Este método es significativo porque ningún otro protocolo permite que el ARN recién sintetizado sea analizado en una escala de tiempo tan corta, y permite experimentos de persecución de pulsos con un pulso tan corto. Este protocolo funciona bien con el agotamiento de proteínas, como el protocolo Best AID 4U. La principal ventaja es que el fondo es bajo.
Esto permite los tiempos de etiquetado cortos, mediante la eliminación de casi todo el ARN no antilado. El protocolo escrito también detalla muchos tipos diferentes de experimentos que se podrían realizar y cómo integrarlos en esta técnica. Para comenzar este procedimiento, haga crecer la levadura en el medio YMM a un OD 600 entre 0,6 y 0,8.
En una campana de humo, agregue un metanol equivalente a 30 a 50% del volumen de muestra previsto a un tubo de 50 mililitros. Cierre bien los tubos, etiquete y colóquelos sobre hielo seco para enfriar. A continuación, etiquete dos tubos de mililitro para el almacenamiento a largo plazo de las muestras y colóquelos en hielo para enfriar.
Agregue perlas de circonio a los dos tubos de mililitro. Enfríe al menos un mililitro de agua por muestra sobre hielo. Si se va a añadir un pico S.pombe al cultivo, coloque una alícuota de células de S.pombe tioladas en hielo para descongelar.
Vórtices la alícuota descongelada y agréguela a la cultura. A continuación, añadir 4tU al cultivo a una concentración de 10 micromolares y mezclar vigorosamente. Thio-etiqueta durante un período de tiempo entre 15 segundos y cinco minutos.
Tome muestras de la cultura a intervalos regulares hasta el final del curso de tiempo. Agregue cada muestra a uno de los tubos de centrífuga preparados que contienen metanol. Selle cada tubo, agite para mezclar bien y colóquelo sobre hielo seco.
Una vez tomadas todas las muestras, colólas todas sobre hielo. Asegúrese de que ninguna de las muestras se haya congelado. Si alguno se ha congelado, escúbralos suavemente en la mano mientras invierte constantemente.
Centrifugar las células a 3.000 veces g y a cuatro grados Celsius durante dos minutos para peletizar las células. Vierta el líquido y resuspendir el pellet en al menos un mililitro de agua helada en pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la suspensión al tubo de la tapa del tornillo preparado y coloque el tubo sobre hielo.
Centrifugar las muestras brevemente a una velocidad superior a 13.000 veces g para re-pellet las células. Luego colóquelos de nuevo sobre hielo y retire el líquido. En primer lugar, agregue 400 microlitros de tampón AE, 40 microlitros de SDS y 800 microlitros de fenol a un pH bajo.
Resuspend por vórtice durante 10 segundos. Luego lice las células en un homogeneizador durante tres ráfagas de dos minutos en el ajuste de potencia más bajo. Deje las muestras sobre hielo durante dos minutos entre pulsos de homogeneización.
Coloque las células de lesed sobre hielo seco durante cinco minutos hasta que se solidifique. A continuación, utilice una microcentrífuga para girar las células a una velocidad superior a 13.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de esto, realizar la extracción de cloroformo fenol y la extracción de cloroformo como se describe en el protocolo de texto.
Añadir entre 1/3 y 1/2 del volumen de 10 cloruro de litio molar y mezclar para precipitar el ARN. Centrifugar a una velocidad superior a 13.000 g durante cinco minutos. Retire el líquido y vuelva a girar brevemente la muestra para eliminar las escorias.
A continuación, lave el pellet con 300 a 500 microlitros de 70% etanol. Centrifugar el pellet lavado brevemente, y retire cualquier etanol restante. Resolebuya el pellet de ARN en 90 microlitros de TE a un pH 7.0 calentando a 65 grados celsius mientras agita.
Después de comprobar la solubilización completa del ARN, transfiera la suspensión a un tubo de 0,2 mililitros. Para empezar, biotinilo mediante la adición de 10 microlitros de la solución HPDP-biotina al ARN y mezclar a fondo. Incubar en la oscuridad a 65 grados centígrados durante 15 a 30 minutos.
A continuación, prepare una pequeña columna de exclusión de tamaño y volumen de resina para excluir la biotina no incorporada. Retire la etiqueta inferior de la columna, afloje la tapa y coloque la columna en un tubo centrífugo de dos mililitros. Centrifugar a 1.500 veces g durante un minuto para vaciar el búfer y descartar el flujo a través.
A continuación, agregue suavemente 0,3 mililitros de TE a la parte superior de la columna y vuelva a girar utilizando las mismas condiciones. Transfiera la columna lavada a un tubo fresco de 1,5 mililitros. Una vez completada la incubación de la muestra, agregue la muestra a la parte superior de la columna.
Centrifugar a 1.500 veces g durante dos minutos, dejando la muestra de ARN biotinilado en la parte inferior del tubo. Deseche la columna. Y agregue 1/3 a 1/2 volumen de cloruro de litio molar 10 al tubo que contiene la muestra.
