 1 يوم عدوى في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 5 خلية / طبق في الحجم النهائي من 2 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البكتيريا لثقافة فرعية. المضي قدما كما هو موضح سابقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الخلايا مع CCF4-AM. إعداد إطار التعاون القطري-AM المزيج التحميل كما هو موضح سابقا عن الحجم النهائي من 2 مل لكل طبق. قبل التحميل، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البكتيريا لعدوى. المضي قدما كما هو موضح سابقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Acquisitإعدادات أيون العينات الحية. يتم تنفيذ الاستحواذ لمدة 60 دقيقة كل 90 ثانية مع مجهر epifluorescence مقلوب باستخدام 20X (0.5 NA، 2.1 WD) أو 40X (NA 0.75، 0.72 WD) الهدف الهواء N-خطة داخل 37 ° C غرفة التدفئة. يتم تنفيذ مضان التصوير مع الإثارة في 405 نانومتر (Semrock، FF01-387/11-25) والانبعاثات الكشف عن 450 نانومتر عبر (Semrock، FF02-447/60-25) و 535 نانومتر الفلاتر (Semrock، FF01-520/35- 25) استخدام مرات التعرض من 5 ميللي ثانية (الضوء المرسل)، و 200 ميللي ثانية (535 نانومتر) و 100 ميللي ثانية (450 نانومتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدوى الخلية واكتساب الحية. غسل خلايا مرة واحدة مع 2 مل PBS / 1 ملي البروبينسيد، إضافة 2 مل من EM / 1 ملي البروبينسيد، تركيب الطبق على مرحلة من مراحل المجهر والبدء في عملية الاستحواذ. بعد 6 دقائق (الوقت النقطة 4)، ووضع الاستملاك في الانتظار، إضافة 250 ميكرولتر من البكتيريا إعادة تعليق على الجزء العلوي من الخلايا وإعادة تشغيل عملية الاستحواذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل ما بعد الاستحواذ. يمكن أن تكون الأفلام تصور باستخدام Metamorph أو يماغيج. 450/535 نسب كثافة نانومتر لكل indiviويمكن الحصول على الخلية المزدوجة باستخدام يماغيج. كما ذكر سابقا، فإن استخدام جهاز معايرة التركيز على جانب المجهر الآلي خلال اقتناء يسمح الحصول على وظائف مختلفة متعددة اعتمادا على مرور الوقت. </li></ol> 3. CCF4 الفحص على عينات الثابتة باستخدام المتفطرات (96 تنسيق حسنا) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البكتيريا. تنمو سلالات المتفطرات إلى مرحلة منتصف السجل في 7H9 التي تحتوي على سكر العنب الزلال الكاتالاز (ADC) في 30 ° C (لالمتفطرة البحرية) أو 37 ° C (لالمتفطرة البقرية BCG والمتفطرة السلية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا تصفيح للعدوى. لوحة THP-1 الضامة قبل 2 أيام عدوى تفرخ لهم مع 30 نانومتر سلطة النقد الفلسطينية في RPMI تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 1٪ البنسلين الستربتوميسين و 0.05 مم 2 المركابتويثانول في 5٪ CO 2 الحاضنة في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر في كثافة 5 × 10 4 خلايا / جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البكتيريا لعدوى. حارفالثقافات EST، غسل و resuspend مع برنامج تلفزيوني قبل صوتنة والترشيح من خلال حقنة من أجل تجنب تراكمها. تحديد تركيز كل سلالة من قبل OD600 قياس وتصيب THP-1 الخلايا في وزارة الداخلية 1:1 في 30 ° C (لالمتفطرة البحرية) أو 37 ° C (لالمتفطرة البقرية BCG والمتفطرة السلية) في RPMI المتوسطة مع 5٪ CO 2. بعد 2 ساعة، وإزالة المتوسطة، ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة متوسطة جديدة كاملة ل1-2 أيام (في حالة المتفطرة البحرية) أو 3-7 أيام (في حالة المتفطرة البقرية BCG والمتفطرة السلية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الخلايا مع CCF4-AM والتثبيت. غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وتحضير مزيج جار CCF4-AM كما هو موضح سابقا عن الحجم النهائي من 25 ميكرولتر لكل بئر باستخدام تركيز النهائي CCF4-AM من 6 ميكرومتر. جار يحدث في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 2 ساعة قبل غسل مع 150 ميكرولتر البروبينسيد PBS / 1 ملم وإصلاحأوجه استخدام 50 ميكرولتر بارافورمالدهيد عند 4٪ تستكمل with1 ملي البروبينسيد من أجل 30 دقيقة في الظلام. ثم، يغسل مع 150 ميكرولتر PBS / 1 ملي البروبينسيد وترك العينات في 100 ميكرولتر PBS / 1 ملي البروبينسيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعدادات اقتناء وتحليل ما بعد الاستحواذ. المضي قدما كما هو موضح سابقا في الفقرة الأولى باستخدام الشيجلا الفلكسنرية. </li></ol> بروتوكول إضافي يتم تنفيذ المقايسات الفلور من أجل التحقق النشاط β اكتاماز على سطح البكتيريا. وينبغي أن يتم ذلك لكل السلالة البكتيرية التي يعتزم استخدامها في مقايسة وصفها. لهذا الغرض، وضعت البكتيريا غسلها في اتصال مع 100 نانومتر CCF4-AM (إينفيتروجن)، 50 ميكروغرام / مل الخنازير مقتطفات الكبد استريز (سيغما) في 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في الظلام. ذوبان اكتاماز 1 ملغ / مل (إينفيتروجن) يمكن استخدامها كعنصر تحكم إيجابية. ثم، يتم إجراء فحص الانبعاثات في الإثارة 405nm وباستخدام PTI Quantamaster مقياس التألق والكوارت 1 ملZ كفيت. فقدان الحنق عند 535 نانومتر، وظهور ارتفاع ذروة نانومتر 450 هي تصور على البكتيريا بالإضافة إلى التحقيق CCF4.

