El modelo ex vivo es un método útil para evaluar el impacto de diversas intervenciones fisiológicas y compuestos farmacológicos y la absorción de glucosa muscular. Esta técnica permite la evaluación precisa de la absorción de glucosa en el músculo esquelético aislado del ratón en ausencia de factores de confusión que puedan interferir en un modelo animal intacto. Antes de comenzar un experimento, encienda el sistema integrado de biografía de tiras musculares y caliente las cámaras a 30 grados centígrados.
Abra el software de recopilación de datos y calibre los transductores forzados para garantizar la comparabilidad entre los conjuntos de datos. Agregue cuatro mililitros de medio de incubación basal precalentado de 30 grados centígrados a cada cámara de incubación y asegúrese de que el medio esté continuamente oxigenado con 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono. Coloque el ratón en posición prona sobre una bandeja de disección y confirme la falta de respuesta al reflejo del pedal.
Luego fije una sola pata delantera con una aguja. Use tijeras para quitar la piel de la parte inferior de la pierna hasta que tanto el tendón de Aquiles como la articulación de la rodilla sean visibles. Para la disección del músculo sóleo, conecte un solo lazo de sutura de 0,4 centímetros de diámetro preparado a partir de una pieza de sutura de nylon quirúrgico no absorbible de 16 centímetros al tendón de Aquiles y asegure las pinzas de peen al tendón de Aquiles distalmente al asa.
Corte para liberar los músculos sóleo y gastrocnemio de la pata y deslice cuidadosamente las pinzas peen a través del ratón para exponer el músculo sóleo. Fije las pinzas peen y coloque un segundo lazo de sutura alrededor del tendón proximal del músculo sóleo. Corte el tendón proximal y diseccione el sóleo, incluidos los dos asas de sutura unidas libres del músculo gastrocnemio.
Tras la recolección, use los bucles para unir rápidamente el músculo sóleo a los respectivos ganchos en una de las cámaras de incubación. Use fórceps para quitar la fascia que cubre el músculo tibial anterior. Los tendones distales de los músculos tibiales anteriores o EDL deben ser blancos claros, visibles y separados entre sí.
Cortar el tendón destilado del músculo tibial anterior y diseccionar el músculo. Use fórceps para liberar suavemente el músculo EDL de los tejidos circundantes, dejando el músculo intacto sin cortar los tendones. Coloque bucles de sutura individuales alrededor de los tendones EDL destilados y proximales.
Cuando se hayan colocado los bucles, corte los tendones para liberar el músculo EDL con los bucles de sutura unidos y conecte rápidamente los bucles a los ganchos en la segunda cámara de incubación. Luego ajuste la tensión en reposo de cada músculo a aproximadamente cinco mililinewtons y permita que los músculos se equilibren en el medio durante al menos 10 minutos antes de comenzar el experimento. Para medir la absorción de glucosa estimulada por la insulina, reemplace el medio de incubación basal en las cámaras con el medio de incubación sin insulina, una concentración de insulina submáximamente efectiva o una concentración de insulina máximamente efectiva para una incubación de 20 minutos.
Al final del período de estimulación, reemplace el medio de incubación con un medio de incubación de absorción de glucosa que contenga una concentración idéntica de insulina durante una incubación de 10 minutos. Al final de la incubación de absorción de glucosa, retire cuidadosamente los músculos de las cámaras de incubación y lave las muestras en un medio de incubación basal helado. Después del lavado, seque rápidamente los músculos en papel de filtro y congele el tejido sin los bucles de sutura en nitrógeno líquido.
Luego, recolecte 100 microlitros del medio de incubación de absorción de glucosa de cada cámara para el almacenamiento de 20 grados centígrados y el análisis de absorción de glucosa muscular. Para medir la absorción de glucosa estimulada por la contracción, coloque electrodos de platino centralmente y a ambos lados de los músculos dentro de las cámaras de incubación, e inicie la contracción muscular inmediatamente después de reemplazar el medio de incubación basal con el medio de incubación de absorción de glucosa. Registre la producción forzada de cada músculo incubado.
Después de 10 minutos, recoja y congele suavemente los músculos como se ha demostrado, almacenando 100 alícuotas de microlitros del medio de incubación de absorción de glucosa de cada cámara para el análisis de absorción de glucosa muscular como se ha demostrado. Para determinar la señalización miocelular mediante el análisis de western blotting en el mismo conjunto de muestras musculares, homogeneice cada muestra muscular congelada en 400 microlitros de tampón de homogeneización helada y gire la muestra de extremo a extremo durante una hora a cuatro grados centígrados. Luego, recolecte el licato por centrifugación y mida la cantidad de proteína de interés dentro de cada paleta de muestra de acuerdo con los protocolos estándar de análisis de western blot.
Para medir la absorción de glucosa en cada muestra, agregue 150 microlitros de sobrenadante de cada muestra y 25 microlitros de medio de incubación de captación de glucosa de las cámaras de incubación correspondientes para separar los viales de conteo de centelleo líquido que contienen tres mililitros de líquido de centelleo líquido por vial. Luego cargue los viales en un contador de centelleo líquido y mida la radiactividad de dos desoxiglucosa y manitol de acuerdo con las pautas del fabricante. En este análisis representativo, las tasas de absorción de glucosa basal fueron similares entre los músculos sóleo y EDL aislados de ratones hembra.
La absorción de glucosa aumentó en los músculos sóleo y EDL en respuesta a las concentraciones de insulina submáxima y máximamente efectivas. Además, tanto la ingesta de glucosa estimulada por insulina submáxima como la máxima fueron significativamente mayores en el músculo sóleo. En contraste, la absorción de glucosa inducida por la contracción fue significativamente mayor en el EDL en comparación con el músculo sóleo.
Aquí, se puede observar la fuerza muscular máxima producida en los músculos sóleo y EDL durante el período de estimulación de 10 minutos. Como era de esperar, el músculo EDL generó más fuerza durante la parte inicial del período de estimulación, seguido de una disminución rápida más tarde en el período de estimulación. Las concentraciones submáximas y máximas de insulina indujeron un aumento en la fosforilación de Akt treonina 308 y TBC1D4 Serina 588, mientras que la contracción indujo un aumento en la fosforilación de AMPK Alfa treonina 172 y ACC serina 212.
Ni la insulina ni la contracción condujeron a un cambio en el contenido total de proteínas. Antes de intentar medir la absorción de glucosa en músculos aislados del ratón, es vital practicar a fondo la disección de los músculos sóleo y EDL. Después de la evaluación de la absorción de glucosa muscular, el lisado de proteína muscular restante se puede utilizar para análisis bioquímicos adicionales que pueden dilucidar los cambios observados en las tasas de absorción de glucosa.
