עבודה זו מומנה על ידי סוכנות הידיעות Nationale pour la משוכלל ונדיר ועל ידי מועצת המחקר האירופית.

Assay עובד בפורמטים שונים, עם זאת אנו ממליצים קנה מידה במורד נפח הדגימה כדי להציל את חומרים כימיים, במיוחד CCF4-PM. לכן, הפרוטוקול הבא מתואר לתאי הלה קבועים או THP-1 תאים דמויי מקרופאג בפורמט גם 96, ולאחר מכן לתאי הלה פעילים ב35 מנות תחתיות זכוכית מ&quot;מ. Assay יכול להיות מותאם לפתוגנים אחרים. חוץ מזיהום Shigella, אנו מתארים assay עבור THP-1 מ &#39;זנים שונים phagocytosing y cobacterial. חשוב מכך, לאחר טעינת CCF4-בבוקר, כל חומרים כימיים והחוצצים בין מאגרי כביסה דורשים הנוכחות של probenecid ב1 מ&quot;מ. Probenecid הוא מעכב ערוץ אניון שמקדם שימור cytosolic של CCF4 לאורך כל השלבים של הפרוטוקול. דגימות קבועות צריכים להירכש תוך כמה שעות לאחר הניסוי מאז אות CCF4 אינה יציבה לפרקי זמן ארוכים. 1. CCF4 Assay על דגימות קבועות באמצעות Shigella Flexneri (96 צלחות גם) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חיידקים לתרבויות לילה. לחסן את טרום תרבויות חיידקי סוג בר (M90T AfaI) ומוטציה (BS176 AfaI) זני יום 1 לפני הזיהום ב8 מיליליטר tryptic קזאין סויה מרק (TCSB) בתוספת אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) שבייקר על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי ציפוי לזיהום. תאי זרע הלה ב96 צלחות גם יום 1 לפני הזיהום בצפיפות של 5 x 10 3 תאים לכל גם בDMEM המכיל 10% עוברי עגל בסרום (FCS) ופניצילין, סטרפטומיצין 1% בשנת 5% CO 2 באינקובטור בנפח סופי של 100 μl. במקרה של תאי THP-1 דמוי מקרופאג, ציפוי תא נעשה 2 ימים לפני הזיהום בצפיפות של 5 x 10 4 תאים / היטב, והם מודגרת עם 30 ננומטר אצטט Myristate phorbol (PMA) בRPMI המכיל 10% עוברי עגל בסרום (FCS), 1% פניצילין, streptomycine ו0.05 מ&quot;מ 2-mercaptoethanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה לחיידקים תת. לחסן תרבויות חיידקי לילהבדילול 1/100 בTCSB בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין שבייקר על 37 מעלות צלזיוס למשך 2.5 שעות (OD600 = 0.3-0.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת תאים עם CCF4-AM. מכין את תערובת CCF4-AM הטעינה עבור נפח סופי של 25 μl לכל גם מכיל 1 מ&quot;מ probenecid (Sigma), 1.5 מיקרומטר CCF4-AM (6 מיקרומטר במקרה של THP-1) ו1.25 μl של טעינת הפתרון B (100 מ&quot;ג / מיליליטר Pluronic-F127 פעילי שטח בDMSO/0.1% חומצה אצטית מסופק יחד ערכת CCF4-AM LiveBlazer טעינה על ידי Invitrogen) בחיץ EM (120 מ&quot;מ NaCl, 7 מ&quot;מ KCl, 1.8 מ&quot;מ CaCl 2, 0.8 מ&quot;מ MgCl 2, גלוקוז 5 מ&quot;מ, 25 מ&quot;מ בHEPES pH 7.3). לשטוף את תאי פעם עם PBS ולהוסיף 25 μl של CCF4-AM תמהיל טעינה לכל גם בטמפרטורת חדר בחושך במשך 2.5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חיידקים לזיהום. ספין 1 מ&quot;ל של תת תרבות חיידקים ב9,000 סל&quot;ד דקות 1. שטפי פעם עם 500 PBS μl, ספין ב9,000 סל&quot;ד דקות 1 ו resuspend ב PBS μl 500 בתוספת 10 מיקרוגרם / מיליליטר פולי-L-ליזין (Sigma) ו -40 מיקרוגרם / מיליליטר β-lactaMASE (Sigma). לאחר 10 דקות של דגירה על גלגל מסתובב בטמפרטורת חדר, לשטוף פעם אחת עם 500 PBS μl וחיידקים resuspend במאגר 500 EM / probenecid 1 מ&quot;מ μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהום סלולרי וקיבעון. לשטוף את תאי פעם אחת עם 150 מ&quot;מ probenecid μl PBS / 1, להכין תערובת של 10 μl של חיידקי resuspended בנפח סופי של 100 μl של EM חיץ / probenecid 1 מ&quot;מ ולהפיץ אותו לכל אחד. לאחר הדגירה 15 דקות בחושך בטמפרטורת חדר, לעבור את הצלחת עד 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 (90 דקות במקרה של THP-1), לשטוף עם 150 PBS μl / probenecid 1 מ&quot;מ ולתקן עם paraformaldehyde 4% 50 μl / 1 מ&quot;מ probenecid למשך 10 דקות בחושך. לאחר מכן, לשטוף עם 150 PBS μl / probenecid 1 מ&quot;מ, דגירה למשך 30 דקות עם 30 μl של 10 מיקרומטר גרעיני הצבע Draq5 (Biostatus), לשטוף עם 150 PBS μl / probenecid 1 מ&quot;מ ולהשאיר את הדגימות ב100 PBS μl / probenecid 1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרות רכישת דגימות קבועות. רכישה מתבצעת גם באמצעות (i) מייקר epifluorescence הפוךלהתמודד עם 20x (0.5 צמצם מספרי (NA), 2.1 מרחק עבודה (WD)) או 40x (0.75 NA, 0.72 WD) אובייקטיבי אוויר N-תכנית או (ii) באמצעות מיקרוסקופ confocal עם מטרת 10x. דימות פלואורסצנטי מתבצעת עם עירור ב 405 ננומטר (Semrock, FF01-387/11-25) והפליטה זוהתה באמצעות 450 ננומטר (Semrock, FF02-447/60-25) ומסננים (535 ננומטר Semrock, FF01-520/35- 25) שימוש בזמני חשיפה של 5 אלפיות שנייה (אור מועבר), 1,000 אלפיות שנייה (535 ננומטר) ו500 אלפיות שניים (450 ננומטר). ההדמיה confocal מתבצעת באמצעות זמן החשיפה הבא: 240 אלפיות שני (450 ננומטר) ו360 אלפיות שניים (535 ננומטר) עבור 405 ננומטר לייזר (870 μW), 640 אלפית השני (Draq5) עבור 640 ננומטר לייזר (2560 μW). