Este trabajo apoyado en parte por el NIH virtud de la subvención R15 CA137499-01 (FB) y un fondo de inicio de la Universidad de Ohio (FB).

1. La disección de los fémures y tibias del ratón y el cultivo de células de médula ósea <ol><li> Sacrificio de dos ratones por asfixia de CO 2 y diseccionar cuidadosamente tibias y fémures sin cortar los extremos de los huesos. </li><li> Limpiar los huesos de todos los tejidos adheridos mediante el uso de papel de seda. Tenga cuidado de no romper los huesos. </li><li> Esterilizar los huesos por inmersión en etanol al 70% durante 10 minutos en un 35 mm placa de Petri. A partir de este momento, el trabajo dentro de una campana de bioseguridad para evitar la contaminación de los cultivos celulares. </li><li> Recuperar los huesos del etanol y dejar secar al aire durante 5 minutos en una placa de Petri en el interior del gabinete de bioseguridad. </li><li> Corte el fémur por la mitad, y la tibia por su extremo más delgado. Infundir el interior del hueso con 1 ml de medio RPMI (sin suero, pero con los antibióticos) con una jeringa estéril en una placa de Petri estéril. </li><li> La suspensión de células se recogieron y se lavaron 2 veces en medio RPMI por centrifugación de 10 minutos en un tubo de 15 ml, se centrifuga a 1.100 rpm en una centrífuga refrigerada (4 ° C) con un rotor basculante. </li><li> Después del último lavado, resuspender las células en 2 ml de solución amortiguadora de lisis ACK e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente con el fin de eliminar las células rojas de la sangre. </li><li> Añadir 13 ml de RPMI con 10% de SFB, resuspender y lavar 2 veces en este medio con la misma configuración que se describe en 1.6. </li><li> Recuento de células, se ajustan a 2 x 10 5 células / ml con RPMI 10% FBS, y añadir rm-GM-CSF (20 ng / ml concentración final) 5. </li><li> Agregar 10 ml de esta suspensión a una calidad de estéril, microbiológicos, 10 cm plato de Petri, y la cultura en una incubadora de CO 2 (37 ° C, 5% de CO 2). </li><li> Tres días después, añadir otro 10 ml de RPMI 10% FBS con 20 ng / l de rmgm-CSF a cada uno de los platos preparados. </li><li> Tres días después, 10 ml de suspensión celular se recuperan de cada placa de Petri, se centrifuga como en 1.6, se resuspendieron en el mismo volumen de RPMI 10% FBS con rmgm-CSF y regresó a la placa de Petri. Las células se cultivan durante 2 días más en la incubadora de CO 2. </li></ol> 2. Recogida y etiquetado de los países en desarrollo <ol><li> Después de 8 días en cultivo de células de baja adherencia son recuperados por lavado de las placas de Petri con medio fresco. Este protocolo hace alrededor de 4.2 x 10 8 países en desarrollo en nuestras manos. Las células pueden ser analizados para DC fenotipo por citometría de flujo. </li><li> Las células obtenidas son etiquetados con la Qtracker 655 Kit de etiquetado celular siguiendo estrictamente las instrucciones del fabricante. </li><li> Tenemos excelentes resultados etiquetado derivadas de médula ósea murina países en desarrollo con Qdots a una concentración de 10 nM. Para lograr esto, las alícuotas de los componentes Qtracker Celular Kit de etiquetado A y B se mezclan en volúmenes iguales, se incubaron 5 minutos a temperatura ambiente, e inmediatamente se diluye 1 / 100 en medio fresco con agitación durante 30 s. </li><li> Para la tinción de 5 x 10 6 países en desarrollo, mezcla de 5 l de cada componentes del equipo A y B en un tubo eppendorf y se incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añadir 1 ml de RPMI 10% FBS incubar, y agitar durante 30 segundos. </li><li> Añadir 0,5 ml de suspensión celular que contiene 5 x 10 6 países en desarrollo, y se incuba a 37 ° C durante 60 min. </li><li> A continuación, lavar las células 2 veces en RPMI 10% FBS (1100 RPM). Las células pueden ser resuspendidas en RPMI a la cultura más o en PBS para la inyección en ratones de experimentación. </li></ol> 3. Evaluación de la DC etiquetado <ol><li> Etiquetado de células pueden ser evaluados por medio de microscopía de fluorescencia. Para lograr esto, una gota de suspensión celular se añade a un portaobjetos de microscopio, cubierta con un cubreobjetos, y se evaluaron con un microscopio de fluorescencia teniendo en cuenta que estos Qdots tienen espectros de emisión y excitación de 565nm 525nm y 405, respectivamente (Fig. 3 ) </li><li> En este punto, las células marcadas se pueden utilizar para inyectar animales, o la maduración puede ser inducida mediante la incubación de estas células durante 48 h (37 ° C, 5 CO 2) en presencia de LPS (100 ng / ml) y TNF (- 20 ng / ml). Fluorescentes de etiquetado no se ve afectada por la maduración de DC (Fig. 4). </li></ol> 4. Los resultados representativos: Por la presente se describe cómo preparar derivadas de médula ósea murina países en desarrollo y cómo se les etiqueta con Qdots fluorescentes. Fig. 1 resume el procedimiento para obtener la célula, mientras que la figura. 2 describe el procedimiento para la etiqueta del Qdots. Como se muestra en la figura. 