Nos gustaría dar las gracias a Amie Regan de una cuidadosa lectura del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por NGFN Plus subvención # 01GS0801, MRC comunión subvención y subvención G1002523 NHSBT WP11-05 al LD ​​y DFG subvención FR2938/1-1 de CCF

1. Marcaje metabólico con 4-tiouridina Haga un plan detallado de la configuración experimental / calendario, por ejemplo, cuándo agregar la 4SU de cultivo celular y cuándo cosechar las muestras. Plan de al menos 5 minutos entre cada condición. Sólo el tratamiento de células de un estado a la vez. Maneje max. 3 - 5 platos en un momento dado. Manipular las células tan rápidamente como sea posible para reducir al mínimo los cambios en la temperatura y los niveles de CO 2. Evite la exposición de las células a la luz brillante después de añadir 4SU ya que esto puede dar lugar a la reticulación de RNA 4SU marcados a las proteínas celulares. Inicio de etiquetado <ol><li> Descongelar 4-tiouridina (4SU) justo antes de uso y la pipeta cantidad requerida de 4SU para cada condición en un tubo Falcon estéril. </li><li> Tomar la cantidad requerida de medio de cultivo celular (5 ml por placa de 10 cm) de los platos y añadir a tubo Falcon 4SU que contiene y mezclar bien. Retire y deseche el medio restante de los platos. </li> &lt;li&gt; Aplicar 4SU medio que contiene de nuevo a los platos. </li></ol> Fin de etiquetado <ol start="4"><li> Retire el medio de cultivo celular de las células. Añadir 5 ml de Trizol a cada placa. Para los experimentos de complejos incluyendo múltiples puntos de tiempo o condiciones, este paso se lleva a cabo mejor por dos personas, una eliminación del medio, el otro la adición de Trizol y cosechar el lisado. </li><li> Incubar durante 5 min a temperatura ambiente para la lisis celular completa. </li><li> Utilice una pipeta de 10 ml para enjuagar la placa cuidadosamente con el Trizol añadido. Esto ayuda a la lisis celular completa y recuperación de la muestra. Maneje con cuidado ya Trizol es extremadamente peligroso al entrar en contacto con la piel o los ojos! Tener un antídoto para las quemaduras de fenol en la mano (por ejemplo, polietilenglicol 300 o 400 en alcoholes metilados industriales (70:30)). Transferir las muestras a tubos de polipropileno. Tenga en cuenta que los tubos Falcon estándar no resisten estas elevadas fuerzas g). Las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C durante al menos un mes hasta el ARN total is preparado. </li></ol> 2. Preparación de ARN usando Modificado Protocolo de Trizol <ol><li> Añadir 1 ml de cloroformo (0,2 ml por ml de Trizol) y agitar vigorosamente durante 15 segundos. Incubar a temperatura ambiente durante 2 - 3 min. </li><li> Centrifugar a 13.000 × g durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Transferir fase superior acuosa (que contiene el ARN) a un nuevo tubo de 15 ml de polipropileno. </li><li> Añadir ½ del volumen de reacción de precipitación de amortiguación tanto ARN e isopropanol (por ejemplo, a 3 ml de sobrenadante añadir 1,5 ml de tampón de precipitación ARN y 1,5 ml de isopropanol). </li><li> Mezclar bien. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Centrifugar a 13.000 × g durante 10 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante. </li><li> Centrifugar brevemente (5000 × g durante 30 segundos) y retirar el isopropanol residual con 200 l pipeta. </li><li> Añadir un volumen igual de etanol al 75% y agitar tubo hasta que se desenganche el pellet. Evite romper en muchos pedazos pequeños como esto puede hacer que la eliminación de secuelasl etanol difícil. </li><li> Centrifugar a 13.000 × g durante 10 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante. </li><li> Centrifugar brevemente ARN y eliminar el etanol restante con una pipeta de 200. Repita el paso y retirar el etanol restante con una pipeta de 20. Después de estos dos pasos, se debe realizar no más secado del pellet. </li><li> Añadir 100 l de H 2 O por 100 g de ARN rendimiento esperado y mezclar bien pipeteando arriba y abajo 5 - 6 veces para ayudar a disolver el ARN. </li><li> Disolver y desnaturalizar el ARN mediante calentamiento a 65 ° C durante 10 minutos (agitador) y colocar inmediatamente en hielo. </li><li> Medir la concentración de ARN a 260 nm utilizando un espectrofotómetro NanoDrop, siguiendo las instrucciones del fabricante. Este ARN se puede almacenar a -80 ° C durante al menos un mes. </li></ol> 3. Biotinilación tiol específica de recién transcritos de ARN <ol><li> Comience con 60-80 g de ARN celular total. </li><li> Constituir el etiquetado de reacción. Pipetear en el siguienteorden (por mu g de ARN): <ol class="lalpha"><li> 1 l de tampón 10x Biotinilación </li><li> 7 l de ARN (que contienen 1 RNA mu g diluidos en nucleasa libre de H 2 O) </li><li> 2 l de biotina-HPDP (1 mg / ml de DMF) </li></ol></li></ol> Siempre agregue la biotina HPDP pasado y mezclar inmediatamente con la pipeta. En caso de que