Gostaríamos de agradecer a Amie Regan para a leitura cuidadosa do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por NGFN Além disso concessão # 01GS0801, MRC bolsista G1002523 e NHSBT concessão WP11-05 para LD e DFG concessão FR2938/1-1 para CCF

1. Marcação metabólica com 4-tiouridina Faça um plano detalhado da instalação experimental / programação, por exemplo, quando adicionar o 4SU para cultura de células e quando a colheita das amostras. Plano de pelo menos 5 minutos entre cada condição. Apenas o tratamento de células de uma condição de cada vez. Lidar com máx. 3-5 pratos em um determinado momento. Pega células tão rapidamente quanto possível, para minimizar as alterações nos níveis de temperatura e de CO 2. Evite expor as células à luz brilhante após 4SU é adicionado como isso pode resultar em crosslinking de RNA 4SU-rotulados para proteínas celulares. Início da rotulagem <ol><li> Thaw 4 tiouridina (4SU) imediatamente antes da utilização e pipeta quantidade necessária de 4SU para cada condição em um tubo Falcon estéril. </li><li> Tome a quantidade necessária de meio de cultura celular (5 ml por 10 centímetros prato) fora os pratos e adicionar ao tubo Falcon 4SU contendo e misture bem. Remova e descarte o meio restante dos pratos. </li> &lt;li&gt; Aplicar 4SU contendo meio de volta para os pratos. </li></ol> Fim de etiquetagem <ol start="4"><li> Remova o meio de cultura de células a partir de células. Adicionam-se 5 ml de reagente Trizol para cada placa. Para as experiências de complexos, incluindo vários pontos de tempo ou condições, este passo é melhor realizado por duas pessoas, uma remoção do meio, a adição de outro reagente Trizol e colheita do ligado. </li><li> Incubar durante 5 min a temperatura ambiente durante a lise celular completa. </li><li> Usar uma pipeta de 10 ml para enxaguar a placa cuidadosamente com o Trizol adicionado. Isto ajuda a lise celular completa e a recuperação da amostra. Manusear com cuidado como Trizol é extremamente perigoso quando entrar em contato com a pele ou com os olhos! Tem antídoto para queimaduras de fenol na mão (por exemplo, polietileno glicol 300 ou 400 em álcool etílico industrial (70:30)). Transferir as amostras para tubos de polipropileno. Por favor, note que os tubos Falcon padrão não resistir a essas forças de G). As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C durante pelo menos um mês até RNA total is preparados. </li></ol> 2. Preparação de RNA Utilizando Modificado Trizol Protocolo <ol><li> Adicione 1 ml de clorofórmio (0,2 ml por ml Trizol) e agitar vigorosamente por 15 segundos. Incubar à temperatura ambiente durante 2-3 minutos. </li><li> Centrifugar a 13.000 × g durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Transferir fase superior aquosa (contendo o ARN) para um novo tubo de 15 ml de polipropileno. </li><li> Adicionar ½ volume de reacção de ambos os ARN precipitação tampão e isopropanol (por exemplo, a 3 ml de sobrenadante adicionar 1,5 ml de tampão de precipitação de ARN e 1,5 ml de isopropanol). </li><li> Misturar bem. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Centrifugar a 13.000 × g durante 10 min a 4 ° C. Elimine o sobrenadante. </li><li> Girar brevemente (5.000 × g por 30 segundos) e remova isopropanol residual com uma pipeta de 200 mL. </li><li> Adicionar um volume igual de etanol a 75% e agitar até que o tubo destaca pelete. Evite dividi-lo em pequenos pedaços, pois isso pode fazer a remoção de residual etanol difícil. </li><li> Centrifugar a 13.000 × g durante 10 min a 4 ° C. Elimine o sobrenadante. </li><li> Girar RNA brevemente e remover o etanol restante com uma pipeta de 200 mL. Repita o passo e remover o etanol restante com uma pipeta de 20 mL. Depois destas duas etapas, sem posterior secagem do sedimento deverá ser executado. </li><li> Adicionar 100 mL de H 2 O para 100 ug de RNA rendimento esperado e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo 5-6 vezes para ajudar na dissolução do RNA. </li><li> Dissolver e desnaturar ARN por aquecimento a 65 ° C durante 10 minutos (agitador) e colocar imediatamente em gelo. </li><li> Medir a concentração de RNA a 260 nm usando um espectrofotómetro NanoDrop, seguindo as instruções do fabricante. Este ARN pode ser armazenada a -80 ° C durante pelo menos um mês. </li></ol> 3. A biotinilação específica do tiol de RNA recentemente transcrito <ol><li> Comece com 60-80 ug de RNA celular total. </li><li> Constituem etiquetagem reacção. Pipeta no seguinteordem (RNA por ug): <ol class="lalpha"><li> 1 ul de tampão 10x Biotinilação </li><li> 7 ul do RNA (contendo 1 ug de RNA diluídas sem nuclease H2O) </li><li> 2 ul biotina-HPDP (1 mg / mL de DMF) </li></ol></li></ol> Sempre adicione a biotina-HPDP último e misture imediatamente