3, casi todas las células están marcadas por este procedimiento, y esto no se ve afectada por la maduración de DC con factores inflamatorios (Fig. 4). Fig. 5 muestra que Qdot manchada de países en desarrollo (Fig.5a) se comportan similares a los no-células teñidas cuando son tratados con un cóctel inflamatoria. Ambas preparaciones de células similar regular al alza la expresión de moléculas coestimuladoras (Fig. 5b), y producen cantidades similares de IL-6 (Fig. 5c) y el óxido nítrico (Fig. 5d) a los estímulos de maduración. Esto concuerda con PreviOU datos publicados indican que la tinción Qdot no afecta a la capacidad de las DC para convertirse en células maduras capaces de inducir respuestas inmunes [6]. Estas células se pueden utilizar para la inyección de los animales de experimentación. Como se muestra en la figura. 6, 2 días después de la inyección intravenosa de los países en desarrollo etiquetados en ratones, que fueron capaces de detectar Qdot células teñidas en el bazo. Esto también está de acuerdo con los anteriores datos publicados muestran el uso de nanocristales Qdot para evaluar la migración de la CD en vivo [6], de imagen no invasivas y citometría de flujo. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Diagrama de flujo de generación de DC de la médula ósea. Por la presente nos muestran el proceso para obtener médula ósea procedentes de DC. Ambas tibias y fémures, se disecan y limpieza del tejido circundante. Puntas de hueso y se conservan en el interior de los huesos se vuelcan con el medio. Después de la eliminación de las células rojas de la sangre, las células de la médula ósea se cultivan durante 8 días en presencia de GM-CSF para diferenciarse en los países en desarrollo. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Diagrama de flujo del procedimiento de etiquetado. Alícuotas iguales de los componentes Qtracker Celular Kit de etiquetado A y B se mezclan en un tubo eppendorf. Las células dendríticas se obtienen a partir de cultivos de 8 días de médula ósea con GM-CSF y se mezcla con el tinte de etiquetado para los 60 min a 37 º C. Luego se lavan las células en los medios de comunicación para eliminar el exceso de partículas de etiquetado. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Microfotografía fluorescente de los países en desarrollo inmediatamente después de etiquetado. Una gota de células marcadas se depositó en un portaobjetos de vidrio y cubierta por un cubre. Luego, las muestras fueron evaluadas en un microscopio de fluorescencia y las imágenes fueron adquiridas a través de una cámara de 5,0 Micropublisher Color Digital CCD (Qimaging, Surrey, BC Canadá). <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Microfotografía fluorescente de los países en desarrollo después de 48 h de maduración in vitro. Los países en desarrollo la etiqueta se cultivaron durante 48 h con LPS (100 ng / ml) y TNF-α (20 ng / ml) en placas de vidrio en una incubadora de CO 2 (37 ° C, 5% de CO 2). Luego, las muestras fueron lavadas con PBS (5 min, 2X), se fija con acetona (15 min, 4 ° C) y de contraste con DAPI. Las células fueron evaluadas en un microscopio de fluorescencia que el anterior. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. La actividad biológica de los países en desarrollo Qdot maduro manchado. Los países en desarrollo etiquetados madurados in vitro que el anterior fueron analizadas por citometría de flujo (A) y (B). (A) Qdot células teñidas dar una señal fuerte en el FL3 (PerCP) del canal. Sombra histograma: control sin mancha. (B) Los países en desarrollo Qdot-teñidas y sin teñir, además, se tiñeron con anticuerpos específicos frente a la maduración de los marcadores CD86 y CD40, y controles de isotipo. Las células fueron analizadas en un citómetro de flujo FACSort (Becton Dickinson, San Jose, CA). Además, IL-6 (C) y el óxido nítrico (NO) se determinó en los sobrenadantes de madurez Qdot manchada de países en desarrollo y los controles. Los niveles de IL-6 y el óxido nítrico se determinó mediante un análisis de ELISA y el ensayo de Griess como hemos descrito previamente 7, 8. Todos los datos que aparecen en esta figura es representativa de dos o tres experimentos independientes que muestran resultados similares. Los datos fueron analizados por ANOVA utilizando el software GraphPad. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Detección de los centros de datos etiquetados en los tejidos disecados. Etiquetados DC maduras (1x10 6 células) fueron inyectados por vía intravenosa en ratones C57BL / 6. (A) Dos días después los ratones fueron sacrificados y se colectaron los bazos, congelados snap, incrustado en octubre, y 8 secciones M preparada con un criostato. Luego, las muestras fueron fijadas con acetona (15 min, 4 ° C) y de contraste con DAPI. Las células fueron evaluadas en un microscopio de fluorescencia como por encima de la figura 6a:. Magnificación de 40X, la figura 6b: un aumento de 100X, fig. Ampliación 6C, 400X.