la biotina precipita, contenido de DMF se puede aumentar a una concentración final de 40%. <ol start="3"><li> Incubar a temperatura ambiente durante 1,5 horas con rotación. </li><li> Añadir un volumen igual de cloroformo. Mezcle vigorosamente. Incubar durante 2 - 3 minutos hasta que las fases comienzan a separarse y burbujas comienzan a desaparecer. </li><li> Se centrifuga a 20000 × g durante 5 min a 4 ° C. Transferir con cuidado la fase acuosa superior a un nuevo tubo. </li><li> Repetir los pasos 3.4 y 3.5 una vez. Es posible que desee llevar a cabo este paso en 2 ml de fase Lock Gel tubos pesados ​​para reducir la pérdida de RNA. </li><li> ARN precipitación: añadir 1/10 del volumen de NaCl 5 M y un volumen igual deisopropanol a la fase acuosa. </li><li> Se centrifuga a 20000 × g durante 20 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir un volumen igual de 75% de etanol, se centrifuga a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante. </li><li> Girar brevemente y eliminar el etanol residual con 200 l pipeta. </li><li> Girar brevemente y eliminar el etanol residual con 20 l pipeta. </li><li> No permita que el ARN se sequen. Vuelva a suspender en 50 a 100 l H 2 O (~ 1 l por 1 entrada g ARN). Mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo 5-6 veces. </li><li> Comprobar la calidad del ARN por análisis electroforético de excluir la degradación del ARN. </li></ol> 4. Dot Blot análisis de 4SU incorporación (Opcional) Incorporación 4SU puede ser fácilmente determinada por análisis de transferencia de punto de ARN con biotina. Este es un paso opcional que permite la resolución de problemas y la estimación de las tasas de incorporación 4SU relativas a un control oligo ADN biotinilado. Para este ensayo se recommend usando yodoacetil-biotina en lugar de biotina-HPDP para la biotinilación de ARN 4SU marcados en el paso 3.2. Esto resulta en una biotinilación irreversible de 4SU-ARN. Por lo tanto, los métodos basados ​​en columnas (por ejemplo RNeasy) se pueden utilizar para la recuperación de cantidades mucho más pequeñas de ARN biotinilado (por ejemplo, 5 g). Mientras que el uso de ARN biotinilado biotina-HPDP también es adecuado para este ensayo, la señal resultante es más débil y la relación señal-ruido menos favorable (Figura 3). <ol><li> Siga el protocolo para 4SU el etiquetado y el aislamiento de ARN celular total como se describe en las secciones 1 y 2. </li><li> Biotinilar 4SU marcado RNA como se describe en la sección 3 reemplazando biotina HPDP con yodoacetilo-biotina y realizar dos extracciones cloroformo para eliminar completamente excesivos residuos yodoacetilo-biotina. </li><li> Recuperar ARN con biotina por isopropanol / precipitación con etanol como se describe o utilizando un enfoque basado en columnas (por ejemplo RNeasy) en el caso de pequeñas cantidades de ARN (&lt;10 g) Se utilizan. </li><li> Incubar la membrana Zeta en agua libre de nucleasa con agitación durante 10 min. </li><li> Tome la membrana fuera del agua libre de nucleasa y eliminar el exceso de líquidos mediante la colocación de la membrana en entre dos toallas de papel limpias y presión firmemente. El secado al aire de la membrana durante 5 minutos se traducirá en puntos más agradables. </li><li> Para cada muestra, preparar 20 l de 200 ng de ARN / l blot utilizando tampón de unión fría del punto de hielo (NaOH 10 mM, EDTA 1 mM). Aplicar 5 l de esta dilución (es decir, 1 g de ARN), así como tres diluciones de 10 veces posteriores (es decir, 100, 10, y 1 ng de ARN, respectivamente) a la membrana Zeta por pipeteado. Pipeteado a través de un rack vacío de puntas de pipeta puede ser empleada para proporcionar una separación distribuido uniformemente. Alternativamente, utilizar un aparato de transferencia de puntos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Aplicar 5 l de la biotina marcada con oligo de ADN a concentraciones que van desde 20 ng / l a 20 pg / l (es decir, 100 a 0,1 ng de oligo) como un cont positivorol a la membrana mediante pipeteo. Utilice una muestra biotinilado, 4SU-ingenuo como control negativo. </li><li> Aire secar la membrana durante 5 min. </li><li> Se incuba la membrana durante 30 min en 40 ml de tampón de bloqueo con balanceo. </li><li> Incubar la membrana con 10 ml de 1:1000 de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante durante 15 minutos (5 ml de PBS + 5 ml de SDS al 20% + 10 l de estreptavidina peroxidasa de rábano picante) </li><li> Lavar la membrana dos veces en 40 ml de PBS + 10% de SDS (20 ml de PBS + 20 ml de SDS al 20%) durante 5 min. </li><li> Lavar la membrana dos veces en 40 ml de PBS + 1% de SDS (38 ml de PBS + 2 ml de SDS al 20%) durante 5 min. </li><li> Lavar la membrana dos veces en 40 ml de PBS + 0,1% de SDS (40 ml de PBS + 200 l 20% de SDS) durante 5 min. </li><li> Retire el exceso de líquido mediante la colocación de la membrana entre dos toallas de papel limpias y presionando