<ol>
	<li>van der Goot, F. G., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-endosomal+membrane+traffic.">Intra-endosomal membrane traffic.</a> Trends Cell Biol. 16, 514-521 (2006).</li><li>Raposo, G., Marks, M. S., Cutler, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosome-related+organelles:+driving+post-Golgi+compartments+into+specialisation.">Lysosome-related organelles: driving post-Golgi compartments into specialisation.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 19, 394-401 (2007).</li><li>van der Wel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M.+leprae+translocate+from+the+phagolysosome+to+the+cytosol+in+myeloid+cells.">M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells.</a> Cell. 129, 1287-1298 (2007).</li><li>Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplication+of+Shigella+flexneri+within+HeLa+cells:+lysis+of+the+phagocytic+vacuole+and+plasmid-mediated+contact+hemolysis.">Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis.</a> Infect Immun. 51, 461-469 (1986).</li><li>Bobard, A., Mellouk, N., Enninga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotting+the+right+location-+imaging+approaches+to+resolve+the+intracellular+localization+of+invasive+pathogens.">Spotting the right location- imaging approaches to resolve the intracellular localization of invasive pathogens.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810, 297-307 (2011).</li><li>Beauregard, K. E., Lee, K. D., Collier, R. J., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH-dependent+perforation+of+macrophage+phagosomes+by+listeriolysin+O+from+Listeria+monocytogenes.">pH-dependent perforation of macrophage phagosomes by listeriolysin O from Listeria monocytogenes.</a> J. Exp. Med. 186, 1159-1163 (1997).</li><li>Shaughnessy, L. M., Hoppe, A. D., Christensen, K. A., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+perforations+inhibit+lysosome+fusion+by+altering+pH+and+calcium+in+Listeria+monocytogenes+vacuoles.">Membrane perforations inhibit lysosome fusion by altering pH and calcium in Listeria monocytogenes vacuoles.</a> Cell Microbiol. 8, 781-792 (2006).</li><li>Zlokarnik, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+transcription+and+clonal+selection+of+single+living+cells+with+beta-lactamase+as+reporter.">Quantitation of transcription and clonal selection of single living cells with beta-lactamase as reporter.</a> Science. 279, 84-88 (1998).</li><li>Charpentier, X., Oswald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+secretion+and+translocation+domain+of+the+enteropathogenic+and+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+effector+Cif,+using+TEM-1+beta-lactamase+as+a+new+fluorescence-based+reporter.">Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter.</a> J. Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).</li><li>Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+effector+translocation+by+the+type+III+secretion+system+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Cell Host Microbe. 3, 104-113 (2008).</li><li>Bish, S. E., Song, W., Stein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+bacterial+internalization+by+host+cells+using+a+beta-lactamase+reporter+strain:+Neisseria+gonorrhoeae+invasion+into+cervical+epithelial+cells+requires+bacterial+viability.">Quantification of bacterial internalization by host cells using a beta-lactamase reporter strain: Neisseria gonorrhoeae invasion into cervical epithelial cells requires bacterial viability.</a> Microbes Infect. 10, 1182-1191 (2008).</li><li>Ray, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+dynamic+interplay+between+bacterial+and+host+factors+during+pathogen-induced+vacuole+rupture+in+real+time.">Tracking the dynamic interplay between bacterial and host factors during pathogen-induced vacuole rupture in real time.</a> Cell Microbiol. 12, 545-556 (2010).</li><li>Blocker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripartite+type+III+secreton+of+Shigella+flexneri+inserts+IpaB+and+IpaC+into+host+membranes.">The tripartite type III secreton of Shigella flexneri inserts IpaB and IpaC into host membranes.</a> J. Cell Biol. 147, 683-693 (1999).</li><li>Mounier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IpaC+carboxyterminal+effector+domain+mediates+Src-dependent+actin+polymerization+during+Shigella+invasion+of+epithelial+cells.">The IpaC carboxyterminal effector domain mediates Src-dependent actin polymerization during Shigella invasion of epithelial cells.</a> PLoS Pathog. 5, e1000271 (2009).</li><li>Nowicki, B., Hart, A., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+consensus+repeat-3+domain+of+recombinant+decay-accelerating+factor+is+recognized+by+Escherichia+coli+recombinant+Dr+adhesin+in+a+model+of+a+cell-cell+interaction.">Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction.</a> The Journal of Experimental Medicine. 178, 2115-2121 (1993).</li><li>Nothelfer, K., Dias Rodrigues, C., Bobard, A., Phalipon, A., Enninga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Shigella+flexneri+vacuolar+escape+by+flow+cytometry.">Monitoring Shigella flexneri vacuolar escape by flow cytometry.</a> Virulence. 2, 54-57 (2011).</li><li>Simeone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosomal+rupture+by+Mycobacterium+tuberculosis+results+in+toxicity+and+host+cell+death.">Phagosomal rupture by Mycobacterium tuberculosis results in toxicity and host cell death.</a> PLoS Pathog. 8, e1002507 (2012).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

