La principal ventaja de esta técnica es que refleja la actividad del ARN polimerasa II midiendo el ARNm recién sintetizado que no están influenciados por la degradación del ARN. Este protocolo se describió originalmente mediante hibridación de microarray, pero se puede adoptar fácilmente para una secuenciación a través del ARNm recién transcrito. Demostrar este procedimiento estará Tiago Baptista, un ex estudiante de posgrado de nuestro laboratorio.
Después de inocular las células de S.cerevisiae, cultivarlas durante la noche a 30 grados Celsius con agitación constante a 150 RPM. Al día siguiente, mida la densidad óptica a 600 nanómetros. Diluir el cultivo a un OD600 de aproximadamente 0,1 en 100 mililitros de medio YPD.
Crecer las células hasta que el OD600 es alrededor de 0.8. Después de esto, medir el OD600 del cultivo de la noche S.pombe. Diluir este cultivo a un OD600 de aproximadamente 0,1 en 500 mililitros de medio YAS y dejar que crezca hasta que el OD600 sea aproximadamente 0,8.
En primer lugar, preparar una solución fresca de dos molares de cuatro tiouracil. Mantenga la solución preparada a temperatura ambiente y protegida de la luz. Añadir la solución de cuatro tiuralolos a los cultivos S.cerevisiae y S.pombe de forma que la concentración final sea de cinco mililitros.
Incubar los cultivos S.cerevisiae y S.pombe a 30 grados centígrados y 32 grados centígrados respectivamente con agitación constante durante seis minutos. Después de esto, retire una pequeña alícuota de cada cultivo y cuente las células usando un contador celular automático o una cámara Neubauer. Centrifugar a 2.500 veces g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos para recoger las células.
Deseche el sobrenadante y lave las células con hielo frío una vez PBS. Centrifugar de nuevo a 2.500 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, resuspender las células en cinco mililitros de hielo frío una vez PBS.
Mezclar las células S.cerevisiae y S.pombe en una proporción de tres a uno. Centrifugar las muestras mezcladas a 2.500 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, retire el PBS y congele las células en nitrógeno líquido.
Almacene la muestra a 80 grados Celsius negativos hasta que esté lista para su uso. Cuando esté listo para continuar, descongele las células sobre hielo durante aproximadamente 20 a 30 minutos. Utilice un kit de extracción de ARN de levadura adaptado para extraer el ARN como se describe en el protocolo de texto.
Después de esto, transfiera el cartucho del filtro al tubo de recogida final. Eluda el ARN con 50 microlitros de agua libre de RNase tratada con DEPC que se precalentaba a 100 grados centígrados. Centrífuga a 16.000 g durante un minuto.
A continuación, utilice 50 microlitros de agua libre de RNase tratada con DEPC precalentada para eluir el ARN de nuevo al mismo tubo. Centrifugar a 16.000 veces g durante un minuto asegurándose de que todo el volumen de la muestra haya pasado a través del filtro. Si no lo ha hecho, centrifugar de nuevo durante un período de tiempo más largo.
Cuando haya terminado, cuantifique y compruebe la pureza de la muestra utilizando el equipo adecuado. Utilice agua libre de nucleasa tratada con DEPC para ajustar la concentración del ARN adquirido anteriormente a dos miligramos por mililitro. Aliquot 200 microgramos de ARN total y calentarlo a 60 grados Celsius durante 10 minutos.
Enfríe inmediatamente sobre hielo durante dos minutos. Agregue 600 microlitros de agua libre de RNase tratada con DEPC. Añadir 100 microlitros de tampón de biotinilación y luego añadir 200 microlitros de biotina HPDP.
Si la solución HPDP de biotina se precipita fuera de la solución, aumente el volumen de DMSO o DMF hasta un 40% del volumen de reacción como se describe en el protocolo de texto. Proteja la muestra de la luz e incubarla a temperatura ambiente con agitación suave durante tres horas. Después de esto, añadir un volumen aproximadamente igual de cloroformo a los tubos y mezclar vigorosamente.
Centrifugar a 13.000 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, transfiera cuidadosamente la fase superior a nuevos tubos de dos mililitros. Añadir una cantidad de cinco cloruros de sodio molar igual a aproximadamente 1/10 del volumen de la muestra.
A continuación, mezcle la muestra. Primero, calienta el ARN biotinilado a 65 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, enfríe las muestras en hielo durante cinco minutos.
Agregue 100 microlitros de cuentas magnéticas recubiertas de Streptavidin al ARN biotinilado. Incubar a temperatura ambiente con ligero temblor durante 90 minutos. Coloque las columnas provistas del kit en el soporte magnético.
A continuación, agregue 900 microlitros de tampón de lavado a temperatura ambiente a las columnas. Aplique la mezcla de cordón de 200 microlitrotro y ARN en las columnas. Recoja el flujo a través en tubos de 1,5 mililitros y luego aplíquelo de nuevo a la misma columna magnética.
Mantenga este flujo a través si es necesario, ya que representa la fracción de ARN sin etiquetar. Para comenzar la validación RT-qPCR de las diferentes fracciones, primero sintetice cDNA como se describe en el texto. A continuación, amplifique el ADNc mediante qPCR en tiempo real utilizando un protocolo estándar.
Los niveles medidos de transcripciones en fracciones purificadas a partir de células de tipo salvaje cultivadas con y sin cuatro tiouracidas confirmaron este procedimiento purifica específicamente el ARN etiquetado. El análisis de la cepa delta spt20 revela que la cantidad de ARN total en estado estacionario no cambia en gran medida o sólo se reduce ligeramente para los genes analizados. Se observan resultados similares para las cepas eliminadas para bre1.
Sin embargo, el análisis del ARN recién transcrito en la cepa delta spt20 revela una disminución de tres a cinco veces en la síntesis de ARNm para todos los genes probados. Mientras tanto, la pérdida de bre1 conduce a una disminución más discreta pero aún visible. Tras el agotamiento inducible de spt7, una subunidad estructural del complejo de la saga, los niveles de ARNm recién transcritos se reducen en una medida similar a la cepa de eliminación.
Cuando los niveles totales de ARN se miden mediante análisis de todo el genoma, sólo unos pocos genes se ven alterados sus niveles de expresión tras la eliminación de spt20 ya sea regulando hacia arriba o regulando hacia abajo. Sin embargo, el análisis del ARN recién transcrito revela que los niveles de más de 4.000 genes se reducen significativamente al menos dos veces al delegar el spt20, lo que sugiere un efecto positivo global de la saga en la transcripción de ARN polimerasa II en levaduras en ciernes. Aunque este método puede proporcionar información sobre la transcripción en Saccharomyces cerevisiae, sólo se aplicó con ligeras variaciones al usar este protocolo, pudimos detectar una disminución global en la síntesis de ARNm que fue compensada por una disminución global en la degradación del ARNm.