firmemente. </li><li> Visualizar HRP unida a la membrana utilizando ECL según las instrucciones del fabricante. </li><li> Colocar la membrana en papel de aluminio / bolsa de plástico, eliminar las burbujas de aire y se incuba durante 2 minutos en la oscuridad. </li><li> Exponga membranapelícula durante 1 - 5 min. </li></ol> 5. La separación de RNA con y sin etiqueta usando perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina <ol><li> Calor tampón de lavado (3 ml por muestra) a 65 ° C en un baño de agua. </li><li> Prepare fresco ditiotreitol 100 mM (DTT) en nucleasa libre de H 2 O. Hacerlo por decantación 15 - 30 mg de polvo de TDT en un tubo Falcon de 50 ml limpio colocado en la escala ultra-fino. Pese y agregue la cantidad necesaria de nucleasa libre de H 2 O. </li><li> Calor biotinilado muestras de ARN a 65 º C durante 10 min para desnaturalizar e inmediatamente se coloca sobre hielo. </li><li> Lugar μMacs columnas en el soporte magnético. Se recomienda no procesar más de 12 muestras a la vez (6-8 muestras son óptimas). </li><li> Columnas Pre-equilibre Miltenyi con 1 ml de tampón de lavado temperatura ambiente. Esto tomará alrededor de 15 min. </li><li> Mientras tanto, añadir 100 l de perlas de estreptavidina a 50 - 100 l de ARN con biotina. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos con rotación. </li> &lt;<html> li&gt; Si cualquiera de las columnas no se ha iniciado el drenaje por ahora esto puede facilitarse por presionando suavemente en la parte superior de la columna con un dedo enguantado. Una vez que el flujo ha comenzado las columnas drenan fácilmente. </li><li> Aplicar los ARN / los granos para las columnas. Deseche el flujo continuo a menos que quiera recuperar la fracción de ARN sin etiqueta (ver sección 7). </li><li> Lavar tres veces con 0,9 ml de 65 ° C de tampón de lavado (1 ml puntas de pipeta se encogen al pipetear tampones a 65 ° C). </li><li> Lavar tres veces con 0,9 ml de tampón de lavado temperatura ambiente. </li><li> Pipetear 700 l RLT Buffer (Kit de Limpieza MinElute RNeasy, Qiagen) en nuevos tubos de 2 ml y se colocan debajo de las columnas. </li><li> Se eluye el ARN recién transcrito en el búfer RLT mediante la adición de 100 l de DTT 100 mM a las columnas. </li><li> Lleve a cabo una ronda de elución segundos 3 minutos más tarde en el mismo tubo mediante la adición de otros 100 l de DTT 100 mM. </li></ol> 6. La recuperación de recién ARN transcrito ontenido &quot;&gt; Continuar con la limpieza MinElute RNeasy (Qiagen) de protocolo siguiendo las instrucciones del fabricante. Elute en 25 l de H 2 O. Medir concentraciones de ARN sin nucleasa usando un espectrofotómetro Nanodrop. Para evitar la necesidad de descongelar y volver a congelar RNA antes de presentar a un ensayo de alto rendimiento, se recomienda la preparación de ADNc inmediatamente después de la recién transcrito de ARN se purifica. Utilizar 2,5 l de los ARN recién transcrito en 20 l de la mezcla de síntesis de ADNc para la síntesis de ADNc, siguiendo las instrucciones del fabricante. Realizar controles de QRT-PCR utilizando 1 : 10 diluciones de la mezcla de ADNc de la tienda de ARN a -80 ° C.. 7. Recuperación de sin rotular, consolidar RNA (Opcional) En caso de que el ARN no unido necesita ser recuperado; recolectar y combinar el flujo a través (después de añadir la solución de perlas de estreptavidina-ARN a las columnas) y del primer lavado para su posterior precipitación. Por lo general, es suficiente para precipitar sólo el 50% del ARN no unido como this contendrá&gt; 80% del material de partida. <ol><li> Añadir un volumen igual de isopropanol (no necesita ninguna sal que se añade como el tampón de lavado ya contiene 1 M de NaCl). </li><li> Se centrifuga a 20000 × g durante 20 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir un volumen igual de 75% de etanol, se centrifuga a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante. </li><li> Girar brevemente y eliminar el etanol residual con 200 l pipeta. </li><li> Girar brevemente y eliminar el etanol residual con 20 l pipeta. </li><li> No permita que el ARN se sequen. Resuspender en 100 l H 2 O. Mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo 5-6 veces. Incubar a 65 ° C durante 10 min con agitación y transferir directamente a hielo. </li><li> Comprobar la calidad del ARN por análisis electroforético de excluir la degradación del ARN. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Metabólicas etiquetado de recién transcrito RNA aumenta sustancialmente el poder de las tecnologías de alto rendimiento como los microarrays y RNA-Seq, proporcionando plantillas más adecuadas para hacer frente a la cuestión biológica de interés. El presente protocolo se sometió a una amplia optimización. Se permite el enriquecimiento&gt; 1.000 veces de ARN recién transcrito y proporciona resultados altamente reproducibles. El diseño experimental de un experimento de 4SU-etiquetado...

