Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (AR-49419, DD), Asociación de Distrofia Muscular (DD) y NIH subsidio de capacitación T90DK70105 (CH).

1. Evaluación de las propiedades contráctiles y pasiva del músculo vivo Ex EDL Las propiedades contráctiles y pasiva del músculo EDL se miden ex vivo usando el científico Aurora sistema in vitro prueba muscular. Consulte la Tabla 1 para los materiales y equipos. 1.1 Equipo de preparación <ol><li> Montar el baño de tejidos de órganos, garantizando la oxytube al baño de agua en los tejidos-chaqueta. Coloque la bañera montada en el aparato músculo montaje. Conecte la línea de gas a la oxytube. Fije las tuberías de circulación de agua para el baño de tejido camisa de agua y coloque la válvula de aguja en el drenaje del baño. </li><li> Encender el baño de agua circulante y ajustar la temperatura a 30 ° C 7. Permitir 5 PSI (libras por pulgada cuadrada) de 95% de O 2 -5% de CO 2 a fluir a través de la oxytube. Llenar el baño con tampón de Ringer. Equilibrar el tampón durante al menos10 min con un flujo de gas constante mediante el ajuste de la válvula de oxytube. </li><li> Encienda los instrumentos (estimulador de doble modo de sistema de palanca, y la interfaz de la señal). Cargar el control dinámico del músculo (DMC) de software de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol> 1,2 disección del músculo EDL Todos los estudios con animales deben ser aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión. <ol><li> Se anestesia el ratón con inyección intraperitoneal de 2,5 l / g de peso corporal del cóctel anestésico (consulte la sección de materiales). Durante todo el procedimiento quirúrgico, la profundidad de la sedación se controlan realizando una pizca dedo del pie. Un suplemento de 10% de la dosis inicial de anestésico se administra cuando sea necesario para mantener al animal bajo anestesia. Shave la extremidad posterior. Mantener la temperatura central del cuerpo a 37 º C antes de su procedimiento de disección colocando el ratón en una almohadilla de calefacción. La temperatura del cuerpo se controla midiendo constantemente la temperat rectalure utilizando una sonda térmica. </li><li> Coloque el ratón en decúbito supino en el tablero de disección (Figura 1). Despegar la piel de las patas para exponer los músculos de las extremidades traseras. Asegure la pata en el bloque sylgard usando dos pernos modista, una en el pie y el otro en el músculo gracilis. Coloque una lámpara de calor por encima del cuerpo del ratón para mantener la temperatura corporal a 37 º C. Constantemente superfuse todos los músculos expuestos con tampón de Ringer. Escurrir el exceso de tampón a través de una línea de vacío. </li><li> Exponer el tendón distal TA y el ligamento extensor bajo un estereomicroscopio por la disección de la piel hacia el pie. Retire con cuidado la fascia que recubre el músculo TA. Cortar el ligamento extensor para liberar el tendón distal TA. </li><li> Cortar el tendón distal TA y lo utilizan para pelar el músculo TA. Retire con cuidado el músculo TA en su inserción proximal. Colocar una fina pieza de algodón empapado en tampón de Ringer cerca del músculo EDL para absorber el sangrado causado por la ruptura de la vasculatura del músculo TA. Utilice la línea de vacío para eliminar el exceso de tampón y la sangre. </li><li> Atar un nudos dobles cuadrados seguido por un nudo de bucle usando una sutura de seda de pan en la unión del tendón del músculo (MTJ) de los músculos EDL distal (Figura 2). Hacer una incisión en la porción distal del músculo bíceps femoral para exponer el músculo EDL proximal. Repetir el mismo conjunto de nudos (figura 2) en la MTJ del tendón EDL proximal. Fije el gancho del brazo palanca a la proximal o distal de los nudos con un doble nudo cuadrado con la línea de sutura mismo. Cortar la línea de sutura que queda. </li><li> Cortar el tendón proximal EDL superior al nudo de sutura proximal. Levante el músculo EDL con el anzuelo y cortar los vasos debajo del músculo. Cortar el tendón distal EDL inferior al nudo de sutura distal para eliminar el músculo EDL de las extremidades posteriores. Cubra la extremidad posterior expuesto con un trozo de algodón empapado en tampón de Ringer. </li><li> Fije el gancho para el brazo de palanca. Alinear verticalmente el músculoentre dos electrodos. Asegure la línea de sutura distal al puesto fijo. Levante la bañera para sumergirse tejido del músculo en tampón de Ringer. Ajustar la tensión de reposo de 1,0 g usando el doble grueso / fino etapa de traducción y permitir que el músculo que se equilibre durante al menos 10 min. </li></ol> 1.3 Medición de las propiedades contráctiles y pasiva del músculo EDL Utilice la Tabla 2 para establecer los parámetros en el software de DMC para cada una de las mediciones siguientes. Analizar los datos mediante el análisis muscular dinámico (DMA) de software. 