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח שלאחר רכישה. כתוצאה מכך, תמונות נותחו על ידי אלגוריתם מחשב המאפשר ניקוד אוטומטי של אות הקרינה עבור כל אדם תאים. ניתן להשתמש בתוכנה כגון Metamorph 7.1 או Acapella ליצור תסריט למדידת היחס בין אותות פליטת 450nm ו535nm (על פי בקשה). ראוי לציין, השימוש במכשיר כיול פוקוס מצמידים את מיקרוסקופיה האוטומטית במהלך הרכישה מאפשר לרכוש עשרות עמדות שונות במספר רב של בארות באותו הזמן. </li></ol> 2. CCF4 Assay בדוגמאות חיים באמצעות Shigella flexneri (35 עיצוב זכוכית תחתון מ&quot;מ, MatTek) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חיידקים לתרבויות לילה. המשך כפי שתואר קודם לכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי ציפוי לזיהום. תאי זרע הלה ב35 מנות מ&quot;מ זכוכית תחתונה תרבות (MatTek 10 מ&quot;מ microwell, MatTek תאגיד) 1 יום לפני הזיהום בצפיפות של 2 x 10 5 תאים / צלחת בנפח סופי של 2 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה לחיידקים תת. המשך כפי שתואר קודם לכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת תאים עם CCF4-AM. מכין את תערובת טעינת CCF-AM כפי שתואר לעיל עבור נפח סופי של 2 מ&quot;ל למנה. לפני טעינתו, לשטוף את התאים פעם עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חיידקים לזיהום. המשך כפי שתואר קודם לכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Acquisitהגדרות יון של דגימות חיות. רכישה מתבצעת במשך 60 דקות בכל 90 שניות עם מיקרוסקופ epifluorescence הפוך באמצעות 20x (NA 0.5, 2.1 WD) או אובייקטיבי אוויר 40x (0.75 NA, 0.72 WD) N-תכנית בתוך 37 מעלות צלזיוס תא חימום. דימות פלואורסצנטי מתבצעת עם עירור ב 405 ננומטר (Semrock, FF01-387/11-25) והפליטה זוהתה באמצעות 450 ננומטר (Semrock, FF02-447/60-25) ומסננים (535 ננומטר Semrock, FF01-520/35- 25) שימוש בזמני חשיפה של 5 אלפיות שנייה (אור מועבר), 200 אלפיות שנייה (535 ננומטר) ו100 אלפיות שניות (450 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהום סלולרי ורכישה חי. לשטוף את תאי פעם אחת עם 2 מ&quot;ל PBS / probenecid 1 מ&quot;מ, להוסיף 2 מ&quot;ל של EM / probenecid 1 מ&quot;מ, הר הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ ולהתחיל את הרכישה. לאחר 6 דקות (4 נקודה זמן), לשים את הרכישה בהמתנה, להוסיף 250 μl של resuspension חיידקים על גבי התאים ולהפעיל מחדש את הרכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח שלאחר רכישה. סרטים ניתן דמיינו באמצעות Metamorph או ImageJ. 450/535 ננומטר יחסי עוצמה עבור כל indiviניתן להשיג בתא כפול באמצעות ImageJ. כפי שהוזכר קודם לכן, את השימוש במכשיר כיול פוקוס מצמידים את מיקרוסקופיה האוטומטית במהלך הרכישה מאפשר לרכוש עמדות שונות מרובות, בהתאם לזמן לשגות. </li></ol> 3. CCF4 Assay על דגימות קבועות באמצעות Mycobacteria (96 פורמט טוב) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חיידקים. לגדול זני mycobacterial לשלב אמצע יומן ב7H9 המכיל דקסטרוז אלבומין קטלאז (ADC) על 30 מעלות צלזיוס (לMycobacterium marinum) או 37 מעלות צלזיוס (Mycobacterium לוביס BCG וMycobacterium tuberculosis). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי ציפוי לזיהום. מקרופאגים-1 THP פלייט 2 ימים לפני ההדבקה דוגרים אותם עם 30 ננומטר PMA בRPMI המכיל 10% עוברי עגל בסרום (FCS), פניצילין, סטרפטומיצין 1% ו0.05 מ&quot;מ 2-mercaptoethanol ב5% CO 2 באינקובטור בנפח סופי של 100 μl בצפיפות של 5 x 10 4 תאים / היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חיידקים לזיהום. הארוותרבויות est, לשטוף וresuspend עם PBS לפני sonication וסינון באמצעות מזרק על מנת להימנע מיצירת גושים. קבע את הריכוז של כל זן על ידי OD600 מדידה ולהדביק תאי THP-1 במשרד פנים של 1:1 על 30 מעלות צלזיוס (לMycobacterium marinum) או 37 מעלות צלזיוס (Mycobacterium לוביס BCG וMycobacterium tuberculosis) במדיום RPMI עם 5% CO 2. לאחר 2 שעות, להסיר בינונית, לשטוף 3 פעמים עם PBS ולהוסיף בינוניות טרי שלמה ל -1 או 2 ימים (במקרה של Mycobacterium marinum) או 3 עד 7 ימים (במקרה של Mycobacterium בוביס BCG וMycobacterium tuberculosis). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת תאים עם CCF4-AM וקיבעון. לשטוף את תאי פעם עם PBS ולהכין את תערובת טעינת CCF4-AM כפי שתואר לעיל עבור נפח סופי של 25 μl לכל גם באמצעות ריכוז סופי CCF4-AM של 6 מיקרומטר. טוען מתרחש בטמפרטורת חדר בחושך במשך שעה 2 לפני הכביסה עם 150 מ&quot;מ probenecid PBS / 1 μl ולתקןation באמצעות 50 paraformaldehyde μl ב 4% בתוספת with1 מ&quot;מ probenecid למשך 30 דקות בחושך. לאחר מכן, לשטוף עם 150 מ&quot;מ probenecid μl PBS / 1 ולהשאיר את הדגימות ב100 PBS μl / probenecid 1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרות רכישה וניתוח שלאחר רכישה. המשך כפי שתואר לעיל בפסקה הראשון באמצעות Shigella flexneri. </li></ol> פרוטוקול משלים מבחני Fluorimetric מבוצעים על מנת לבדוק פעילות β-lactamase על פני השטח של חיידקים. זה צריך להיעשות עבור כל זן חיידקים מיועדים לשמש בassay תאר. לצורך כך, הם הכניסו חיידקי שטף במגע עם 100 ננומטר CCF4-AM (Invitrogen), 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​תמציות כבד החזיריות esterase (Sigma) ב 1 מ&quot;ל של PBS במשך שעה 1 ב 37 ° C בחושך. המסיס lactamase 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(Invitrogen) יכול לשמש כביקורת חיובית. לאחר מכן, סריקת פליטה מתבצעת בעירור 405nm באמצעות fluorimeter PTI Quantamaster וליטר 1 מ&quot;לz קובט. הפסד של 535 ננומטר סריג ובמראה של פסגה גבוהה ננומטר 450 הם דמיינו על חיידקים בנוסף לבדיקת CCF4.