Perfiles de expresión génica es una herramienta clave usada para estudiar los procesos celulares y la red asociada a la interacción compleja. Los estudios sobre la abundancia de ARNm han sido por lo general el método de elección para obtener conocimientos básicos sobre los mecanismos moleculares subyacentes. El desarrollo de microarrays de todo el transcriptoma 1 y, más recientemente, de secuenciación de nueva generación de ARN (ARN-ss) 2-4 alimentó este enfoque. Aunque estas tecnologías han revolucionado nuestra comprensión de la complejidad de la expresión génica celular, se enfrentan a limitaciones importantes debido a las propiedades intrínsecas de la muestra de la plantilla, es decir, ARN celular total. Primero, los cambios a corto plazo en los niveles de ARN total no se ajustan a los cambios en las tasas de transcripción, pero son inherentemente dependiente en la vida media de los respectivos transcripciones de ARN. Mientras que cinco veces la inducción de una transcripción de corta duración, por ejemplo de codificación para un factor de transcripción, será fácilmente detectable en ARN totaldentro de una hora, la misma inducción de una transcripción de larga duración, por ejemplo, que codifica para una enzima metabólica, permanecerá prácticamente invisible. Además, incluso una completa desconexión (&gt; 1.000 veces baja regulación) de la tasa de transcripción de un gen normal, con una vida media durante cinco horas ARN simplemente se llevará cinco horas para sus niveles de ARN total disminuirá en sólo dos veces . Por lo tanto, el análisis de ARN total favorece la detección de un máximo de regulación de las transcripciones de corta vida, muchos de los cuales codifican para factores de transcripción y genes con funciones de regulación 5. Además, la verdadera cascada de cinética de la regulación se oscurece y eventos de señalización primaria no puede ser diferenciada de la secundaria. Ambos, a su vez, puede dar lugar a un sesgo sustancial en posteriores análisis de la bioinformática. En segundo lugar, las alteraciones en los niveles de ARN total no se pueden atribuir a los cambios en la síntesis de ARN o la caries. Las mediciones de esta última requieren enfoques invasivos de células, por ejemplo, el bloqueo transcriptisobre el uso de actinomicina D 6, y el seguimiento prolongado de curso RNA decadencia en el tiempo. Con un ARNm media de la semivida en células de mamífero de 5 - 10 h 5,7, los niveles de mRNA de la mayoría de los genes sólo se han disminuido en menos de dos veces después de varias horas de detención transcripcional. Estas más bien pequeñas diferencias dan como resultado mediciones imprecisas groseramente de mRNA vida media para la mayoría de los genes celulares debido a la naturaleza exponencial de las ecuaciones matemáticas subyacentes. Por último, mientras que el ARN-ss de ARN celular total reveló que aproximadamente la mitad de nuestros genes están sujetos a eventos alternativos de corte y empalme 8, la cinética subyacentes, así como los mecanismos dinámicos rectores de tejido y el contexto específico de regulación de procesamiento del ARN siguen siendo poco conocidos. Además, la contribución de procesamiento del ARN para la expresión diferencial de genes, en particular para los ARN no codificantes, queda por determinar. En conjunto, estas limitaciones constituyen importantes obstáculos paramodelización cinética bioinformático de los mecanismos moleculares subyacentes. Recientemente hemos desarrollado un enfoque, perfiles de expresión génica denominada de alta resolución, para superar estos problemas 5,7,9. Se basa en el marcaje metabólico de ARN recién transcrito utilizando 4-tiouridina (4SU-etiquetado), un derivado de uridina que ocurre naturalmente, y proporciona acceso directo a las transcripciones recién transcrito con una interferencia mínima en el crecimiento celular y la expresión génica (véase la Figura 1) 5, 10-12. La exposición de células eucariotas a los resultados de 4SU en su rápida absorción, la fosforilación de 4SU-trifosfato, y la incorporación en el ARN recién transcrito. Después del aislamiento del ARN celular total, la fracción de ARN 4SU-marcado es biotinilado tiol-específicamente la generación de un enlace disulfuro entre la biotina y el ARN recién transcrito. &quot;Total RNA celular&quot; puede entonces ser cuantitativamente separado en la etiqueta (&#39;recién transcrita&#39;) y sin marcar (&quot;pre-existing &#39;) ARN con alta pureza usando perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Por último, ARN marcado se recupera de las perlas por simple adición de un agente reductor (por ejemplo, ditiotreitol) escindir el enlace disulfuro y la liberación de los ARN recién transcrito a partir de las perlas. Recientemente transcrito de ARN representa la actividad transcripcional de cada gen durante el marco de tiempo de la exposición 4SU. 4SU-etiquetado en el plazo de minutos proporciona así una imagen instantánea de la expresión de genes eucariotas y una plantilla ideal para los análisis bioinformáticas aguas abajo (por ejemplo, el análisis de promotor). En los casos en que se puede suponer condiciones de estado estable, las relaciones entre el recién transcrito / total, recién transcritas / sin etiqueta y sin etiqueta / ARN total proporcionan acceso no invasivo para RNA precisos vida media 7,13. Además, es importante tener en cuenta que los transcritos de ARN recientemente purificadas después de tan poco como 5 minutos de 4SU-etiquetado (5 min 4SU-ARN) es menor de 15 y 60 min 4SU-ARN.Al llevar a cabo tanto de ultra-corta y progresivamente más largo 4SU-etiquetado en un solo entorno experimental combinado con ARN-ss, la cinética de procesamiento del ARN se revelan a una resolución de 9 nucleótidos. Por último, los análisis de tiempo-luego de ARN recién transcrito y totales combinados con modelos computacionales permiten un análisis integral de la síntesis de ARN y la decadencia 14. En conclusión, este enfoque permite el análisis directo de la dinámica de la síntesis de ARN, el procesamiento, y la degradación en las células eucariotas. Es aplicable en todos los principales organismos modelo incluidos los mamíferos, insectos (Drosophila), anfibios (Xenopus), y la levadura 5,15,16. Es directamente compatible con el análisis de microarrays 5,17, ARN-ss 9,13,14, y es aplicable en vivo 12,15. A continuación, detallamos la metodología para etiquetar, aislar y purificar el ARN recién transcrito en células de mamífero cultivadas. Además, potenciómetroSe discuten los problemas y dificultades al.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-thiouridine</td>