1.3.1 Medición de las propiedades contráctiles del músculo EDL <ol><li> Estimular el músculo EDL tres veces a 150 Hz con 60 seg aparte para estabilizar el músculo 8. </li><li> Estimular el músculo EDL a diferentes tensiones en reposo para determinar la longitud óptima (Lo). La longitud óptima es la longitud en la que el músculo desarrolla tensión de contracción máxima. Permitir que el músculo serelajarse durante 2 min. </li><li> Ajuste la tensión de reposo a Lo. Medir la fuerza muscular a la estimulación twitch único. Determinar la fuerza de contracción absoluta (Pt), tiempo de pico de tensión (TPT) y el tiempo de relajación medio (½ RT) del PT. Deje que el músculo se relaje durante 2 min. </li><li> Ajuste la tensión de reposo a Lo. Medir la fuerza muscular tetánica generado a diferentes frecuencias de estimulación (50, 80, 100, 120, 150 y Hz 200). Determinar la fuerza máxima absoluta muscular tetánica (Po) donde la fuerza muscular alcanza el máximo. Mida la TPT y ½ RT del Po 9. </li><li> Deje que el músculo se relaje durante 5 min. Ajuste la tensión de reposo a Lo. Aplicar 10 ciclos de contracciones excéntricas con descanso de 2 minutos entre los ciclos. Calcular la pérdida de la fuerza relativa de la Po después de cada ciclo de contracción excéntrica. </li><li> Separar el músculo EDL del aparato y se cortan los tendones en el lugar de la sutura. Determinar el peso del músculo húmedo y calcular el área transversal del músculo transversal (CSA)6,10. </li></ol> 1.3.2 Medición de las propiedades pasivas del músculo EDL <ol><li> Disección del músculo EDL contralateral y adjuntarlo al aparato como se describe en la Sección 1.2, los pasos 2 a 7. </li><li> Asunto del músculo EDL a un protocolo de seis pasos de estiramiento en el que se tensa el músculo a 160 Mín% con un incremento de 10% Mín. Analizar el 6 perfil de tensión-deformación. </li><li> Evaluar la propiedad viscosa del músculo EDL mediante la medición de la tasa de relajación de la tensión (SRR) en los siguientes periodos de tiempo después del estiramiento y manteniendo el músculo a 10% Min.: desde el pico a 0,1 s después del pico (pp), de 0,1 a 0,2 s pp, de 0,2 a 0,5 s pp, de 0,5 a 1 s pp y de 1 a 1,5 s pp </li><li> Al final del estudio, la eutanasia a los ratones por dislocación cervical y / o decapitación mientras que el ratón está todavía bajo anestesia. Separar el músculo EDL del aparato y se cortan los tendones en el lugar de la sutura. Determinar el peso del músculo húmedo y calcular el músculo transversal síctional área (CSA) 6, 10. </li></ol> 2. Evaluación de las propiedades contráctiles del músculo TA In situ Las propiedades contráctiles del músculo TA se midió utilizando el científico Aurora en el sistema de prueba in situ muscular. Consulte la Tabla 1 para los materiales y equipos. 2.1 Equipo de preparación <ol><li> Calentar la etapa animal termo controlada a 37 ° C usando el baño de agua circulante. </li><li> Encienda los instrumentos (estimulador de doble modo de sistema de palanca, y la interfaz de la señal). Cargar el software de DMC según las instrucciones del fabricante. </li></ol> 2,2 Preparación del músculo TA para la medición de fuerza en situ <ol><li> Se anestesia el ratón, afeitarse la extremidad posterior y exponer el músculo TA, como se describe en los pasos 1 a 3 en la sección 1.2. </li><li> Haga un nudo doble cuadrado alrededor de la rótula usi ligamentong un pan de sutura de seda. Un nudo doble cuadrado seguido por un nudo del lazo en el MTJ del músculo TA distal (Figura 2), atar otro nudo cuadrado doble dejando un bucle ~ 10 mm desde el nudo TA tendón distal usando la misma línea de sutura. Coloque el segundo nudo doble cuadrado en el lado del bucle. </li><li> Retire los pasadores de la extremidad posterior y coloque el animal en decúbito prono. Exponer el músculo bíceps femoral. Hacer una incisión en la línea media para revelar el nervio ciático. Haga un nudo doble cuadrado alrededor del extremo proximal del nervio ciático. Recorte un lado de las líneas de sutura y cortar el nervio superior al nudo. Con cuidado, tire del nervio ciático hacia la rodilla mediante la línea de sutura y limpiar el tejido conectivo que rodea a la libre ~ 5 mm de su longitud. No estirar el nervio durante este procedimiento y constantemente superfuse el nervio con tampón de timbre. </li><li> Preparar el músculo TA contralateral como se describe en los pasos 1 a 3. Cubra uno de la extremidad trasera expuesta con un trozo de Ringer tampón de algodón empapado. Constantemente superfuse ambas extremidades traseras con pre-calentado (37 ° C) Ringer buffer. Retire el exceso de tampón a través de una línea de vacío. </li><li> Coloque el animal en decúbito prono sobre la plataforma animal. Fije el soporte de sujeción de rodilla a la plataforma de los animales y asegurar ambas rodillas al pasador metálico con doble nudos cuadrados utilizando las líneas de sutura del ligamento rótula. Pin ambos pies en el bloque sylgard con alfileres modista. Asegure la plataforma animal en el escenario termo-controlado. Colocar la lámpara de calor para mantener el núcleo animales temperatura corporal a 37 º C. </li><li> Fije el soporte del electrodo a la plataforma animal y preparar el nervio ciático en el electrodo con la línea de sutura. Mantener el electrodo lejos de los músculos de las extremidades traseras. Cortar el tendón TA distal de la extremidad posterior no cubierta en el sitio de sutura MTJ. Conecte el tendón distal TA lazo de sutura en el gancho del brazo de palanca. Cubra el músculo expuesto extremidad posterior con algodón empapado en un búfer de timbre cálido. </li></ol><ol><li> Utilice la Tabla 2 para ajustar los parámetros en el software de DMC. Seguir el mismo protocolo descrito en la Sección 1.3.1 para determinar las propiedades contráctiles del músculo TA. Analizar los datos con el software DMA. </li><li> Después de la medición propiedad contráctil, separar el tendón distal TA lazo de sutura en el gancho del brazo nivelador. Retire el músculo TA. Determinar el peso del músculo húmedo y calcular el CSA 10. </li><li> Medir las propiedades contráctiles del músculo TA contralateral según los pasos 1 a 3 descritos anteriormente. Sacrificar al ratón de acuerdo con las directrices institucionales en el final del estudio. </li></ol>