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Murino mieloide) países en desarrollo han sido ampliamente utilizados para determinar la eficacia y la mejora de la DC, vacunas, investigar DC: las interacciones de las células T o el desarrollo de DC, y determinar su papel en varias enfermedades 9-11. Por la presente se muestra cómo se generan los países en desarrollo a partir de precursores recuperado de médulas óseas de tibia y fémur. Recuperamos los huesos sin cortar las puntas, lo que nos para esterilizarlos por inmersión en etanol al 70%, reduciendo así la probabilidad de contaminación. Para diferenciar los países en desarrollo a partir de células de médula ósea y sólo la usamos GM-CSF como se describió anteriormente 5. Aunque algunos también utilizan protocolos de IL-4, se ha informado de que esta citocina no es necesario cuando se trabaja con altos niveles de GM-CSF 12. De hecho, hemos demostrado que estos países en desarrollo son capaces de inducir respuestas inmunes 13. También, el cuidado debe ser tomado para recuperar sólo las células de baja adherencia a partir de cultivos de 8 días a lavar los platos Petri con medio ya que las células adjuntas muestran un fenotipo más monocitos-like. Aquí se muestra el etiquetado de los países en desarrollo con partículas fluorescentes Qdot. Esta etiqueta tiene algunas ventajas respecto a otros métodos. En primer lugar, las partículas Qdots se incorporan fácilmente a las células. En segundo lugar, la señal fluorescente es muy alto y no se altera por la maduración de las DC. En tercer lugar, la fluorescencia no se pierde cuando las células o los tejidos se fijan con solventes como la acetona, contrariamente a lo que sucede si GFP se utiliza para etiquetar los países en desarrollo 14, dando una mayor flexibilidad en el momento de elegir los protocolos de tinción. Finalmente, la señal fluorescente de alta dada por estas partículas permite la visualización de las células de los tejidos a pesar de autofluorescencia. Como se describió anteriormente 6, tinción Qdot no afectó la capacidad de maduración de estas células. Por la presente nos muestran que Qdot manchado de los países en desarrollo se comportan de forma similar a como no manchada de países en desarrollo, upregulating moléculas estimuladoras, y la producción de IL-6 y el óxido nítrico en respuesta a estímulos inflamatorios. Aunque los países en desarrollo son células especializadas en el desencadenamiento de la respuesta inmune, se ha demostrado para participar en procesos patológicos como el cáncer y la aterosclerosis 4, 15, 16. Han sido también afirmó que participar en el proceso angiogénico 17, 18, ​​incluso sugirió que estructuralmente que participan en el desarrollo de nuevos buques 19, 20. Por lo tanto, los métodos que permiten el seguimiento de DC en vivo, y la determinación de su localización geográfica en diferentes tejidos 4, 21, 22 son muy valiosos.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Ratones C57BL / 6 </td><td> Jackson laboratorios </td><td></td><td> Las hembras, 6-8 semanas de edad </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-119 </td><td></td></tr><tr><td> Suero bovino fetal, calificado </td><td> Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-096 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10010-049 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer de lisis ACK </td><td> Lonza Walkersville, Inc </td><td> 10-548E </td><td></td></tr><tr><td> Recombinante murino GM-CSF </td><td> PeproTech Inc </td><td> 315-03 </td><td></td></tr><tr><td> Qtracker 655 Celular Kit de etiquetado </td><td> Invitrogen </td><td> Q25021MP </td><td></td></tr><tr><td> Lipopolisacárido </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-eblps </td><td></td></tr><tr><td> Recombinante murino TNF alfa </td><td> Peprotech </td><td> 315-01A </td><td></td></tr><tr><td> CD86 de anticuerpos </td><td> BD Biosciences </td><td> 553691 </td><td></td></tr><tr><td> CD40 de anticuerpos </td><td> BD Biosciences </td><td> 553791 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema reactivo de Griess </td><td> Promega </td><td> G2930 </td><td></td></tr><tr><td> IL-6 de captura de anticuerpo </td><td> eBioscience </td><td> 13-7061-81 </td><td></td></tr><tr><td> IL-6 la detección de anticuerpos </td><td> eBioscience </td><td> 13-7062-81 </td><td></td></tr></tbody></table>