por pipetagem. No caso da biotina precipita, o conteúdo de DMF pode ser aumentada para uma concentração final de 40%. <ol start="3"><li> Incubar à temperatura ambiente durante 1,5 horas, com rotação. </li><li> Adicionar um volume igual de clorofórmio. Misture vigorosamente. Incubar durante 2 - 3 minutos, até as fases começam a separar-se e as bolhas começam a desaparecer. </li><li> Centrifugar a 20.000 × g durante 5 min a 4 ° C. Transferir cuidadosamente a fase aquosa superior num novo tubo. </li><li> Repita os passos 3.4 e 3.5 uma vez. Você pode querer realizar esta etapa em 2 mL da fase de bloqueio Gel tubos pesados ​​para reduzir a perda de RNA. </li><li> Precipitação do RNA: adicionar 1/10 do volume de NaCl 5 M e um volume igual deisopropanol à fase aquosa. </li><li> Centrifugar a 20.000 × g durante 20 min a 4 ° C. Elimine o sobrenadante. </li><li> Adicionar um volume igual de 75% de etanol, de centrifugação a 20.000 x g durante 10 min a 4 ° C, desprezar o sobrenadante. </li><li> Girar brevemente e remover o etanol residual, com uma pipeta de 200 uL. </li><li> Girar brevemente e remover o etanol residual com pipeta 20 ul. </li><li> Não permitir que o RNA para secar. Re-suspende-lo em 50-100 ul de H2O (~ 1 mL por 1 jig de RNA). Misture bem por pipetagem cima e para baixo 5-6 vezes. </li><li> Verifique a qualidade da RNA por análise eletroforética para excluir a degradação do RNA. </li></ol> 4. Dot Blot Análise de 4SU-incorporação (Opcional) 4SU ​​incorporação pode ser facilmente determinada por meio de análise de ARN biotinilados dot blot. Este é um passo opcional que permite a resolução de problemas ea estimativa das taxas de incorporação 4SU relação a um controle oligo biotinilado DNA. Para este ensaio nós recommend usando iodoacetil-biotina em vez de biotina-HPDP para biotinylation de RNA 4SU-rotulados no passo 3.2. Isso resulta em uma biotinilação irreversível de 4SU-RNA. Assim, os métodos baseados em colunas (por exemplo RNeasy) pode ser usado para a recuperação de quantidades muito pequenas de RNA biotinilado (por exemplo, 5 mg). Enquanto o RNA biotinilado utilizando biotina-HPDP também é adequado para este ensaio, o sinal resultante é mais fraca e a razão sinal-ruído menos favorável (Figura 3). <ol><li> Siga o protocolo para 4SU a rotulagem e isolamento de RNA total de celulares, conforme descrito nas seções 1 e 2. </li><li> Biotinylate 4SU marcado RNA, conforme descrito na seção 3 substituindo biotina-HPDP com iodoacetil-biotina e fazer duas extrações clorofórmio para remover completamente o excesso de resíduos iodoacetil-biotina. </li><li> Recuperar ARN biotinilados por precipitação de isopropanol / etanol, como descrito, ou usando uma abordagem baseada em coluna (por exemplo, RNeasy) no caso de pequenas quantidades de RNA (&lt;10 ug) São utilizados. </li><li> Incubar a membrana Zeta em água livre de nuclease, com balanço, durante 10 min. </li><li> Aqui a membrana para fora da água sem nuclease e remover fluidos excessivos pela colocação da membrana entre duas toalhas de papel limpas e pressionando firmemente. Secagem ao ar da membrana durante 5 min irá resultar em pontos mais agradáveis. </li><li> Para cada amostra, preparar 20 ul de RNA de 200 ng / mL, utilizando tampão de ligação de ponto de gelo mancha fria (NaOH 10 mM, EDTA 1 mM). Aplicar 5 ul desta diluição (isto é, 1 mg de RNA), assim como três diluições de 10 vezes subsequentes (isto é, 100, 10 e 1 ng de ARN, respectivamente) para a membrana Zeta por pipetagem. Pipetagem através de uma prateleira vazia de ponteiras podem ser empregues para proporcionar o espaçamento uniformemente distribuída. Alternativamente, o uso de um aparelho de dot blot de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Aplicar 5 ul do DNA marcado com biotina-oligo em concentrações variando entre 20 ng / mL e 20 pg / mL (isto é, 100-0,1 ng oligo) cont como positivarol à membrana por pipetagem. Use uma amostra 4SU ingênuo biotinilado como controle negativo. </li><li> Ar seco a membrana por 5 min. </li><li> Incubar a membrana durante 30 minutos em 40 ml de tampão de bloqueio com agitação. </li><li> Incubar a membrana com 10 ml de 1:1000 de estreptavidina-peroxidase de rábano silvestre durante 15 min (5 ml de PBS + 5 ml de SDS a 20% + 10 ul de estreptavidina-peroxidase de rábano silvestre) </li><li> Lavar membrana duas vezes em 40 ml de PBS + 10% de SDS (20 ml de PBS + 20 ml de SDS a 20%) durante 5 min. </li><li> Lavar membrana duas vezes em 40 ml de PBS + 1% de SDS (38 ml de PBS + 2 ml SDS a 20%) durante 5 min. </li><li> Lavar membrana duas vezes em 40 ml de PBS + 0,1% de SDS (40 ml de PBS + 200 ul de 20% SDS) durante 5 min. </li><li> Remover o líquido excessivo, colocando membrana entre duas toalhas de papel limpo e pressionando-os