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	<li>Huijing, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+collagen+fiber+reinforced+composite:+a+review+of+force+transmission+in+muscle+and+whole+limb.">Muscle as a collagen fiber reinforced composite: a review of force transmission in muscle and whole limb.</a> J. Biomech. 32, 329-345 (1999).</li><li>Moss, R. L., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+and+viscous+properties+of+resting+frog+skeletal+muscle.">Elastic and viscous properties of resting frog skeletal muscle.</a> Biophys. J. 17, 213-228 (1977).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li><li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction.">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mdx+mice+show+progressive+weakness+and+muscle+deterioration+with+age.">mdx mice show progressive weakness and muscle deterioration with age.</a> J. Neurol. Sci. 129, 97-105 (1995).</li><li>Hakim, C. H., Grange, R. W., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+passive+mechanical+properties+of+the+extensor+digitorum+longus+muscle+are+compromised+in+2-+to+20-mo-old+mdx+mice.">The passive mechanical properties of the extensor digitorum longus muscle are compromised in 2- to 20-mo-old mdx mice.</a> J. Appl. Physiol. 110, 1656-1663 (2011).</li><li>Segal, S. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+physiological+stability+of+rat+skeletal+muscle+in+vitro.">Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro.</a> Am. J. Physiol. 248, 265-270 (1985).</li><li>Grange, R. W., Gainer, T. G., Marschner, K. M., Talmadge, R. J., Stull, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-twitch+skeletal+muscles+of+dystrophic+mouse+pups+are+resistant+to+injury+from+acute+mechanical+stress.">Fast-twitch skeletal muscles of dystrophic mouse pups are resistant to injury from acute mechanical stress.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, 1090-1101 (2002).</li><li>Hakim, C. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+contractile+and+passive+properties+of+mdx+extensor+digitorum+longus+muscle.">Gender differences in contractile and passive properties of mdx extensor digitorum longus muscle.</a> Muscle Nerve. 45, 250-256 (2012).</li><li>Hakim, C. H., Li, D., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+murine+skeletal+muscle+function+for+muscle+gene+therapy.">Monitoring murine skeletal muscle function for muscle gene therapy.</a> Methods Mol. Biol. 709, 75-89 (2011).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este protocolo, se han ilustrado ensayos fisiológicos para medir las propiedades contráctiles y pasiva del músculo EDL y las propiedades contráctiles del músculo TA. Una preocupación importante en los estudios de la fisiología del músculo es la oxigenación del músculo objetivo. Para los músculos grandes (tales como el músculo TA), el en el enfoque situ se prefiere debido a la difusión de oxígeno a partir de tampón de Ringer puede no alcanzar el centro del músculo en un ensayo in vitro. En enfoque situ no perturbe suministro normal de sangre y la hipoxia asociada- efectos artificiales se evitan. El músculo EDL es uno de los músculos más comúnmente utilizado en el estudio de la fisiología. Adecuada oxigenación del músculo entero se puede lograr en un sistema in vitro, debido al tamaño pequeño del músculo. Además, el sistema in vitro proporciona un entorno cerrado para manipular las concentraciones de iones Ca (2 +, Na + y K +) y químicoCALS (ATP y glucosa) que son necesarios para la generación óptima de la fuerza muscular. Esto ofrece una gran oportunidad para estudiar el efecto de estas variables en la producción de fuerza. La medición exacta de las propiedades contráctiles y pasivo del músculo del miembro es fundamental para estudiar la función del músculo esquelético. Cambios característicos de estas propiedades a menudo se consideran como las características de varias enfermedades musculares. Los cambios en estos parámetros también son indicadores importantes para determinar si una terapia experimental es eficaz o no.