<ol>
	<li>van der Goot, F. G., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-endosomal+membrane+traffic.">Intra-endosomal membrane traffic.</a> Trends Cell Biol. 16, 514-521 (2006).</li><li>Raposo, G., Marks, M. S., Cutler, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosome-related+organelles:+driving+post-Golgi+compartments+into+specialisation.">Lysosome-related organelles: driving post-Golgi compartments into specialisation.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 19, 394-401 (2007).</li><li>van der Wel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M.+leprae+translocate+from+the+phagolysosome+to+the+cytosol+in+myeloid+cells.">M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells.</a> Cell. 129, 1287-1298 (2007).</li><li>Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplication+of+Shigella+flexneri+within+HeLa+cells:+lysis+of+the+phagocytic+vacuole+and+plasmid-mediated+contact+hemolysis.">Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis.</a> Infect Immun. 51, 461-469 (1986).</li><li>Bobard, A., Mellouk, N., Enninga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotting+the+right+location-+imaging+approaches+to+resolve+the+intracellular+localization+of+invasive+pathogens.">Spotting the right location- imaging approaches to resolve the intracellular localization of invasive pathogens.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810, 297-307 (2011).</li><li>Beauregard, K. E., Lee, K. D., Collier, R. J., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH-dependent+perforation+of+macrophage+phagosomes+by+listeriolysin+O+from+Listeria+monocytogenes.">pH-dependent perforation of macrophage phagosomes by listeriolysin O from Listeria monocytogenes.</a> J. Exp. Med. 186, 1159-1163 (1997).</li><li>Shaughnessy, L. M., Hoppe, A. D., Christensen, K. A., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+perforations+inhibit+lysosome+fusion+by+altering+pH+and+calcium+in+Listeria+monocytogenes+vacuoles.">Membrane perforations inhibit lysosome fusion by altering pH and calcium in Listeria monocytogenes vacuoles.</a> Cell Microbiol. 8, 781-792 (2006).</li><li>Zlokarnik, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+transcription+and+clonal+selection+of+single+living+cells+with+beta-lactamase+as+reporter.">Quantitation of transcription and clonal selection of single living cells with beta-lactamase as reporter.</a> Science. 279, 84-88 (1998).</li><li>Charpentier, X., Oswald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+secretion+and+translocation+domain+of+the+enteropathogenic+and+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+effector+Cif,+using+TEM-1+beta-lactamase+as+a+new+fluorescence-based+reporter.">Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter.</a> J. Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).</li><li>Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+effector+translocation+by+the+type+III+secretion+system+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Cell Host Microbe. 3, 104-113 (2008).</li><li>Bish, S. E., Song, W., Stein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+bacterial+internalization+by+host+cells+using+a+beta-lactamase+reporter+strain:+Neisseria+gonorrhoeae+invasion+into+cervical+epithelial+cells+requires+bacterial+viability.">Quantification of bacterial internalization by host cells using a beta-lactamase reporter strain: Neisseria gonorrhoeae invasion into cervical epithelial cells requires bacterial viability.</a> Microbes Infect. 10, 1182-1191 (2008).</li><li>Ray, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+dynamic+interplay+between+bacterial+and+host+factors+during+pathogen-induced+vacuole+rupture+in+real+time.">Tracking the dynamic interplay between bacterial and host factors during pathogen-induced vacuole rupture in real time.</a> Cell Microbiol. 12, 545-556 (2010).</li><li>Blocker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripartite+type+III+secreton+of+Shigella+flexneri+inserts+IpaB+and+IpaC+into+host+membranes.">The tripartite type III secreton of Shigella flexneri inserts IpaB and IpaC into host membranes.</a> J. Cell Biol. 147, 683-693 (1999).</li><li>Mounier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IpaC+carboxyterminal+effector+domain+mediates+Src-dependent+actin+polymerization+during+Shigella+invasion+of+epithelial+cells.">The IpaC carboxyterminal effector domain mediates Src-dependent actin polymerization during Shigella invasion of epithelial cells.</a> PLoS Pathog. 5, e1000271 (2009).</li><li>Nowicki, B., Hart, A., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+consensus+repeat-3+domain+of+recombinant+decay-accelerating+factor+is+recognized+by+Escherichia+coli+recombinant+Dr+adhesin+in+a+model+of+a+cell-cell+interaction.">Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction.</a> The Journal of Experimental Medicine. 178, 2115-2121 (1993).</li><li>Nothelfer, K., Dias Rodrigues, C., Bobard, A., Phalipon, A., Enninga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Shigella+flexneri+vacuolar+escape+by+flow+cytometry.">Monitoring Shigella flexneri vacuolar escape by flow cytometry.</a> Virulence. 2, 54-57 (2011).</li><li>Simeone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosomal+rupture+by+Mycobacterium+tuberculosis+results+in+toxicity+and+host+cell+death.">Phagosomal rupture by Mycobacterium tuberculosis results in toxicity and host cell death.</a> PLoS Pathog. 8, e1002507 (2012).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