firmemente. </li><li> Visualize ligada à membrana HRP utilizando ECL acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Colocar a membrana em folha de plástico / saco, remover as bolhas de ar e incubar durante 2 min no escuro. </li><li> Expor membranafilme por 1-5 min. </li></ol> 5. Separação de RNA etiquetados e não etiquetados Usando revestidas de estreptavidina Magnetic Beads <ol><li> Calor tampão de lavagem (3 ml por amostra) a 65 ° C num banho de água. </li><li> Prepare ditiotreitol fresco 100 mm (TDT) em nuclease livre de H 2 O. Fazê-lo por decantação 15 - 30 mg de pó de DTT em um ambiente limpo 50 ml tubo Falcon colocado na escala ultra-fino. Pesar e adicionar a quantidade necessária de livre de nuclease de H 2 O. </li><li> Calor biotinilado amostras de RNA a 65 ° C durante 10 minutos para desnaturar e colocar imediatamente em gelo. </li><li> Lugar μMacs colunas no suporte magnético. Recomenda-se não processar mais de 12 amostras de cada vez (6-8 amostras são ideais). </li><li> Colunas Miltenyi pré-equilibrar com 1 ml a temperatura ambiente tampão de lavagem. Isso levará cerca de 15 min. </li><li> Enquanto isso, adicionar 100 ul de pérolas de estreptavidina a 50-100 ul de ARN biotinilados. Incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos com rotação. </li> &lt;<html> li&gt; Se qualquer uma das colunas não iniciou o escoamento até agora isto pode ser facilitado por pressionando suavemente sobre o topo da coluna com um dedo de luva. Uma vez que o fluxo começou as colunas drenar rapidamente. </li><li> Aplicar o ARN / contas às colunas. Descarte o flow-through, a menos que você deseja recuperar a fração de RNA não marcado (ver secção 7). </li><li> Lavar três vezes com 0,9 ml de 65 ° C, tampão de lavagem (1 ml ponteiras encolher quando pipetagem tampões a 65 ° C). </li><li> Lavar três vezes com 0,9 ml de tampão de lavagem à temperatura ambiente. </li><li> Pipetar 700 ul tampão RLT (RNeasy kit MinElute limpeza, Qiagen) para novos tubos de 2 ml e colocá-los sob as colunas. </li><li> Eluir os transcritos de RNA recentemente no buffer RLT pela adição de 100 ul de 100 mM de DTT para as colunas. </li><li> Realizar uma segunda ronda de eluição de 3 min mais tarde no mesmo tubo, adicionando mais 100 ul de 100 mM de DTT. </li></ol> 6. A recuperação de ARN recentemente transcrito onte ú &quot;&gt; Continuar com o Cleanup MinElute RNeasy (Qiagen) protocolo seguindo as instruções do fabricante. Elute em 25 ul de duas concentrações livre de nuclease H O. Medida RNA usando um espectrofotômetro Nanodrop. Para evitar a necessidade de descongelar e voltar a congelar RNA antes da apresentação para um ensaio de elevado débito, recomendamos preparar ADNc imediatamente após o RNA recentemente transcrito é purificado. Use 2,5 ul de RNA recentemente transcrito em 20 ul da mistura de síntese de cDNA para a síntese de cDNA, seguindo as instruções do fabricante. realizar os controlos de qRT-PCR utilizando um : 10 diluições da mistura de cDNA de RNA Armazenar a -80 ° C.. 7. Recuperação de, consolidado ARN não marcado (Opcional) Caso o RNA não ligado tem de ser recuperado, recolher e combinar o fluxo através de (após a adição da solução de pérolas de estreptavidina-RNA às colunas) e a primeira lavagem para a precipitação subsequente. Normalmente, é suficiente para precipitar apenas 50% do ARN não ligado como this vai conter&gt; 80% do material de partida. <ol><li> Adicionar um volume igual de isopropanol (sem sal deve ser adicionado como o tampão de lavagem já contiver um M de NaCl). </li><li> Centrifugar a 20.000 × g durante 20 min a 4 ° C. Elimine o sobrenadante. </li><li> Adicionar um volume igual de 75% de etanol, de centrifugação a 20.000 x g durante 10 min a 4 ° C, desprezar o sobrenadante. </li><li> Girar brevemente e remover o etanol residual, com uma pipeta de 200 uL. </li><li> Girar brevemente e remover o etanol residual com pipeta 20 ul. </li><li> Não permitir que o RNA para secar. Ressuspender em 100 ul de H2O Misture bem por pipetagem cima e para baixo 5-6 vezes. Incubar a 65 ° C durante 10 min com agitação e transferir directamente em gelo. </li><li> Verifique a qualidade da RNA por análise eletroforética para excluir a degradação do RNA. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Marcação metabólica de RNA recém-transcrita aumenta substancialmente o poder das tecnologias de alto rendimento, como microarrays e RNA-seq, fornecendo modelos mais adequados para lidar com a questão biológica de interesse. O presente protocolo foi extensivamente otimização. Ele permite o enriquecimento&gt; 1.000 vezes maior de RNA recentemente transcrito e proporciona resultados altamente reprodutíveis. O delineamento experimental do experimento 4SU-tagging é de crucial importânc...