<table border="1"><tbody><tr><td> Material </td><td> Fabricante </td><td></td><td> Especificaciones y comentarios </td></tr><tr><td> Tejidos de órganos baño </td><td> Radnoti LLC, CA, EE.UU. </td><td></td><td> Agua-chaqueta papel higiénico (Cat # 158351-LL), tubo de oxígeno dispersor (N º 160192), válvula Luer (N º 120722) </td></tr><tr><td> Baño de agua circulante </td><td> Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gas mix </td><td> Airgas Nacional, Charlotte, Carolina del Norte, EE.UU. </td><td></td><td> 95% de O2 y 5% de CO 2 </td></tr><tr><td> En el aparato de ensayo de la función in vitro de músculo </td><td> Aurora Científico, Aurora, ON, Canadá </td><td></td><td> El sistema consta de un estimulador (modelo # 701A), un sistema de palanca de modo dual (modelo # 300C o 305C), una interfaz de señal (Modelo # 604B) y una prueba de APparatus (modelo # 800A) para montar verticalmente baño de tejidos de órganos </td></tr><tr><td> En el software de ensayo in vitro de músculo función </td><td></td><td></td><td> Control dinámico del músculo (DMC) de software y análisis dinámico control de los músculos de datos (DMA) de software </td></tr><tr><td> Ratón cóctel anestesia mezclaron en 0,9% NaCl </td><td> Consulte las directrices institucionales </td><td></td><td> La ketamina (25 mg / ml), xilazina (2,5 mg / ml) y acepromacina (0,5 mg / ml). Durante todo el procedimiento quirúrgico, un suplemento de 10% de la dosis inicial puede ser necesario para mantener a los animales bajo anestesia. </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Mundo Instrumento de Precisión </td><td> Cat # SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> A medida plexiglás bordo disección </td><td> En la casa de diseño </td><td></td><td> Consulte la Figura 1 </td></tr><tr><td> Calefacción lámpara </td><td> Tensor Lighting Company,Boston, MA, EE.UU. </td><td></td><td> Lámpara de 15 vatios para mantener caliente el ratón durante la disección </td></tr><tr><td> Tampón de Ringer </td><td> Los productos químicos se adquirieron de Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU. </td><td></td><td> Composición en mM: 1,2 NaH 2 PO 4 (Cat # S369), 1 MgSO 4 (Cat # M63), KCl 4,83 (Cat # P217), NaCl 137 (Cat # 217), 24 NaHCO 3 (Cat # S233), 2 glucosa de CaCl 2 (Cat # C79) y 10 (Cat # D16). Disolver y mezclar los productos químicos de forma individual en el orden indicado anteriormente. Almacenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Microscopio de disección estéreo </td><td> Nikon, Melville, NY, EE.UU. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Herramientas de disección </td><td> Herramientas Bellas ciencia, Foster City, CA, EE.UU. </td><td></td><td> Pinzas, tijeras gruesas gruesas, pinzas finas (recto y un ángulo de 45 °) </td></tr><tr><td> Sutura de seda trenzada # 4-0 </td><td> Su SofSilk USSCturas, Norwalk, CT, EE.UU. </td><td> Cat # SP116 </td><td></td></tr><tr><td> A medida gancho de acero inoxidable </td><td> Small Parts, Inc. </td><td></td><td> 2&#39;&#39; de largo S / S 304V (0,18&#39;&#39; de diámetro) para el transductor de fuerza 305C o 2,5&#39;&#39; de largo S / S 304V (0,012&#39;&#39; de diámetro) para transductor 300C (Cat # ASTM A313) </td></tr><tr><td> En el sistema de ensayo in situ de la función muscular </td><td> Aurora Científico, Aurora, ON, Canadá </td><td></td><td> El sistema (809B, en el aparato de ratón in situ) se componen de un estimulador (modelo # 701B), un sistema de palanca de modo dual (modelo # 305C), una interfaz de señal (modelo # 604A) y un aparato de placa para el pie termo controlada (modelo # 809A ) </td></tr><tr><td> En el software de ensayo in vitro de músculo función </td><td> Aurora Científico, Aurora, ON, Canadá </td><td></td><td> Control dinámico del músculo (DMC) de software y análisis dinámico control de los músculos de datos (DMA) de software </td></tr><tr><td> A medida ensayo TA animales plataforma </td><td> En la casa de diseño </td><td></td><td> Consulte la Figura 2 </td></tr><tr><td> A medida gancho de acero inoxidable </td><td> Small Parts, Inc. </td><td> Cat # ASTM A313 </td><td> 0.5&#39;&#39; de largo S / S 304V (0,18 diámetro&#39;&#39;) </td></tr><tr><td> Custom-made electrodos de platino 25G </td><td> Chalgren Enterprises, Gilroy, CA </td><td></td><td> Soldar dos alambres de platino 0,016&#39;&#39; de espesor a dos cables eléctricos 24G </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Materiales y equipo.

evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice

Los movimientos del cuerpo es el principal proveedor de la función mecánica del músculo esquelético. El músculo esquelético se compone de numerosos haces de fibras musculares que están enfundadas por intramusculares tejidos conectivos. Cada miofibra contiene muchas miofibrillas que corren longitudinalmente a lo largo de la longitud de la miofibras. Las miofibrillas son el aparato contráctil de los músculos y que se componen de unidades repetidas contráctiles conocidas como sarcómeros. Una unidad del sarcómero contiene los filamentos de actina y miosina que están espaciados por los discos Z y la proteína titina. Función mecánica del músculo esquelético se define por las propiedades contráctiles y pasiva del músculo. Las propiedades contráctiles se utilizan para caracterizar la cantidad de fuerza generada durante la contracción muscular, el tiempo de generación de la fuerza y ​​el tiempo de relajación muscular. Cualquier factor que afecta la contracción muscular (por ejemplo, la interacción entre filamentos de actina y miosina, la homeostasis de calcio, ATP / ADP ratio, etc) influye en la prope contráctilrties. Las propiedades pasivas se refieren a las propiedades elásticas y viscosas (rigidez y viscosidad) del músculo en ausencia de contracción. Estas propiedades se determinan por el extracelular y los componentes estructurales intracelulares (tales como titin) y los tejidos conectivos (principalmente colágeno) 1-2. Las propiedades contráctiles y pasiva son dos aspectos inseparables de la función muscular. Por ejemplo, la flexión del codo se lleva a cabo por la contracción de los músculos en el compartimiento anterior de la parte superior del brazo y estiramiento pasivo de los músculos en el compartimento posterior de la parte superior del brazo. Para comprender verdaderamente la función muscular, ambas propiedades contráctiles y pasivo deben ser estudiados. Las propiedades mecánicas contráctiles y / o pasiva de los músculos se ven comprometidas en enfermedades musculares. Un buen ejemplo es la distrofia muscular de Duchenne (DMD), una enfermedad degenerativa muscular severa causada por la deficiencia de distrofina 3. La distrofina es una prote citoesqueletoen que estabiliza la membrana celular del músculo (sarcolema) durante 4 contracción muscular. En la ausencia de distrofina, el sarcolema es dañado por la fuerza de cizalla generada durante la transmisión de la fuerza. Esta membrana desgarro inicia una reacción en cadena que conduce a la muerte de la célula muscular y la pérdida de la maquinaria contráctil. Como consecuencia, la fuerza muscular se reduce y miofibras muertos son reemplazados por tejidos fibróticos 5. Este cambio aumenta la rigidez muscular posterior 6. La medición exacta de estos cambios proporciona guía importante para evaluar la progresión de la enfermedad y para determinar la eficacia terapéutica de nuevo gen / célula / intervenciones farmacológicas. A continuación, se presentan dos métodos para evaluar las propiedades mecánicas contráctiles y pasivo del extensor largo de los dedos (EDL) y las propiedades contráctiles del músculo tibial anterior (TA) muscular.