مقايسة CCF4-AM/β-lactamase هي طريقة مباشرة لتعقب انقطاع فجوي الناجم عن الخلايا الشيجلا الفلكسنرية والمتفطرات في أنواع مختلفة من الخلايا. فإنه يجعل من استخدام اكتاماز الحساسة حشوية الحنق المراسل أن هو المشقوق بواسطة انزيم نشط على سطح البكتيريا. فقدان الركيزة CCF4-AM يمكن بسهولة تجنبها عن طريق إضافة البروبينسيد إلى جميع الحلول بعد تحميل الركيزة. كما يتبين ذلك، يمكن تكييفها الفحص إلى أنواع خلايا متعددة (الخلايا الظهارية وخلايا البلعمة) والأشكال (96 جيد، 35 مم أطباق أسفل الزجاج، 6/12/24 لوحات جيدة). لاستخدام لوحة جيدا 6/12/24، يتم توزيع coverslips على العقيمة في الجزء السفلي من كل بئر قبل البذر الخلايا. في نهاية التجربة، يتم نقل coverslips على على الشرائح المتوسطة في تصاعد مستمر، مثل إطالة الذهب الكاشف Antifade (إينفيتروجن). بهذه الطريقة إشارة مستقرة لفترات زمنية أطول بعد الفحصمقارنة مع الآبار شكل 96 حيث يتم الاحتفاظ العينات في برنامج تلفزيوني بعد التثبيت. ينبغي أن تؤخذ في ارتفاع تكلفة الركيزة CCF4-AM بعين الاعتبار قبل تحديد حجم العينة. هذا هو السبب في أننا نوصي رفع عليهم. التجارب هي أكثر تكلفة في 6/12/24 شكل جيد ولكن الإشارات مستقرة لعدة أيام. على العكس من ذلك، والتجارب هي أرخص في شكل جيد 96، ولكن العينات يجب أن يتم تحليلها في يوم التجربة. ومن الجدير بالذكر أن التجارب الحية ويمكن أيضا أن يؤديها في البئر 96 أو 384 شكل جيد. وهذا يسمح أداء التجربة الحية باستخدام العشرات من ظروف في نفس الوقت (بكتيريا متحولة، وزارة الداخلية، ترنسفكأيشن البلازميد أو سيرنا، والمواد الكيميائية وغيرها) مع عدد من المواقف لكل بئر. على الرغم من أن مناسبة للدوسنتاريا الفلكسنرية، ونحن نسلط الضوء على أن &quot;الحقيقي&quot; في الوقت الحقيقي أو التجارب مرور الزمن ليست مجدية للدراسات المتفطرات منذ دورة العدوى يتجاوز تركيزات قابلة للقياس من CCF4 التي يمكن الاحتفاظ بها في العصارة الخلوية. إلىهذا السبب، يتم تطبيق الركيزة CCF4-AM على الخلايا فقط بعد تحقيق الغزو. في حال تم استخدام البرمجيات MetaMorph لاقتناء وتحليل، ونحن نوصي باستخدام الوحدة النمطية &quot;اقتناء شاشة&quot; الذي يسمح الاستحواذ على كامل 96/384 لوحة جيدا مع عدد محدد من الصور لكل بئر. وعلاوة على ذلك، وحدة &quot;البيانات الشاشة الآراء&quot; يسمح (ط) تصور هذه الفسيفساء صورة مخيط من كل بئر لأية قناة في نفس الوقت على &quot;ملصق&quot; كبيرة و(II) حلقات خوارزمية المتخصصة لقياس شدة في 535 و القنوات نانومتر 450. على الرغم من ذلك، كنا قادرين على قياس تمزق فجوي عن طريق البكتيريا واحدة باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري، نود أن نحذر من أن النشاط الأنزيمي على سطح البكتيريا الفردية تختلف مما يجعل من الصعب ربط على وجه التحديد عدد من البكتيريا داخل الخلايا وفعالية فجوي تمزق. نظرا لمتانة للمقايسة، هي مناسبة لمدة ساعةيقترب الإنتاجية IGH في 96 أو 384 صيغ بشكل جيد. نحن أيضا تكيفت بنجاح هذا البروتوكول لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لدراسة إصابة الخلايا في التعليق 16. ويمكن أيضا أن تستخدم الفحص للتحقيق من البكتيريا أو شركات الطيران الأخرى تقديم اكتاماز على سطحها، مما يؤدي إلى مجموعة واسعة من التطبيقات. على سبيل المثال، فإن هذا النهج يمكن استخدامها لدراسة تمزق فجوي الناجمة عن مسببات الأمراض الأخرى مثل β-اكتاماز معربا عن البكتيريا المستروحة، المستوحدة الليستيريا أو السالمونيلا التيفية الفأرية 12. منذ المستوحدة الليستيريا لديه دورة العدوى قصيرة مماثلة لالشيجلا الفلكسنرية، تجارب الوقت الفاصل بين ممكنة. في المقابل، لأن البكتيريا والسالمونيلا التيفية الفأرية المستروحة عرض دورات عدوى طويلة، فإننا نقترح على إجراء تجارب نقطة نهاية. مجموعة متنوعة من التطبيقات الممكنة يجعل فحص CCF4-AM/β-lactamase علىطريقة فلوروميتريك مثيرة للاهتمام لتتبع تمزق فجوي الناجمة عن مسببات الأمراض بين الخلايا في عينات ثابتة أو في الوقت الحقيقي.