Perfil de expressão gênica é uma ferramenta chave usada para estudar os processos celulares e da rede complexa interação associado. Estudos sobre a abundância de ARNm foram tipicamente o método de escolha para obter conhecimentos básicos sobre os mecanismos moleculares subjacentes. O desenvolvimento de microarrays de todo o transcriptoma 1 e, mais recentemente, o sequenciamento de próxima geração de RNA (RNA-seq) 2-4 alimentou esta abordagem. Embora estas tecnologias revolucionaram nossa compreensão da complexidade da expressão gênica celular, eles enfrentam grandes limitações devido às propriedades intrínsecas de sua amostra do modelo, ou seja, de RNA celular total. Primeiro, as variações a curto prazo nos níveis de ARN total não coincidem alterações nas taxas de transcrição, mas é inerentemente dependente do ARN de semi-vida dos respectivos transcritos. Enquanto uma indução quíntupla de uma transcrição de curta duração, por exemplo, que codifica para um factor de transcrição, serão facilmente detectável no ARN totaldentro de uma hora, a mesma indução de uma transcrição de longa duração, por exemplo, codificação de uma enzima metabólica, ficará praticamente invisível. Além disso, mesmo uma paragem completa (&gt; 1000 vezes down-regulation) na taxa de transcrição de um gene da média com um ARN de semi-vida de cinco horas simplesmente demorar cinco horas para os seus níveis de RNA total de apenas diminuirá duplo . Assim, a análise do RNA total de favorece a detecção de sobre-regulação de transcritos de vida curta, muitos dos quais codificam para factores de transcrição e de genes com funções reguladoras 5. Além disso, a cascata está obscurecido cinética verdadeira de regulação e os eventos de sinalização primários não pode ser diferenciado do secundário. Ambos, por sua vez, pode resultar em viés substancial nas análises a jusante da bioinformática. Em segundo lugar, as alterações nos níveis de ARN total não pode ser atribuída a alterações na síntese de RNA ou deterioração. Medidas deste último requer abordagens invasivos de células, por exemplo, bloqueadores transcriptisobre o uso de actinomicina D 6, e monitorização da deterioração contínua estendida ao longo do tempo de RNA. Com um ARNm de semi-vida média das células de mamífero de 5 - 10 horas 5,7, níveis de ARNm da maioria dos genes somente terão diminuído de menos de duas vezes após várias horas de detenção transcripcional. Estas diferenças relativamente pequenas resultar em medições grosseiramente imprecisas de ARNm de semi-vida para a maioria dos genes celulares, devido à natureza exponencial das equações matemáticas subjacentes. Finalmente, enquanto que o RNA-seq de ARN celular total mostrou que aproximadamente metade dos nossos genes estão sujeitos a eventos de splicing alternativos 8, a cinética subjacentes, bem como os mecanismos dinâmicos orientadores de tecidos e específicos de regulação do contexto de processamento de ARN permanecem pouco compreendidos. Além disso, a contribuição de processamento do RNA para a expressão diferencial de genes, em particular para RNAs não-codificantes, permanece a ser determinada. Ao todo, estas limitações representam grandes obstáculos paramodelagem cinética bioinformática dos mecanismos moleculares subjacentes. Recentemente, desenvolveu uma abordagem, o perfil de expressão do gene denominado de alta resolução, para ultrapassar estes problemas 5,7,9. Baseia-se na marcação metabólica de RNA recém transcrito usando 4 tiouridina (4SU-tagging), um derivado uridina que ocorre naturalmente, e oferece acesso directo às transcrições recém-transcritos com o mínimo de interferência no crescimento celular e expressão gênica (ver Figura 1) 5, 10-12. A exposição das células eucarióticas a resultados 4SU na sua absorção rápida, a fosforilação de 4SU-trifosfato, e incorporação de RNA recentemente transcrito. Após isolamento do RNA celular total, a fracção de ARN marcado é 4SU-tiol especificamente biotinilados gerar uma ligação de dissulfureto entre a biotina e os transcritos de RNA recentemente. &quot;Total RNA celular&quot;, então pode ser quantitativamente separados em rotulada (&#39;recentemente transcrito&#39;) e não marcado (&quot;pré-existing &#39;) ARN com elevado grau de pureza usando esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. Finalmente, o ARN marcado é recuperado a partir das pérolas por simples adição de um agente redutor (por exemplo ditiotreitol) a clivagem da ligação dissulfureto e libertação do ARN recém transcritos a partir das pérolas. RNA recém transcrito retrata a atividade transcricional de cada gene, durante o período de exposição 4SU. 4SU-tagging na escala de tempo de minutos, portanto, fornece um retrato instantâneo da expressão gênica eucariótica e um modelo ideal para a jusante análises de bioinformática (por exemplo, análise de promotor). Nos casos em que as condições de estado estacionário pode ser assumidas, os índices de recém-transcrita / total, o recém-transcrito / sem rótulo e sem rótulo / RNA total de proporcionar o acesso não-invasivo para RNA precisos meia-vida 7,13. Além disso, é importante notar que os transcritos de RNA recentemente purificados após tão pouco como 5 minutos de 4SU-marcação (5 min 4SU-RNA) é menor que 15 e 60 min 4SU-RNA.Ao realizar tanto ultra-curtos e progressivamente mais 4SU-tagging em uma única configuração experimental combinado com RNA-seq, a cinética de processamento de RNA são revelados na resolução de nucleotídeos 9. Finalmente, as análises de curso de tempo de RNA recém transcrito e total combinado com modelagem computacional permitem uma análise integrativa da síntese de RNA e decadência 14. Em conclusão, esta abordagem permite a análise direta da dinâmica da síntese de RNA, processamento e degradação em células eucarióticas. É aplicável em todos os principais organismos modelo, incluindo mamíferos, insetos (Drosophila), anfíbios (Xenopus) e levedura 5,15,16. Ele é diretamente compatível com a análise de microarray 5,17, RNA-seq 9,13,14, e é aplicável in vivo 12,15. Aqui, vamos detalhar a metodologia de rotular, isolar e purificar RNA recém transcrito em células de mamíferos cultivadas. Além disso, potenciomêtroproblemas ai e armadilhas são discutidos.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-thiouridine</td>