Assay CCF4-AM/β-lactamase הוא שיטה פשוטה כדי לעקוב אחר שיבוש vacuolar תאי הנגרם על ידי Shigella flexneri וmycobacteria בתאים מסוגים שונים. זה עושה שימוש בכתב סריג שהוא ביקע ידי אנזים פעיל על פני השטח של החיידקים רגיש cytoplasmic lactamase. אובדן של מצע CCF4-AM יכול בקלות להימנע על ידי הוספת probenecid לכל פתרונות לאחר הטעינה של המצע. כפי שהוכח, assay יכול להיות מותאם לסוגי תאים מרובים (תאי אפיתל, תאי phagocytic) ותבניות (96 טובים, 35 מנות תחתיות זכוכית מ&quot;מ, 6/12/24 גם צלחות). לשימוש ב6/12/24 הצלחת היטב, coverslips סטריליים מופצות בתחתית כל היטב לפני זריעת התאים. בסופו של הניסוי, coverslips מועברות בשקופיות בהרכבה בינונית, כמו להאריך את מגיב Antifade זהב (Invitrogen). בדרך זו האות היא יציבה לפרקי זמן ארוכים יותר לאחר assayבהשוואה לפורמט 96 הבארות שבו דגימות נשמרות בPBS לאחר קיבוע. העלות הגבוהה של מצע CCF4-AM צריכה להילקח בחשבון לפני קביעת נפח הדגימה. זו הסיבה שאנחנו ממליצים על קנה מידה במורד אותם. ניסויים יקרים יותר ב6/12/24 פורמט היטב, אך את האותות הם יציבים במשך ימים. אדרבה, ניסויים הם זולים יותר בפורמט גם 96, אבל דגימות צריכים להיות מנותחות ביום של הניסוי. ראוי לציין כי גם ניתן לבצע ניסויים בחיות גם 96 או 384 פורמט היטב. זה מאפשר ביצוע ניסוי חי באמצעות עשרות תנאים באותו הזמן (חיידקים שעברו מוטציה, מוי, transfection פלסמיד או siRNA, כימיקלים וכו &#39;) עם מספרים של עמדות בכל טוב. אמנם מתאים לShigella flexneri, אנו מדגישים כי בזמן אמת &quot;אמיתי&quot; או ניסויי זמן לשגות הם לא ריאלי עבור מחקרי mycobacteria מאז מחזור הזיהום עולה על ריכוזים מדידים של CCF4 שיכול להישמר בcytosol. עבורמהסיבה זו, מצע CCF4-AM מוחל על תאים רק לאחר הפלישה מושגת. במקרה תוכנת MetaMorph משמשת לרכישה והניתוח, אנו ממליצים להשתמש ב&quot; רכישת המסך &quot;מודול המאפשר רכישת צלחת גם כל 96/384 עם מספר מסוים של תמונות בכל טוב. יתר על כן, &quot;נתוני מסך הסקירה&quot; מודול מאפשר (אני) לדמיין את תמונת הפסיפס של כל התפור היטב לכל ערוץ באותו הזמן על &quot;המפרסם&quot; גדול וכן (ii) לולאת אלגוריתם מיוחד למדידת העוצמות וב535 את 450 ערוצי ננומטר. למרות, שהצלחנו למדוד קרע vacuolar על ידי חיידקים בודדים באמצעות מיקרוסקופיה זמן לשגות, ברצוננו להזהיר כי הפעילות האנזימטית על פני השטח של חיידקים בודדים משתנה טיוח זה קשה בדיוק לתאם מספר החיידקים והיעילות של vacuolar תאיים קרע. בהתחשב בחוסן של assay, זה מתאים לשעותתפוקת igh מתקרבת ב96 או 384 פורמטים כן. יש לנו גם להתאים בהצלחה בפרוטוקול זה לניתוח FACS ללמוד את הזיהום של תאים בתרחיף 16. Assay יכול לשמש גם לחקירה של חיידקים או לנושאים אחרים המציגים lactamase על פני השטח שלהם, מה שמוביל למגוון רחב של יישומים. לדוגמה, ניתן להשתמש בגישה זו כדי ללמוד קרע vacuolar הנגרם על ידי פתוגנים אחרים כגון β-lactamase להביע Legionella pneumophila, חיידקי ליסטריה או סלמונלה typhimurium 12. מאז יש לו חיידקי ליסטריה מחזור זיהום קצר להשוות Shigella flexneri, ניסויי זמן לשגות הם אפשרי. בניגוד לכך, כי Legionella pneumophila ומחזורים ארוכי זיהום סלמונלה typhimurium תצוגה, אנו ממליצים לבצע ניסויי נקודת סיום. מגוון רחב של יישומים אפשריים הופך את assay CCF4-AM/β-lactamaseשיטת fluorometric מעניינת למעקב קרע vacuolar הנגרם על ידי פתוגנים תאיים בדגימות קבועות או בזמן אמת.