يتم إدماج العديد من مسببات الأمراض البكتيرية في المقصورات المغلقة غشاء الخلايا حقيقية النواة خلال مسارها من العدوى. يحدث إدخال خلية إما عن طريق البلعمة بواسطة الخلايا المضيفة المتخصصة، كما هو الحال بالنسبة لالمتفطرة السلية التي يتم تناولها من قبل الضامة، أو مسببات الأمراض تحفز بنشاط امتصاص بهم إلى عادة الخلايا غير البلعمية. في حالة امتصاص يسببها، على سبيل المثال لالشيجلا الفلكسنرية، الممرض بحقن البروتينات المستجيب في العصارة الخلوية المضيف الذي خطف من بين وظائف الخلية الأخرى ينظم بإحكام endomembrane آلات الفرز مما أدى إلى توطين البكتيرية داخل مقصورة 1،2 endosomal. وفي وقت لاحق، الشيجلا يعطل غشاء أرفق مما يؤدي إلى تمزق فجوي والوصول عصاري خلوي من مسببات المرض تتداخل مع المضيف الاتجار غشاء وتجنب التسليم إلى يحلول. وفي الآونة الأخيرة، وقد وجد تمزق phagolysosomal أيضا باسم شارع العدوىتستخدم ategy بواسطة المتفطرة السلية، الممرض الذي كان يعتقد لفترة طويلة إلى أن تكون مترجمة حصرا داخل مقصورة غشاء محدد 3،17. للتحقيق في ديناميات الاتجار غشاء التحت خلوية من مسببات الأمراض الغازية، وقد تم تحقيق تحسينات كبيرة منذ المجهر الإلكتروني انتقال (TEM) دراسات من أواخر 1980s 4،5 القائمة. على سبيل المثال، أحاطت طرق الفحص المجهري مضان القائمة على استخدام الأجسام المضادة ضد الأصباغ مكونات سطح البكتيرية، أو علامات لاشتراكهما في توطين التحت خلوية مع مقصورات أكثر من 6،7. ومع ذلك، فإنها لا تزال لا تعطي القرار الزمانية المكانية دقة ومتانة لقياس تمزق فجوي من قبل مسببات الأمراض البكتيرية كميا. وقد عولجت هذه العقبة مع مقايسة على أساس مستمد CCF4-AM الحنق مراسل السيفالوسبورين الذي استخدم لأول مرة لدراسة التعبير الجيني 8. ثم، تم استخدامه في سياق INFعلم الأحياء ection للتحقيق في إفراز المستجيب ومتابعة امتصاص النيسيري في الخلايا المضيفة 9،10،11. وضعنا مقايسة الاستفادة من هذا المراسل لدراسة تمزق فجوي الناجم عن دوسنتاريا الفلكسنرية 12 و 17 المتفطرة السلية. يوصف مبدأ أسلوب لدينا في الشكل 1 باستخدام الشيجلا الفلكسنرية. أولا، يتم تحميل خلايا المضيف مع الحنق الركيزة CCF4-AM التي يتم محاصرين داخل السيتوبلازم بعد الشق قبالة AM الأنصاف استر. ثم، يصاب الخلايا مع الشغيلة الفلكسنرية. الحاضر β اكتاماز على السطح من البكتيريا قادرة على يلتصق الركيزة CCF4 حالما يحدث تمزق فجوي. وهذا يؤدي إلى فقدان إشارة الحنق التحول ذروة الانبعاثات من 535 نانومتر إلى 450 نانومتر على الإثارة من لجنة التحقيق في 405 نانومتر. قياس ratiometric من شدة نانومتر 450/535 يسلط الضوء على سلامة فجوي: النسب المنخفضة تعكس غشاء ENالبكتيريا مغلق أو خارج الخلية بينما نسب عالية تعكس الاتصال بين البكتيريا والعصارة الخلوية المضيف. نحن أيضا تقريرا للتكيف من هذا الأسلوب لدراسة تمزق phagosomal الناجم عن المتفطرة السلية في THP-1 الضامة. المبادئ التجريبية لا تزال هي نفسها على الرغم من أن التسلسل هو عكسه، يتم تطبيق CCF4-AM تحميل فقط بعد الإصابة البكتيرية. وهكذا، من خلال القياسات الكمية مضان ratiometric على مستوى خلية واحدة، يمكن تتبع تمزق فجوي من الشغيلة الفلكسنرية في الوقت الحقيقي والثابت في عينات من أنواع مختلفة من الخلايا 12،13،14. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذه الطريقة لعدد من مسببات الأمراض الغازية الأخرى كما هو موضح في هذه الدراسة باستخدام المتفطرة البقرية والمتفطرة السلية. وأخيرا، فإن التصغير من بروتوكول لدينا إلى 96 جيدا (أو 384 أيضا) صيغ يسمح فحص ظروف عديدة في إنتاجية عالية.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K1089</td>
			<td>Protect from light, stock in - 80 &deg; aliquots</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Draq5</td>
			<td>Biostatus</td>
			<td>DR50050</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&mu;CLEAR-PLATE, BLACK, 96 well </td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655090</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8761</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&beta;-lactamase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0389</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens

الشيجلا الفلكسنرية هي البكتيريا المسببة للأمراض التي تغزو الخلايا المضيفة الدخول في فجوة التقامي. وفي وقت لاحق، وتمزق هذا الغشاء المقصورة المغلقة يسمح البكتيريا للتحرك داخل العصارة الخلوية، تتكاثر وتغزو المزيد من الخلايا المجاورة. والمبتلعة المتفطرة السلية من قبل الخلايا المناعية، ولقد ثبت مؤخرا إلى تمزق غشاء phagosomal في الضامة. وضعنا مقايسة قوية لتتبع phagosomal اضطراب الغشاء بعد دخول الخلية المضيفة من الشغيلة الفلكسنرية أو المتفطرة السلية. نهج يجعل من استخدام CCF4، والحنق مراسل حساسة للβ اكتاماز أن equilibrates في العصارة الخلوية للخلايا المضيفة. على غزو الخلايا المضيفة من قبل مسببات الأمراض البكتيرية، لا يزال التحقيق سليمة طالما أن البكتيريا الموجودة في غشاء المقصورات المغلقة. بعد انقطاع فجوة، والنشاط β اكتاماز على سطح يشق الممرض داخل الخلايا CCF4 على الفور تؤديجي إلى فقدان الحنق إشارة والتبديل طيف الانبعاث لها. هذا الاختبار ratiometric قوية تعطي معلومات دقيقة حول توقيت تمزق فجوي الناجمة عن البكتيريا الغازية، وأنه يمكن أن يقترن إلى المجهر الآلي ومعالجة الصور بواسطة خوارزميات المتخصصة للكشف عن الإشارات الانبعاثات من الحنق المانحة ومتقبل. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح التحقيق في ديناميات الاضطراب فجوي التي تسببها البكتيريا داخل الخلايا في الوقت الحقيقي في الخلايا واحد. وأخيرا، هي مناسبة تماما لتحليل الإنتاجية العالية مع قرار المكانية والزمانية تتجاوز الأساليب السابقة. هنا، ونحن نقدم تفاصيل تجريبية من البروتوكولات المثالية لCCF4 فجوي مقايسة تمزق في خلايا هيلا وTHP-1 الضامة للتجارب الوقت الفاصل بين التجارب أو نقطة نهاية باستخدام الشيجلا الفلكسنرية وكذلك سلالات المتفطرات متعددة مثل المتفطرة البحرية، المتفطرة البقرية، والمتفطرة السلية.