 <td>Carbosynth</td>
 <td>T4509</td>
 <td>Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 &deg;C in aliquots of 50-500 &mu;l, discard unused reagent, do not refreeze.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trizol</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)</td>
 <td>WARNING - CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>372978</td>
 <td>WARNING - HAZARDOUS TO HEALTH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isopropanol</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>650447</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate, nuclease-free</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C8532</td>
 <td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5M nuclease-free NaCl</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>71386</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free H2O</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>W4502</td>
 <td>Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNA precipitation buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>459844</td>
 <td>Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>51237</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15575-020</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Biotinylation Buffer (BB)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylformamide (DMF)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-Link biotin-HPDP</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>21341</td>
 <td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &deg;C in aliquots of 1 ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0032 005.152</td>
 <td>Optional for the chloroform extraction step.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zeta membrane</td>
 <td>BIORAD</td>
 <td>162-0153</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Dot blot binding buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM NaOH, 10 mM EDTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-oligo</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>5'-biotin, 25 nucleotides, any sequence</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium dodecyl sulphate</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BPE9738</td>
 <td>For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 &deg;C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>21333</td>
 <td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &deg;C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate buffer saline</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>10010-015</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dot blot blocking buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin-horseradish peroxidase </td>
 <td>Vector Laboratories</td>
 <td>SA5004</td>
 <td>Store at -20 &deg;C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 &mu;l Streptavidin-HRP before use. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ECL reagent</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>RNP2109</td>
 <td>Use following the manufacturer's instructions.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super RX, X-RA Film, 18x24 cm</td>
 <td>Fujifilm</td>
 <td>47410 19236</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&mu;Macs Streptavidin Kit</td>
 <td>Miltenyi</td>
 <td>130-074-101</td>
 <td>Store the beads at 4 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P1379</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Washing buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol (DTT)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>43817</td>
 <td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Store columns at 4 &deg;C, remaining components of the kit at room temperature.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>72.692.005</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>72.694.005</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352096</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV/VIS spectrophotometer</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>NanoDrop 1000</td>
 <td>Or equivalent. Use low volume (1-2 &mu;l) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polypropylene 15 ml centrifuge tubes</td>
 <td>VWR International</td>
 <td>525-0153</td>
 <td>In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 &times; g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Avanti J-25</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JLA-16250</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adaptors for 15 ml tubes</td>
 <td>Laborger&auml;te Beranek</td>
 <td>356964</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated table-top centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5430 R</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>Thermomixer compact</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic stand</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>130-042-109</td>
 <td>One stand holds 8 &mu;Macs columns.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waterbath</td>
 <td>Grant</td>
 <td>SUB Aqua 5</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultra-fine scale</td>
 <td>A&amp;D</td>
 <td>GR-202</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-Gel iBase Power System</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>G6400UK</td>
 <td>For RNA gels; or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>G4020-01</td>
 <td>For RNA gels; or equivalent.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