חיידקים פתוגנים רב הם הפנימו בתאי קרום של תאים סגורים אוקריוטים במהלך קורס זיהום שלהם. כניסה לתא מתרחש גם דרך phagocytosis ידי תאי מארח מיוחדים, כמו במקרה של שחפת Mycobacterium שהם מעובדים על ידי מקרופאגים, או גורמי המחלה באופן פעיל לגרום לספיגה שלהם לתוך בדרך כלל תאים שאינם phagocytic. במקרה של ספיגה הנגרמת, למשל לShigella flexneri, הפתוגן מזריק חלבונים למפעיל המארח שcytosol לחטוף בין פונקציות תאים אחרות מכונות מיון endomembrane מוסדרות היטב וכתוצאה מכך לוקליזציה חיידקים בתוך תא 1,2 endosomal. כתוצאה מכך, Shigella משבש את הקרום מצרף מוביל לקרע vacuolar והגישה cytosolic של הפתוגן מפריע לסחר קרום מארח ומשלוח הימנעות ליזוזום. לאחרונה, קרע phagolysosomal נמצא גם כstr זיהוםategy בשימוש על ידי Mycobacterium tuberculosis, הפתוגן שחשב במשך זמן רב שיש באופן בלעדי מקומי בתוך תא קרום הנכנס 3,17. כדי לחקור את הדינמיקה של סחר קרום subcellular של פתוגנים פולשים, שיפורים גדולים הושגו מאז מיקרוסקופ האלקטרונים ההילוכים (TEM) מבוסס מחקרים של שנתי ה -1980 המאוחרות 4,5. לדוגמה, בשיטות המבוססות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות צבעים, נוגדנים נגד מרכיבי משטח חיידקים, או סמנים לשיתוף לוקליזציה עם תאי subcellular השתלטו על 6,7. עם זאת, הם עדיין לא יניבו רזולוציה spatiotemporal מדויקת וחוסן למדוד קרע vacuolar על ידי חיידקים פתוגנים כמותית. המשוכה הזאת כבר התייחסה עם assay המבוסס על כתב צפלוספורין נגזר CCF4-AM סריג ששמש לראשונה ללמוד ביטוי גנים 8. ואז, זה היה בשימוש בהקשר של infהביולוגיה ection לחקור הפרשת מפעיל ולעקוב אחרי הספיגה של Neisseria לתוך תאי מארח 9,10,11. פיתחנו assay ניצול של הכתב הזה ללימוד קרע vacuolar הנגרם על ידי Shigella 12 flexneri וMycobacterium tuberculosis 17. העיקרון של שיטתנו מתואר באיור 1 באמצעות Shigella flexneri. ראשית, תאי מארח נטענים עם מצע סריג CCF4-AM כי הוא לכוד בתוך הציטופלסמה לאחר ביקוע את moieties אסתר AM. לאחר מכן, תאים נגועים בShigella flexneri. הווה β-lactamase על פני השטח של החיידקים הוא מסוגל לבקע את מצע CCF4 הקדם קרע vacuolar מתרחש. זה מוביל לאובדן של סריג אות מיתוג שיא הפליטה מ535 ננומטר ל -450 ננומטר על עירור של החללית ב 405 ננומטר. מדידת ratiometric של 450/535 ננומטר העוצמות מדגישה יושרת vacuolar: יחסים נמוכים משקפים קרום-enחיידקים סגורים או תאיים ואילו יחס גבוה משקפים קשר בין החיידקים וcytosol המארח. כמו כן, אנו מדווחים על התאמה של שיטה זו ללימוד קרע phagosomal הנגרם על ידי Mycobacterium tuberculosis במקרופאגים-THP 1. העקרונות הניסיוניים יישארו זהים למרות שההסדר מתהפך, וטוען CCF4-AM מתבצע רק לאחר זיהום חיידקים. לכן, על ידי מדידות הקרינה ratiometric כמותיים ברמת התא הבודד, קרע vacuolar של Shigella flexneri ניתן לעקוב בזמן אמת ובדגימות קבועות מסוגי תאים שונים 12,13,14. יתר על כן, בשיטה זו ניתן להתאים למספר פתוגנים פולשניות אחרים, כפי שמוצג במחקר זה באמצעות Mycobacterium בוביס ושחפת Mycobacterium. לבסוף, המזעור של הפרוטוקול שלנו ל96 גם (או 384 גם) פורמטים מאפשר הקרנה של מספר רב של תנאים בתפוקה גבוהה.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K1089</td>
			<td>Protect from light, stock in - 80 &deg; aliquots</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Draq5</td>
			<td>Biostatus</td>
			<td>DR50050</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&mu;CLEAR-PLATE, BLACK, 96 well </td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655090</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8761</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&beta;-lactamase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0389</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens

Shigella flexneri הם חיידקים פתוגניים כי לפלוש לתוך תאי מארח נכנסים vacuole endocytic. לאחר מכן, הקרע של קרום תא מוקף זה מאפשר לחיידקים לנוע בתוך cytosol, להתרבות ועוד לפלוש לתאים שכנים. Mycobacterium tuberculosis הוא phagocytosed על ידי תאי מערכת חיסון, ולאחרונה הוכח קרום phagosomal קרע במקרופאגים. פיתחנו assay חזק למעקב אחר שיבוש קרום phagosomal לאחר כניסת תא המארחת של Shigella flexneri או Mycobacterium tuberculosis. הגישה עושה שימוש CCF4, סריג כתב רגיש לβ-lactamase שequilibrates בcytosol של תאי מארח. עם הפלישה של תאי מארח על ידי חיידקים פתוגנים, החללית נשארת שלמה כל עוד החיידקים מתגוררים בתאי קרום סגורים. לאחר שיבוש פעילות vacuole, β-lactamase על פני השטח של הפתוגן דבק תאיים CCF4 באופן מיידי להובילing להפסד של סריג אות ומיתוג ספקטרום הפליטה שלה. assay ratiometric חזק זה מניב מידע מדויק על העיתוי של קרע vacuolar הנגרם על ידי החיידקים הפולשים, וזה יכול להיות בשילוב למיקרוסקופיה האוטומטית ועיבוד תמונה על ידי אלגוריתמים מיוחדים לזיהוי של את אותות הפליטה של ​​סריג תורם acceptor. יתר על כן, היא מאפשרת לחקור את הדינמיקה של שיבוש vacuolar שהושרו על ידי חיידקים תאיים בזמן אמת בתאים בודדים. לבסוף, הוא מתאים באופן מושלם לניתוח תפוקה גבוהה עם רזולוציה מרחב ובזמן העולה על שיטות קודמות. כאן, אנו מספקים את הפרטים הניסיוניים של פרוטוקולים למופת עבור assay קרע vacuolar CCF4 על תאי הלה ומקרופגים THP-1 לניסויי זמן לשגות או ניסויי נקודות קצה באמצעות Shigella flexneri כמו גם זנים רבים mycobacterial כגון Mycobacterium marinum, Mycobacterium בוביס, ושחפת Mycobacterium.