 <td>Carbosynth</td>
 <td>T4509</td>
 <td>Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 &deg;C in aliquots of 50-500 &mu;l, discard unused reagent, do not refreeze.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trizol</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)</td>
 <td>WARNING - CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>372978</td>
 <td>WARNING - HAZARDOUS TO HEALTH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isopropanol</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>650447</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate, nuclease-free</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C8532</td>
 <td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5M nuclease-free NaCl</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>71386</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free H2O</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>W4502</td>
 <td>Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNA precipitation buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>459844</td>
 <td>Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>51237</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15575-020</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Biotinylation Buffer (BB)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylformamide (DMF)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-Link biotin-HPDP</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>21341</td>
 <td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &deg;C in aliquots of 1 ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0032 005.152</td>
 <td>Optional for the chloroform extraction step.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zeta membrane</td>
 <td>BIORAD</td>
 <td>162-0153</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Dot blot binding buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM NaOH, 10 mM EDTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-oligo</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>5'-biotin, 25 nucleotides, any sequence</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium dodecyl sulphate</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BPE9738</td>
 <td>For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 &deg;C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>21333</td>
 <td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &deg;C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate buffer saline</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>10010-015</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dot blot blocking buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin-horseradish peroxidase </td>
 <td>Vector Laboratories</td>
 <td>SA5004</td>
 <td>Store at -20 &deg;C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 &mu;l Streptavidin-HRP before use. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ECL reagent</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>RNP2109</td>
 <td>Use following the manufacturer's instructions.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super RX, X-RA Film, 18x24 cm</td>
 <td>Fujifilm</td>
 <td>47410 19236</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&mu;Macs Streptavidin Kit</td>
 <td>Miltenyi</td>
 <td>130-074-101</td>
 <td>Store the beads at 4 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P1379</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Washing buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol (DTT)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>43817</td>
 <td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Store columns at 4 &deg;C, remaining components of the kit at room temperature.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>72.692.005</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>72.694.005</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352096</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV/VIS spectrophotometer</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>NanoDrop 1000</td>
 <td>Or equivalent. Use low volume (1-2 &mu;l) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polypropylene 15 ml centrifuge tubes</td>
 <td>VWR International</td>
 <td>525-0153</td>
 <td>In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 &times; g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Avanti J-25</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JLA-16250</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adaptors for 15 ml tubes</td>
 <td>Laborger&auml;te Beranek</td>
 <td>356964</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated table-top centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5430 R</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>Thermomixer compact</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic stand</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>130-042-109</td>
 <td>One stand holds 8 &mu;Macs columns.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waterbath</td>
 <td>Grant</td>
 <td>SUB Aqua 5</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultra-fine scale</td>
 <td>A&amp;D</td>
 <td>GR-202</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-Gel iBase Power System</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>G6400UK</td>
 <td>For RNA gels; or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>G4020-01</td>
 <td>For RNA gels; or equivalent.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