metabolic labeling of newly transcribed rna for high resolution gene expression profiling of rna synthesis, processing and decay in cell culture

El desarrollo de microarrays de todo el transcriptoma y de secuenciación de nueva generación ha revolucionado nuestra comprensión de la complejidad de la expresión génica celular. Junto con una mejor comprensión de los mecanismos moleculares implicados, las mediciones precisas de la cinética subyacentes se han convertido en cada vez más importante. Aquí, estas metodologías poderosas se enfrentan a grandes limitaciones debido a las propiedades intrínsecas de las muestras de plantilla que estudian, es decir, el ARN celular total. En muchos casos, los cambios en el ARN celular total se producen ya sea demasiado lento o demasiado rápido para representar los eventos moleculares subyacentes y su cinética con suficiente resolución. Además, la contribución de las alteraciones en la síntesis de ARN, el procesamiento, y la decadencia no se diferencian fácilmente. Recientemente hemos desarrollado alta resolución-perfiles de expresión génica para superar estas limitaciones. Nuestro enfoque se basa en el marcaje metabólico de los recién transcrito de ARN con 4-thiouricenar (por lo tanto también se conoce como 4SU-etiquetado) seguido por rigurosa purificación de ARN recién transcrito utilizando biotinilación específico de tiol y perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Es aplicable a una amplia gama de organismos, incluyendo vertebrados, Drosophila, y levadura. Hemos aplicado con éxito 4SU-etiquetado para estudiar la cinética en tiempo real de las actividades de factor de transcripción, proporcionar mediciones precisas de ARN vidas medias, y obtener nuevos conocimientos sobre la cinética de procesamiento del ARN. Por último, el modelado computacional se puede emplear para generar un análisis integrado, integral de los mecanismos moleculares subyacentes.