גישת CCF4-AM/β-lactamase היא שיטה חזקה ורגישה למעקב קרע vacuolar של פתוגנים תאיים כגון Shigella flexneri (איור 1). זני Shigella המשמשים במחקר זה מכונים M90T AfaI וBS176 AfaI. M90T AfaI הוא זן flexneri Shigella המבטא את AfaE adhesin, שהוא מסוגל להיקשר ביעילות CD55 על פני השטח של תאי האפיתל 15. זנים המבטאים לכן AfaE להציג יכולות גבוהות בהרבה בהשוואה פלישה לזן פראי סוג M90T בתאי האפיתל. BS176 AfaI הוא AfaE להביע מוטציה זן flexneri Shigella נטול ארסיות Shigella פלסמיד. זן זה אינו יכול לפלוש לתאי הלה. עם זאת זן זה הוא מסוגל להיכנס לתאים-1 THP מאז ספיגה בקו תא זה לסמוך רק על phagocytosis הקלסית ואינה דורשת מערכת מסוג 3 הפרשה פונקציונלית. שני הזנים להביע β-lactamase, ופעילות β-lactamase תצוגה על פני השטח שלהם בשל הנוכחות של קידוד AfaE פלסמיד. על זיהום תא הלה עם זן AfaI BS176 לא פולשנית עבור שעה 1, CCF4 סריג החללית נותרה בשלמותה, כפי שמוצג באיור 2 א על ידי האות הירוקה (535 ננומטר). להיפך, הזיהום בזן AfaI M90T הארסי עבור שעה 1 מוביל למתג של אות לכיוון כחול (450 ננומטר) המדגיש את המחשוף של החללית בcytosol. על מנת לכמת את זה, פיתחנו תסריט לתוכנת Metamorph וAcapella המאפשרת זיהוי אוטומטי של תאים ומדידה של עוצמות וב535 450 ערוצי ננומטר לקביעת אות ratiometric. כפי שמוצגים באיור 2, הגרעינים וcytosol של תאים מפולחים באמצעות ערוץ Draq5. לאחר מכן, האלגוריתם מסוגל לזהות את 450 ננומטר ואוכלוסיות התאים החיוביים 535 ננומטר לחישוב היחס בין שתי העוצמות לכל אחד מתאי אדם שהואמיוצג כההיסטוגרמה באיור 2 ג. יחסים נמוכים מתקבלים לזן מוטנטי לעומת יחס גבוה לזן האלים. בעוד ניסוי זיהום נציג זה נרכש באמצעות מיקרוסקופ confocal, מיקרוסקופיה epifluorescence מתאימים גם למשימה זו איורים 3 ו -4 דוגמאות הצג שימוש 2 סוגי תאים אנושיים שונים:. תאי אפיתל הלה וTHP-1 תאים דמויי מקרופאג. עם ההידבקות בזן האלים M90T AfaI Shigella עבור שעה 1 ו 90 דקות להלה ותאי THP-1, מתג של אות מירוקה (535 ננומטר) לכחול (450 ננומטר) הוא ציין בהשוואה לתאים נגועים BS176 AfaI (3A דמויות ו4 א). התסריט שפיתחנו על תוכנת MetaMorph מזהה ישירות האוכלוסייה החיובית CCF4 של תאים ולחשב את היחס בין העוצמות וב450 535 ערוצי ננומטר עבור כל אדם תאים. לאחר מכן תאים מסווגים כפונקציה של היחס שלהם באמצעות develo מאקרוPED ב-Excel, ובכך מניב היסטוגרמות מראות את חלוקת התא. כפי שהיה במקרה של התסריט האחר שפותח עבור Acapella, BS176 תאים נגועים AfaI מאופיינים ביחסים נמוכים, ואילו תאים נגועים M90T AfaI להציג יחס גבוה באמצעות אלגוריתם MetaMorph על תאי הלה ומקרופגים THP-1 (איורים 3 ב ו 4 ב) . לבסוף, התאמה של שיטה זו לחקר mycobacteria מוצגת באיור 5. Mycobacterium בוביס BCG מתגורר בphagosome לקורס כולו של הניסוי, כפי שבאו לידי ביטוי על ידי אות ננומטר 535 החזקה זוהתה לאורך כל מהלך הזמן של הניסוי. לעומת זאת, Mycobacterium tuberculosis מעורר קרע קרום phagosomal במקרופאגים-1 THP לאחר יותר מ -3 ימים של זיהום כמודגש על ידי אות 450 ננומטר ב -7 ימים של זיהום (איור 5 א ו5B). באמצעות אותו האלגוריתם ללימוד כקרע vacuolar ידי Shigella </em&gt;, מצאנו כי תאים נגועים שחפת Mycobacterium להציג יחסי ננומטר 450/535 גבוהים יותר מאשר Mycobacterium בוביס BCG לאחר 7 ימים של זיהום (איורים 5 ג ו5D). <img alt="איור 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig1.jpg" /> איור 1. תכנית המייצגת את העיקרון של assay CCF4-AM/β-lactamase למעקב קרע Shigella flexneri vacuolar. CCF4-AM מפזרת בחופשיות דרך קרום הפלזמה לתוך הציטופלסמה שבי moieties אסתר הם ביקע את ידי esterases cytosolic ייצור CCF4 אניוני. תגובה זו מונעת CCF4 מלהיכנס כל קרום תא משובץ. בשלב זה, CCF4 מעורר סריג ב 535 ננומטר על עירור ב 405 ננומטר. החללית נשארת שלמה עד חיידקים המבטאים β-lactamase rupturדואר vacuole endocytic. בשלב זה, סריג האות הולך לאיבוד בגלל CCF4 הוא ביקע ידי β-lactamase מפעילה מתג בפליטה מ535 ננומטר ל -450 ננומטר על עירור ב 405 ננומטר. <img alt="איור 2" fo:content-width="2.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig2.jpg" /> איור 2. מעקב קרע vacuolar flexneri Shigella באמצעות מיקרוסקופיה confocal. () לאחר 30 שעות 2 דקות של טעינת CCF4-AM, תא הלה נגוע β-lactamase זן מבטא Shigella flexneri BS176 AfaI המוטציה או זן האלים M90T AfaI עבור שעה 1 וקבועה באמצעות paraformaldehyde 4% למשך 10 דקות. ואז, גרעיני מגואלות Draq5 ותאים הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ confocal עם מטרת 10x. תמונות נציג נבחרו עם הערוצים הממוזגים הבאים: CCF4 החללית השלמה מופיעה ב535 ננומטר (Green), CCF4 הבדיקה ביקע מופיעה ב450 ננומטר (כחול). (ב &#39;) דוגמאות לתמונות המדגישות את מערכת זיהוי האוטומטי של האלגוריתם שלנו על תוכנת Acapella. פילוח של התאים (גרעינים + cytosol) מתקבל באמצעות ערוץ Draq5. CCF4 תאים חיוביים מתקבלים באמצעות 450 ו535 ערוצי ננומטר אספו יחד. (ג) היסטוגרמה המראה את התוצאה של הניתוח האוטומטי שלנו על Acapella באמצעות Shigella flexneri BS176 AfaI מוטציה זן או זן אלים M90T AfaI. היחס הממוצע מייצג את היחס בין עוצמת וב450 535 ערוצי ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50116/50116fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig3.jpg" /> איור 3. מעקב Shigella fleקרע xneri vacuolar בתאי הלה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. () לאחר 30 שעות 2 דקות של טעינת CCF4-AM, תאים הלה נגועים בβ-lactamase זן מבטא Shigella flexneri BS176 AfaI המוטציה או זן האלים M90T AfaI במשך שעה ו1 קבוע באמצעות paraformaldehyde 4% למשך 10 דקות. לאחר מכן, תאים הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence עם מטרת 20x. תמונות מייצגות נבחרו בערוצים הבאים:. בדיקה שלמות CCF4 535 ננומטר (ירוק) וCCF4 ננומטר 450 הבדיקה בקע (כחול) (ב) היסטוגרמה המייצגת את התוצאה של הניתוח האוטומטי שלנו על תוכנת MetaMorph. התאים הבודדים מופצים בפונקציה של היחס בין העוצמות וב450 535 ננומטר הערוצים שלהם. <img alt="איור 4" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig4.jpg" /> &gt; איור 4. מעקב קרע Shigella flexneri vacuolar בתאי THP-1 באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. () לאחר 30 שעות 2 דקות של CCF4-AM טוען, THP-1 תאים נגועים β-lactamase זן מבטא Shigella flexneri BS176 AfaI המוטציה או AfaI M90T זן אלים דקות 1 שעות 30 וקבועות באמצעות paraformaldehyde 4% למשך 10 דקות. לאחר מכן, תאים הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence עם מטרת 20x. תמונות מייצגות נבחרו בערוצים הבאים:. בדיקה שלמות CCF4 535 ננומטר (ירוק) וCCF4 ננומטר 450 הבדיקה בקע (כחול) (ב) היסטוגרמה המייצגת את התוצאה של הניתוח האוטומטי שלנו באמצעות תוכנת MetaMorph. התאים הבודדים מופצים בפונקציה של היחס בין העוצמות וב450 535 ננומטר הערוצים שלהם. ghres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50116/50116fig5.jpg &quot;/&gt; איור 5. מעקב Mycobacterium בוביס BCG וקרע phagosomal Mycobacterium tuberculosis במקרופאגים THP-1 באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. (A, B) THP-1 תאים נגועים β-lactamase להביע Mycobacterium בוביס BCG או Mycobacterium tuberculosis במשך שעה 2 ותרבית במשך 3 עד 7 ימים . לאחר כביסה, תאים נטענים עם CCF-4-AM עבור שעה 2 וקבוע באמצעות paraformaldehyde 4% למשך 30 דקות לפני ההדמיה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence עם מטרת 40X. תמונות מייצגות נבחרו בערוצים הבאים: שלם CCF4 הבדיקה, 535 ננומטר (ירוק); CCF4 ביקע, ננומטר הבדיקה 450 (כחול) (C, D) Histograms מציג את התוצאה של הניתוח האוטומטי שלנו באמצעות תוכנת MetaMorph.. תאים בודדים מופצים כפונקציה של היחס בין עוצמת וב450 535 ערוצי ננומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens at JoVE.com