Los siguientes resultados son una representación de los informes anteriores 6,9. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media. Tabla 3 muestra las propiedades morfométricas del músculo EDL en BL10 normal y con deficiencia de distrofina (MDX) ratones a los 4 a 6 meses de edad. Figura 4 muestra un resultado representativo propiedades contráctiles y pasivos de la músculo EDL de ratones mdx y BL10. Las propiedades contráctiles del músculo EDL se describen los siguientes términos como el específico (fuerza absoluta dividida por la CSA) la fuerza de contracción (Figura 4A), la fuerza específica tetánica máxima (Figura 4B), TPT y ½ RT de la fuerza tetánica máxima absoluta (Figura 4C y D). El TPT y ½ RT también se puede calcular a partir de la fuerza de contracción absoluta. El perfil de tensión-deformación (4E Figura) y SRR (Figura 4F) unavolver a utilizarse para describir las propiedades pasivo del músculo EDL. Ausencia de distrofina tiene un impacto significativo sobre las propiedades contráctiles y pasivo del músculo EDL 6,9. Tic específico y las fuerzas tetánicas se reducen significativamente en el músculo EDL mdx. El TPT es mucho más rápido, mientras que la media RT es significativamente más lento en el músculo EDL mdx. El perfil de tensión-deformación sugiere que la rigidez es significativamente mayor en el músculo EDL mdx. El músculo EDL mdx también produce una fuerza de resistencia significativamente mucho mayor (tensión pasiva) antes de alcanzar el pico de estrés, mientras que las tensiones post-pico disminuyendo mucho más rápido. Además, el SRR fue significativamente mayor en el músculo EDL mdx en comparación con la del músculo EDL BL10. El análisis estadístico La significación estadística entre dos grupos se analizaron por la prueba t de Student. Por ssignificado tatistical entre varios grupos, de un modo o de dos vías ANOVA seguido de Bonferroni post hoc de análisis se recomienda el uso del software SAS (SAS Institute Inc, Cary, NC). La diferencia se consideraron significativas cuando p &lt;0,05. Tabla 1. Materiales y equipo. <table border="1"><tbody><tr><td class="jove_content_small"> Experimento </td><td class="jove_content_small"> Tensión en reposo (gramos) </td><td class="jove_content_small"> Pulso de frecuencia (Hz) </td><td class="jove_content_small"> Ancho de pulso (ms) </td><td class="jove_content_small"> Estimulación duración (ms) </td><td class="jove_content_small"> Tramo de longitud </td><td class="jove_content_small"> Estiramiento de duración (ms) </td><td class="jove_content_small"> Ampliar velocidad </td><td class="jove_content_small"> Comentarios </td></tr><tr><td colspan="9"> 1. Evaluación de las propiedades contráctiles y pasivos de la ex vivo músculo EDL </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.1 Medición de las propiedades contráctiles del músculo EDL </td></tr><tr><td> 1. Calentar </td><td> 1,0 </td><td> 150 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Apoye el músculo durante 60 segundos entre cada estímulo. Estas contracciones tetánicas preliminares estabilizar el músculo para las mediciones posteriores. </td></tr><tr><td> 2. La longitud muscular óptimo (Lo) </td><td> 0,5, 1,0, 1,5 y 2,0 </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Deje que el músculo se relaje durante 30 segundos entre cada estímulo. Mida la longitud muscular óptima utilizando un calibrador digital. </td></tr><tr><td> 3. Soltero twitch fuerza (Pt) </td><td> Ajuste la tensión de reposo en Lo </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4. Fuerza muscular tetánica </td><td> Ajuste la tensión de reposo en Lo </td><td> 50, 80, 100, 120, 150 y 200 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Deje que el músculo se relaje durante 1 minuto entre cada estímulo. Determinar la frecuencia que generan la fuerza tetánica máxima absoluta (Po). </td></tr><tr><td> 5. La contracción excéntrica </td><td> Ajuste la tensión de reposo en Lo </td><td> Utilizar la frecuencia que genera la máxima fuerza tetánica (Po) </td><td> 0,2 </td><td> 700 </td><td> 10% Lo </td><td> últimos 200 m de la duración de la estimulación </td><td> 0.5 Lo / seg </td><td> Repita la contracción excéntrica durante 10 ciclos con 2 minutos de descanso entre ciclos. </td></tr><tr><td> 6. CSA del músculo EDL </td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (masa muscular (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,44)]. 