1. Material de Partida y rendimientos esperados Después de 1 hora (h) de 4SU-exposición recién transcrito de ARN representa cerca de 1 - 4% del total de ARN celular. Este será menor en crecimiento detenido células ya que ya no sintetizan ARN para tener en cuenta para el crecimiento celular / replicación. Al etiquetar durante 1 hora, se recomienda iniciar el ensayo con 60 a 80 g de ARN total. A partir de menos de 30 g del total de ARN resultados en pequeños gránulos de ARN que son difíc...

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Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

El ARN celular total proporciona una plantilla pobres para el estudio de los cambios a corto plazo en la síntesis de ARN y la descomposición, así como la cinética de procesamiento del ARN. A continuación, describimos marcaje metabólico de ARN recién transcrito con 4-tiouridina seguido por biotinilación específico de tiol y la purificación de ARN recién transcrito que permiten superar estas limitaciones.

Marcaje metabólico del ARN recién transcrito para alta resolución Gene perfiles de expresión de la síntesis de RNA, producción y descomposición en cultivo celular

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

metabolic-labeling-newly-transcribed-rna-for-high-resolution-gene

Research

JoVE Journal

Biology

27.0K vistas.  Max von Pettenkofer Institute. El ARN celular total proporciona una plantilla pobres para el estudio de los cambios a corto plazo en la síntesis de ARN y la descomposición, así como la cinética de procesamiento del ARN. A continuación, describimos marcaje metabólico de ARN recién transcrito con 4-tiouridina seguido por biotinilación específico de tiol y la purificación de ARN recién transcrito que permiten superar estas limitaciones.

Video: Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Investigación

Biología

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Aislamiento del ARN de síntesis embrionarias pez cebra y el cDNA de análisis de expresión génica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Inducción y prueba de hipoxia en el cultivo celular

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

En la transcripción in vitro y la nivelación de mRNA de luciferasa Gaussia Seguido por transfección de células HeLa

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

Metabólicas etiquetado de repeticiones ricas en leucina quinasas 1 y 2 con Radioactive Fosfato

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

La medición de la tasa metabólica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Mediante respirometría

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

La secuenciación de ARN dirigidos Ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

La detección de las proteínas de unión a ARN por<em&gt; In Vitro</em&gt; ARN desplegable de adipocitos Cultura

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...