النهج CCF4-AM/β-lactamase هو وسيلة قوية وحساسة لتتبع تمزق فجوي من مسببات الأمراض داخل الخلايا مثل الشيجلا الفلكسنرية (الشكل 1). وتسمى السلالات الشغيلة التي يتم استخدامها في هذه الدراسة M90T الفجر العالمية وBS176 الفجر العالمية. M90T الفجر العالمية هو الفلكسنرية سلالة الشغيلة التي تعبر عن adhesin AfaE، التي هي قادرة على ربط بكفاءة CD55 على سطح الخلايا الظهارية 15. سلالات التعبير عن ذلك AfaE عرض قدرات غزو أعلى بكثير بالمقارنة مع السلالة M90T من النوع البري في الخلايا الظهارية. BS176 الفجر العالمية هو AfaE معربا عن متحولة الشيجلا الفلكسنرية سلالة خالية من الفوعة الشيجلا البلازميد. هذه السلالة غير قادر على غزو خلايا هيلا. ومع ذلك هذه السلالة قادرة على دخول-1 THP الخلايا منذ امتصاص في هذا الخط الخلية تعتمد فقط على البلعمة الكلاسيكية و لا يتطلب نظام نوع-3 إفراز الوظيفية. كل سلالات التعبير عن β اكتاماز، وعرض آخر β اكتاماز على سطحها بسبب وجود ترميز AfaE البلازميد. عند إصابة الخلية هيلا مع غير الغازية BS176 الفجر العالمية سلالة لمدة 1 ساعة، وCCF4 الحنق لا يزال التحقيق سليمة، كما هو مبين في الشكل 2A بواسطة إشارة خضراء (535 نانومتر). على العكس من ذلك، فإن العدوى مع ضراوة M90T الفجر العالمية سلالة لمدة 1 ساعة يؤدي إلى التحول من إشارة نحو الأزرق (450 نانومتر) وتسليط الضوء على الانقسام لجنة التحقيق في العصارة الخلوية. من أجل تحديد هذا، قمنا بتطوير برنامج نصي لMetamorph وAcapella البرمجيات التي تسمح الكشف الآلي من الخلايا وقياس شدة في القنوات نانومتر 535 و 450 لتحديد إشارة ratiometric. كما هو مبين في الشكل 2B، نوى والعصارة الخلوية من الخلايا هي مجزأة باستخدام قناة Draq5. ثم، الخوارزمية هي قادرة على الكشف عن 450 نانومتر ونانومتر 535 السكان الخلية إيجابية لحساب النسب بين شدة اثنين لكل خلية الفردية التي هيممثلة على النحو الرسم البياني في الشكل 2C. ويتم الحصول على نسب منخفضة لسلالة متحولة مقابل نسب عالية للسلالة فتاكة. في حين تم الاستحواذ هذه التجربة عدوى ممثل باستخدام المجهر متحد البؤر، هي مناسبة المجهري epifluorescence أيضا لهذه المهمة أرقام 3 و 4 أمثلة توضح باستخدام 2 أنواع مختلفة من الخلايا البشرية: الخلايا الظهارية هيلا وTHP-1 خلايا البلاعم الشبيهة. على العدوى مع ضراوة M90T الفجر العالمية الشيجلا سلالة لمدة 1 ساعة و 90 دقيقة للهيلا وTHP-1 خلايا، والتحول من إشارة من الأخضر (535 نانومتر) إلى اللون الأزرق (450 نانومتر) وقد لوحظ مقارنة BS176 الفجر العالمية الخلايا المصابة (أرقام 3A و4A). النصي وضعنا على MetaMorph البرمجيات بالكشف مباشرة السكان إيجابية CCF4 من الخلايا وحساب النسبة بين شدة في 450 و 535 نانومتر قنوات لكل الخلايا الفردية. ثم تصنف الخلايا بوصفها وظيفة من نسبتهم باستخدام develo الماكروPED في Excel، وبالتالي الرضوخ رسوم بيانية تبين توزيع الخلية. كما كان الحال بالنسبة لالنصي المتقدمة الأخرى لAcapella، وتتميز BS176 الفجر العالمية الخلايا المصابة بنسب منخفضة، في حين M90T الفجر العالمية الخلايا المصابة عرض نسب عالية باستخدام خوارزمية MetaMorph على خلايا هيلا وTHP-1 الضامة (أرقام 3B و 4B) . وأخيرا، يظهر للتكيف من هذا الأسلوب لدراسة المتفطرات في الشكل 5. المتفطرة البقرية BCG يقيم في يبلوع لدورة كاملة من التجربة، وهو ما انعكس في 535 نانومتر إشارة قوية الكشف طوال الوقت من التجربة. في المقابل، المتفطرة السلية يتسبب تمزق غشاء phagosomal في THP-1 الضامة بعد أكثر من 3 أيام من العدوى على نحو ما أبرزته إشارة نانومتر 450 في 7 أيام من العدوى (الشكل 5A و 5B). باستخدام نفس الخوارزمية كما لدراسة تمزق فجوي بواسطة الشيجلا </EM&gt;، وجدنا أن الخلايا المصابة المتفطرة السل عرض أعلى 450/535 نانومتر نسب من المتفطرة البقرية BCG بعد 7 أيام من العدوى (أرقام 5C و 5D). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig1.jpg" /> الشكل 1. مخطط يمثل مبدأ مقايسة CCF4-AM/β-lactamase لتتبع الشيجلا الفلكسنرية فجوي تمزق. CCF4-AM ينشر بحرية من خلال غشاء البلازما إلى السيتوبلازم حيث المشقوق الأنصاف استر قبالة عن طريق الاسترات عصاري خلوي إنتاج CCF4 الأنيونات. هذا رد فعل يمنع من دخول أي CCF4 غشاء مقصورة المضمنة. في هذه الخطوة، CCF4 يثير الحنق في 535 نانومتر على الإثارة في 405 نانومتر. لا يزال التحقيق قائما حتى البكتيريا معربا عن β اكتاماز rupturE فجوة التقامي. في هذه الخطوة، والحنق يتم فقدان إشارة لأن CCF4 هو المشقوق عن طريق إحداث β اكتاماز التحول في الانبعاثات من 535 نانومتر إلى 450 نانومتر على الإثارة في 405 نانومتر. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="2.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig2.jpg" /> الشكل 2. تتبع الشيجلا الفلكسنرية فجوي تمزق باستخدام المجهر متحد البؤر. (A) وبعد 2 ساعة و 30 دقيقة من CCF4-AM جار، يصاب خلية هيلا مع β اكتاماز معربا عن الشغيلة الفلكسنرية BS176 الفجر العالمية متحولة سلالة أو M90T الفجر العالمية سلالة فتاكة لمدة 1 ساعة والثابتة باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 10 دقيقة. ثم، هي ملطخة النوى مع Draq5 ويتم تصوير الخلايا باستخدام المجهر متحد البؤر مع الهدف 10X. وقد تم اختيار الصور مع ممثل القنوات المدمجة التالية: تظهر سليمة CCF4 التحقيق في 535 نانومتر (الجشعن)، يظهر المشقوق CCF4 التحقيق في 450 نانومتر (الأزرق). (ب) أمثلة من الصور تسليط الضوء على نظام الكشف عن خوارزمية الآلي لدينا على البرنامج Acapella. يتم الحصول على تجزئة من الخلايا (نوى + العصارة الخلوية) باستخدام قناة Draq5. ويتم الحصول على الخلايا إيجابية CCF4 باستخدام قنوات نانومتر 450 و 535 مجمعة معا. (C) الرسم البياني تظهر نتائج التحليل الآلي لدينا على Acapella باستخدام الشيجلا الفلكسنرية BS176 الفجر العالمية متحولة سلالة أو M90T الفجر العالمية سلالة فتاكة. نسبة متوسط ​​يمثل النسبة بين كثافة في القنوات نانومتر 450 و 535. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50116/50116fig2large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig3.jpg" /> الشكل (3). تتبع الشيجلا FLExneri فجوي تمزق في خلايا هيلا باستخدام المجهر epifluorescence. (A) وبعد 2 ساعة و 30 دقيقة من CCF4-AM جار، يصاب خلايا هيلا مع β اكتاماز معربا عن الشغيلة الفلكسنرية BS176 الفجر العالمية متحولة سلالة أو M90T الفجر العالمية سلالة فتاكة لمدة 1 ساعة و ثابتة باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 10 دقيقة. ثم، يتم تصوير الخلايا باستخدام المجهر epifluorescence مع الهدف 20X. وقد تم اختيار الصور مع ممثل القنوات التالية:. CCF4 سليمة مسبار 535 نانومتر (الأخضر) وCCF4 المشقوق مسبار 450 نانومتر (الأزرق) (B) الرسم البياني تمثل نتائج التحليل الآلي لدينا على البرمجيات MetaMorph. وتوزع الخلايا الفردية في وظيفة من نسبتهم من شدة في القنوات نانومتر 450 و 535. <img alt="الشكل 4" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig4.jpg" /> &gt; الشكل 4. تتبع الشيجلا الفلكسنرية فجوي تمزق في THP-1 الخلايا باستخدام المجهر epifluorescence. (A) وبعد 2 ساعة و 30 دقيقة من CCF4-AM جار، THP-1 يصاب الخلايا مع β اكتاماز معربا عن الشغيلة الفلكسنرية BS176 الفجر العالمية متحولة سلالة أو M90T الفجر العالمية سلالة فتاكة لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة وثابتة باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 10 دقيقة. ثم، يتم تصوير الخلايا باستخدام المجهر epifluorescence مع الهدف 20X. وقد تم اختيار الصور مع ممثل القنوات التالية:. CCF4 سليمة مسبار 535 نانومتر (الأخضر) وCCF4 المشقوق مسبار 450 نانومتر (الأزرق) (B) الرسم البياني تمثل نتائج التحليل الآلي لدينا باستخدام برنامج MetaMorph. وتوزع الخلايا الفردية في وظيفة من نسبتهم من شدة في القنوات نانومتر 450 و 535. ghres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/50116/50116fig5.jpg &quot;/&gt; الشكل 5. تتبع المتفطرة البقرية BCG والمتفطرة السلية تمزق phagosomal في THP-1 الضامة باستخدام المجهر epifluorescence. (A، B) THP-1 يصاب الخلايا مع β اكتاماز معربا عن المتفطرة البقرية BCG أو المتفطرة السلية لمدة 2 ساعة وتربيتها لمدة 3-7 أيام . بعد الغسيل، يتم تحميل خلايا مع CCF-4-AM لمدة 2 ساعة والثابتة باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 30 دقيقة قبل التصوير باستخدام مجهر epifluorescence مع الهدف 40X. وقد تم اختيار الصور مع ممثل القنوات التالية: سليمة CCF4 التحقيق، 535 نانومتر (الأخضر)؛ المشقوق CCF4، مسبار 450 نانومتر (الأزرق) (C، D) المدرج الإحصائي تقديم نتائج التحليل الآلي لدينا باستخدام البرمجيات MetaMorph. وتوزع الخلايا الفردية وظيفة من النسبة بين كثافة في القنوات نانومتر 450 و 535.