1,06 g / cm 3 es la densidad del músculo y 0,44 es la longitud de la fibra del músculo EDL relación a Lo. </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.2 Medición de las propiedades pasivas del músculo EDL </td></tr><tr><td> 1. Seis-etapa de estiramiento protocolo </td><td> Ajuste la tensión de reposo en Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> 10% Lo </td><td></td><td> 2 cm / sec </td><td> Repita el protocolo de estiramiento con un incremento de 10% hasta 160 Helo Mín% se alcanza. ALOW 1,5 segundos entre los ciclos de estiramiento. </td></tr><tr><td> 2. SRR </td><td> Ajuste la tensión de reposo en Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> 10% Lo </td><td></td><td> 2 cm / sec </td><td> SSR se calcula dividiendo la diferencia en la tensión con el time transcurrido entre dos puntos de tiempo en un marco de tiempo. </td></tr><tr><td colspan="9"> 2,3 Medición de las propiedades contráctiles del músculo TA </td></tr><tr><td> 1. Calentar </td><td> 4.0 </td><td> 150 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Apoye el músculo durante 60 segundos entre cada estímulo. </td></tr><tr><td> 2. La longitud muscular óptimo (Lo) </td><td> 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 y 7,0 </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Deje que el músculo se relaje durante 30 segundos entre cada estímulo. Mida la longitud muscular óptima utilizando un calibrador digital. </td></tr><tr><td> 3. CSA del músculo TA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (masa muscular (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,6)]. 0,6 es la longitud de la fibra del músculo TA para Mín ratio. </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Parámetros para la evaluación de las propiedades mecánicas de los músculos EDL y TA. <table border="1"><tbody><tr><td> Tensión </td><td> Edad (meses) </td><td> Peso corporal (g) </td><td> EDL peso (mg) </td><td> EDL Lo (mm) </td><td> EDL CSA (mm 2) </td></tr><tr><td> BL10 </td><td> 6 </td><td> 32,03 ± 0,57 </td><td> 13,90 ± 0,77 </td><td> 14,09 ± 0,04 </td><td> 2,12 ± 0,12 </td></tr><tr><td> mdx </td><td> 6 </td><td> 35,44 ± 0,42 * </td><td> 16,73 ± 0,42 * </td><td> 13,93 ± 0,05 * </td><td> 2,57 ± 0,07 * </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Propiedades morfométricas del músculo EDL. *, El valor en mdratones x es significativamente diferente de la de la misma edad BL10 ratones. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1highres.jpg" fo:content-width="5.5in"/> Figura 1. Un diagrama esquemático del tablero del ratón a medida disección. La junta disección se realiza a partir de un espesor de ½ pulgada de plexiglass y fue fabricado en la tienda institucional. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figura 2. Una serie de imágenes digitales que muestran las etapas de un nudo cuadrado doble seguida por un nudo de bucle en la MTJ. Asterisco, laEDL muscular; Flecha, el tendón distal del músculo EDL. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3highres.jpg" fo:content-width="6in"/> /&gt; Figura 3. Un diagrama esquemático de la plataforma a medida para en ensayo de la función del músculo TA situ. La plataforma de plexiglás animal y el soporte de rodilla de acero inoxidable fueron diseñados para montarse en el aparato 809B en ratón in situ. *, Varilla de acero inoxidable (Cat # MPR-2.0 , Siskiyou, Grants Pass, Oregón), #, porta-electrodos Universal (Cat # MXB, Siskiyou, Grants Pass, Oregón); §, varilla de electrodo adjunto (Cat # MPR-3.0, Siskiyou, Grants Pass, Oregón); ** Sylgard bloque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figura 4. Los resultados representativos de las propiedades contráctiles y pasivo del músculo EDL. Las propiedades contráctiles del músculo EDL se caracterizan por la fuerza de contracción específica (A), la fuerza tetánica específico (B), el tiempo para la tensión máxima (C) y el tiempo de relajación medio (D). Las propiedades pasivo del músculo EDL son evaluados por el perfil de tensión-deformación (E) y la SSR. *, Ratones mdx son significativamente diferentes de la misma edad BL10 ratones.