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

אנו מתארים שיטה למעקב אחר קרע endomembrane שהושרו על ידי החיידקים תוך תאיים<em&gt; Shigella flexneri<em&gt;</em</em&gt; ו<em<em&gt;<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt;</em</em&gt; על פלישת תא מארחת. assay שלנו עושה שימוש בCCF4, מארח cytoplasmic סריג בדיקה בתאים חיים או קבועים. הכתב הזה הוא מושפל על ידי הווה פעילות אנזים על פני החיידקים.

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

single-cell-measurements-vacuolar-rupture-caused-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K Views.  Institut Pasteur, Paris, France. אנו מתארים שיטה למעקב אחר קרע endomembrane שהושרו על ידי החיידקים תוך תאיים Shigella flexneri

Video: Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an effective invasin for human epithelial and endothelial cells. We have identified endothelial surface-located integrins as major receptors for Opc, a process which requires Opc to first bind to integrin ligands such as vitronectin and via these to the cell-expressed receptors1. This process leads to bacterial invasion of endothelial cells2. More recently, we observed an interaction of Opc with a 100kDa protein found in whole cell lysates of human cells3. We initially observed this interaction when host cell proteins separated by electrophoresis and blotted on to nitrocellulose were overlaid with Opc-expressing Nm. The interaction was direct and did not involve intermediate molecules. By mass spectrometry, we established the identity of the protein as &alpha;-actinin. As no surface expressed &alpha;-actinin was found on any of the eight cell lines examined, and as Opc interactions with endothelial cells in the presence of serum lead to bacterial entry into the target cells, we examined the possibility of the two proteins interacting intracellularly. For this, cultured human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) were infected with Opc-expressing Nm for extended periods and the locations of internalised bacteria and &alpha;-actinin were examined by confocal microscopy. We observed time-dependent increase in colocalisation of Nm with the cytoskeletal protein, which was considerable after an eight hour period of bacterial internalisation. In addition, the use of quantitative imaging software enabled us to obtain a relative measure of the colocalisation of Nm with &alpha;-actinin and other cytoskeletal proteins. Here we present a protocol for visualisation and quantification of the colocalisation of the bacterium with intracellular proteins after bacterial entry into human endothelial cells, although the procedure is also applicable to human epithelial cells.

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &amp;#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), a gram negative human-specific respiratory pathogen, can bind to human &alpha;-actinin. Here we present a protocol for visualisation of colocalisation of the bacterium with intracellular &alpha;-actinin after bacterial entry into human brain microvascular endothelial cells (HBMECs).

Visualisation וכימות של אינטראקציות תאיים של Neisseria meningitidis ואת האדם α-actinin על ידי הדמיה confocal

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

גילוי של פתוגנים תאיים חדשים על ידי Amoebal Coculture וגישות Amoebal העשרה

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

יישום של פלורסנט חלקיקים לחקר שיפוץ של מערכת Endo-lysosomal על ידי חיידקים תאיים

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

שינוי Biolistic של פלורסנט Tagged Gene לOpportunistic פטרייתיים פתוגן<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

כימות של Cytosolic לעומת vacuolar<em&gt; סלמונלה</em&gt; ביסודי המקרופאגים על ידי דיפרנציאל permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג&#39;ין סידור MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...