metabolic labeling of newly transcribed rna for high resolution gene expression profiling of rna synthesis, processing and decay in cell culture

O desenvolvimento de microarrays de todo o transcriptoma e sequenciamento de próxima geração que revolucionou a nossa compreensão da complexidade da expressão gênica celular. Juntamente com uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos, medições precisas da cinética subjacentes tornaram-se cada vez mais importante. Aqui, essas metodologias poderosas enfrentam grandes limitações devido às propriedades intrínsecas das amostras de modelos que estudam, ou seja, total de RNA celular. Em muitos casos, mudanças de RNA celular total de ocorrer ou muito devagar ou rápido demais para representar os eventos moleculares subjacentes e sua cinética com resolução suficiente. Além disso, a contribuição de alterações na síntese de ARN, o processamento, e da deterioração não são facilmente diferenciados. Recentemente, desenvolveu perfis de alta resolução expressão gênica para superar essas limitações. A nossa abordagem baseia-se na marcação metabólica de RNA recentemente transcrito com 4-thiourijante (portanto também designado por 4SU-tagging) seguido por purificação rigorosa do ARN recém transcritos usando biotinilação específica do tiol e as esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. A técnica é aplicável a uma ampla gama de organismos, incluindo vertebrados, Drosophila e levedura. Foram aplicados com sucesso 4SU codificação para estudar a cinética em tempo real das actividades de factor de transcrição, proporcionar medições precisas da RNA meia-vida, e obter novos conhecimentos sobre a cinética de processamento do ARN. Finalmente, a modelagem computacional pode ser empregue para gerar uma análise global integrado dos mecanismos moleculares subjacentes.