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens at JoVE.com

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

نحن تصف طريقة لتتبع تمزق endomembrane التي تسببها البكتيريا داخل الخلايا<em&gt; الشيجلا الفلكسنرية<em&gt;</em</em&gt; و<em<em&gt;<em&gt; المتفطرة السلية</em&gt;</em</em&gt; على غزو الخلية المضيفة. لدينا فحص يجعل من استخدام CCF4، مجموعة حشوية الحنق التحقيق في الخلايا الحية أو الثابتة. هذا المراسل هو المتدهورة من جراء نشاط إنزيم موجود على سطح البكتيرية.

القياسات خلية واحدة من تمزق رغوي الناجمة عن مسببات الأمراض بين الخلايا

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

single-cell-measurements-vacuolar-rupture-caused-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K Views.  Institut Pasteur, Paris, France. نحن تصف طريقة لتتبع تمزق endomembrane التي تسببها البكتيريا داخل الخلايا الشيجلا الفلكسنرية

Video: Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an effective invasin for human epithelial and endothelial cells. We have identified endothelial surface-located integrins as major receptors for Opc, a process which requires Opc to first bind to integrin ligands such as vitronectin and via these to the cell-expressed receptors1. This process leads to bacterial invasion of endothelial cells2. More recently, we observed an interaction of Opc with a 100kDa protein found in whole cell lysates of human cells3. We initially observed this interaction when host cell proteins separated by electrophoresis and blotted on to nitrocellulose were overlaid with Opc-expressing Nm. The interaction was direct and did not involve intermediate molecules. By mass spectrometry, we established the identity of the protein as &alpha;-actinin. As no surface expressed &alpha;-actinin was found on any of the eight cell lines examined, and as Opc interactions with endothelial cells in the presence of serum lead to bacterial entry into the target cells, we examined the possibility of the two proteins interacting intracellularly. For this, cultured human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) were infected with Opc-expressing Nm for extended periods and the locations of internalised bacteria and &alpha;-actinin were examined by confocal microscopy. We observed time-dependent increase in colocalisation of Nm with the cytoskeletal protein, which was considerable after an eight hour period of bacterial internalisation. In addition, the use of quantitative imaging software enabled us to obtain a relative measure of the colocalisation of Nm with &alpha;-actinin and other cytoskeletal proteins. Here we present a protocol for visualisation and quantification of the colocalisation of the bacterium with intracellular proteins after bacterial entry into human endothelial cells, although the procedure is also applicable to human epithelial cells.

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &amp;#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), a gram negative human-specific respiratory pathogen, can bind to human &alpha;-actinin. Here we present a protocol for visualisation of colocalisation of the bacterium with intracellular &alpha;-actinin after bacterial entry into human brain microvascular endothelial cells (HBMECs).

التخيل والكمي لالتفاعلات داخل الخلايا النيسرية السحائية والإنسان α - actinin بواسطة التصوير متحد البؤر

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

إصابة الأجنة الزرد مع مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

اكتشاف جديد بين الخلايا مسببات الأمراض عن طريق Amoebal Coculture والمناهج Amoebal التخصيب

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

تطبيق نيون النانوية لدراسة إعادة عرض لنظام إندو-الليزوزومية من البكتيريا داخل الخلايا

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

التحول Biolistic من نيون معلم جين إلى القناص الفطرية مسببات الأمراض<em&gt; المستخفية المورمة</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

الكمي عصاري خلوي مقابل رغوي<em&gt; السالمونيلا</em&gt; في الضامة الابتدائية التي كتبها التفاضلية Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

تحديد مسببات الأمراض البكتيرية النادرة التي 16S الريباسي جين تسلسل وMALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

كشف الإنتاجية العالية للجهاز التنفسي مسببات الأمراض في العينات الحيوانية التي كتبها النانو PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

تصور داخل الخلايا المطوقة الاتجار بواسطة عمر Fluorescence التصوير المجهري

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...