Mezclar para volver a precipitar el ARN. En primer lugar, vuelva a disolver el ARN en 200 microlitros de agua tratada con DEPC. Mida la concentración de ARN y calcule los volúmenes para cada muestra que darán cantidades iguales de ARN para todas las muestras.
Agregue esta cantidad de ARN a un tubo fresco y agregue agua tratada con DEPC hasta un volumen total de 200 microlitros. Cuando una muestra esté a temperatura ambiente, agregue 25 microlitros de 10 x tampón NaTM, 25 microlitros de un fosfato sódico molar y 2,5 microlitros de 10%SDS. Mezcle bien y centrifugar suavemente a aproximadamente 100 g durante menos de 30 segundos.
Prepare dos mililitros de tampón de perlas para cada muestra con un tampón NaTM x, fosfato sódico molar de 0,1 y 0,1%SDS. Añadir 50 microlitros de perlas de estreptavidina a un tubo de retención baja de 1,5 mililitros. Coloque el tubo en el bastidor magnético y espere a que las perlas se asienten.
Luego, retire el líquido por aspiración. Para lavar las perlas, agregue 200 mililitros de tampón de cuentas y vórtice hasta que el pellet de cordón se resusppend. Centrifugar el tubo aproximadamente 100 veces g durante un máximo de cinco segundos.
Coloque el tubo en el bastidor magnético para permitir que las perlas sean capturadas por el imán. Retire el líquido por aspiración si hay un pequeño número de muestras. Vierta el líquido y luego aspire si hay muchas muestras.
Bloque con 200 microlitros de tampón de perlas, 10 microlitros de glucógeno y 2,5 microlitros de ARN. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos mientras giras de extremo sobre extremo a velocidad moderada. Después de esto, retire el líquido y lave de nuevo, como se describe en el protocolo de texto.
Resuspender las perlas en la muestra, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras gira. Durante esta incubación, prepare un tubo fresco de 1,5 mililitros para cada muestra. Añadir 1/10 volumen de tres molares de acetato de sodio a pH 5,3 y 20 microgramos de glucógeno.
Centrifugar aproximadamente 100 veces g durante tres segundos. Retire el ARN sin enlazar de las cuentas y lávelos como se describe en el protocolo de texto. Para eluir el ARN, añadir 50 microlitros de 0.7 molar beta mercaptoethanol a las cuentas.
Después del vórtice y la centrifugación, coloque la suspensión en el bastidor magnético. Pipetear el ARN que contiene la solución en los tubos de centrífuga de 1,5 mililitros preparados. Elute una vez más como se describió anteriormente.
A continuación, vuelva a colocar la muestra en el bastidor magnético para eliminar las perlas residuales del ARN eluido y transfiera el líquido a un tubo de centrífuga de 0,5 mililitros de unión baja y fresco. Mezcle la muestra. Y luego añadir 2.5 volúmenes de etanol para precipitar nsRNA.
Después de mezclar e incubar, centrifugar a una velocidad de al menos 13.000 veces g y a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Los rendimientos típicos de snRNA recuperados mediante este protocolo se muestran aquí. Tenga en cuenta que la recuperación de ARN en el punto de tiempo cero es una porción muy pequeña de la que se recuperó de puntos de tiempo más largos con sólo 0,3 microgramos de ARN que se recuperan de aproximadamente 30 mil millones de células.
Después de sólo 30 segundos de etiquetado, sin embargo, más del doble de ARN se recoge del mismo número de células. En el rastro del bioanalyzer, nuestros precursores de ARN pueden ser vistos como un pico cercano a 1.000 nucleótidos y un doblete de picos en 1.700 a 1.800 nucleótidos. La abundancia de estos intermedios aumenta a medida que continúa la tiolación.
A continuación, la tiolación se realiza con muestras que se toman a intervalos de 15 segundos desde el inicio del tio-etiquetado y se supervisa el procesamiento de la transcripción de ARN ACT1. Como se puede ver pre-mRNA y lariats se generan incluso después de sólo 15 segundos de etiquetado. Después de unos 45 segundos a un minuto, la cantidad de lariats y pre-mRNA alcanzan el equilibrio con la mayor parte de estas especies de ARN que se crean por transcripción como se procesan lejos por empalme.
Los pasos más difíciles son aquellos que involucran las cuentas, lavado y bloqueo. Tenga cuidado de no perder las cuentas, o dejar que se sequen. Una vez que haya purificado el ARN recién sintetizado, puede utilizar cualquier procedimiento de análisis de ARN tradicional.
Se recomienda que ejecute el ARN en un bioanalizador o similar. Después de eso, normalmente usamos QPCR y RNA-Seq para analizar el ARN. Este método resultó ideal para analizar la cinética del procesamiento de ARN.
Los pasos más peligrosos son los que utilizan fenol y cloroformo en la extracción de ARN. Cada vez que use estos productos químicos en un recipiente sin sellar, hágalo en una campana de humos y use ropa protectora apropiada, un abrigo de laboratorio y guantes. Tenga especial cuidado de que no haya perlas de circonio en el hilo del tubo de la tapa del tornillo, ya que eso conducirá a una fuga.