generation and labeling of murine bone marrow-derived dendritic cells with qdot nanocrystals for tracking studies

Las células dendríticas (DC) son células profesionales presentadoras de antígeno (CPA) que se encuentran en los tejidos periféricos y en los órganos inmunológicos, tales como el timo, la médula ósea, el bazo, los ganglios linfáticos y las placas de Peyer 1-3. Los países en desarrollo presentes en la muestra de los tejidos periféricos del organismo por la presencia de antígenos, que ocupan, procesar y presentar en su superficie en el contexto de las moléculas de histocompatibilidad (MHC). Entonces, cargado de antígenos DC migrar a los órganos inmunológicos en los que presentan el antígeno procesado a los linfocitos T desencadenar una respuesta inmunitaria específica. Una forma de evaluar las capacidades migratorias de los países en desarrollo se les etiqueta con tintes fluorescentes 4. Por la presente nos demuestran el uso de Qdot nanocristales fluorescentes para etiquetar derivadas de médula ósea murina DC. La ventaja de este etiquetado es que Qdot nanocristales poseen fluorescencia duradera estable y de largo que los hacen ideales para la detección de células marcadas en los tejidos recuperados. Para lograr esto, las primeras células se recuperará de médulas óseas murina y se cultivaron durante 8 días en la presencia de colonias de granulocitos macrófagos factor estimulante con el fin de inducir la diferenciación de DC. Estas células se denominan entonces con Qdots fluorescentes de corta incubación in vitro. Células teñidas pueden ser visualizados con un microscopio fluorescente. Las células se pueden inyectar en animales de experimentación, en este momento o puede convertirse en células maduras en la incubación in vitro con estímulos inflamatorios. En nuestras manos, la maduración de DC no determinó la pérdida de la señal fluorescente ni manchas Qdot afectar a las propiedades biológicas de los países en desarrollo. Tras la inyección, estas células se pueden identificar en los órganos inmunes por microscopía de fluorescencia después de la disección típica y los procedimientos de fijación.

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Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendríticas las células de captación de antígenos y migran hacia los órganos inmunes para presentar antígenos procesados ​​a los linfocitos T. Qdot nanocristales etiquetado proporciona una señal fluorescente de larga duración y estables. Esto permite el seguimiento de las células dendríticas a los diferentes órganos por microscopía de fluorescencia.

Generación y Etiquetado de murino médula ósea procedentes de células dendríticas con nanocristales Qdot de Estudios de seguimiento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

generation-labeling-murine-bone-marrow-derived-dendritic-cells-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

24.7K vistas.  Ohio University. Dendríticas las células de captación de antígenos y migran hacia los órganos inmunes para presentar antígenos procesados ​​a los linfocitos T. Qdot nanocristales etiquetado proporciona una señal fluorescente de larga duración y estables. Esto permite el seguimiento de las células dendríticas a los diferentes órganos por microscopía de fluorescencia.

Video: Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Investigación de la polarización de macrófagos utilizando la médula ósea macrófagos derivados

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Investigación

Inmunología e Infección

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Médula ósea derivada de macrófagos Producción

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

Generación de inmaduras, maduras y tolerogénico células dendríticas con diferentes fenotipos metabólico

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

An &lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Mouse Model to Measure Na&amp;#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Un modelo de ratón In Vivo a medida ingenuo CD4 células T activación, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por las células dendríticas derivadas de la médula ósea

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...