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Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Los cambios en las extremidades mecánicas propiedades contráctiles del músculo y pasiva son importantes biomarcadores para enfermedades musculares. Este manuscrito describe ensayos fisiológicos para medir estas propiedades en el extensor largo común de los dedos y tibial murino músculos anteriores.

Evaluación de la función muscular del músculo extensor largo digitorum<em&gt; Ex vivo</em&gt; Y tibial anterior del músculo<em&gt; In situ</em&gt; En ratones

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

41.8K vistas.  University of Missouri. Los cambios en las extremidades mecánicas propiedades contráctiles del músculo y pasiva son importantes biomarcadores para enfermedades musculares. Este manuscrito describe ensayos fisiológicos para medir estas propiedades en el extensor largo común de los dedos y tibial murino músculos anteriores.

Video: Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

En vivo la micro-circulación de medición en el músculo esquelético de Intra-vital Microscopía

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Investigación

Biología

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

Procedimientos para la Rata In situ Propiedades contráctiles del músculo esquelético

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Evaluación ex vivo de la contractilidad, fatigabilidad y alternancia en aislados músculos esqueléticos

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Evaluación de calcio en Sparks intactas las fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Generación de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramación

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Detección y análisis de daño del ADN en el ratón músculo esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Con el método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

La medición de la función del músculo liso en el tejido aislado Bath-aplicaciones en Farmacología Investigación

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

Lesión por aplastamiento aórtico murino: una eficacia<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelo de proliferación de células musculares lisas y función endotelial

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Un Protocolo Automatizado Rápido de Fibra Análisis Población en músculo de rata Secciones representativas Uso de la cadena pesada de miosina inmunohistoquímica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Tinción Inmunofluorescente In Situ de Autofagia en Células Madre Musculares

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...