1. Material de Partida e os rendimentos esperados Após 1 hora (hr) de 4SU-exposição de RNA recentemente transcrito representa cerca de 1-4% do RNA celular total. Esta será mais baixa em células de crescimento a ser preso em que já não conta para sintetizar o RNA para o crescimento celular / replicação. Quando a rotulagem por 1 hr, recomendamos iniciar o ensaio com 60-80 mg de RNA total. Começando com menos de 30 ug de RNA total de resultados em peletes pequenas de RNA que são difíce...

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Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

RNA celular total fornece um modelo pobre para estudar mudanças de curto prazo na síntese de RNA e decadência, bem como a cinética de processamento de RNA. Aqui, descrevemos a marcação metabólica de RNA recentemente transcrito com 4-tiouridina seguido por biotinilação específica do tiol e a purificação do ARN recém transcritos que permitam ultrapassar estas limitações.

Marcação metabólica de RNA recém-transcrita para alta resolução Gene Expression Profiling de síntese de RNA, Processamento e Decay em cultura de células

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

metabolic-labeling-newly-transcribed-rna-for-high-resolution-gene

Research

JoVE Journal

Biology

26.9K visualizações.  Max von Pettenkofer Institute. RNA celular total fornece um modelo pobre para estudar mudanças de curto prazo na síntese de RNA e decadência, bem como a cinética de processamento de RNA. Aqui, descrevemos a marcação metabólica de RNA recentemente transcrito com 4-tiouridina seguido por biotinilação específica do tiol e a purificação do ARN recém transcritos que permitam ultrapassar estas limitações.

Vídeo: Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture