Los autores agradecen al Prof. M. Dietel y Dirk Schumacher por apoyar este trabajo y la lectura crítica del manuscrito. La investigación que lleva a estos resultados ha recibido el apoyo de la Empresa Común de la Iniciativa sobre medicamentos innovadores bajo acuerdo de subvención n ° 115234, recursos de los cuales están compuestos por la contribución financiera del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013) y las empresas EFPIA »en clase contribución. Este trabajo fue apoyado también por el Krebsgesellschaft Berliner (BKG).

El esquema general del experimento, con la preparación de células primarias de un solo tejido de tumor, la caracterización del cultivo celular primario, agotamiento de fibroblastos y de células de clasificación magnética de CD133 + y CD133 - células de melanoma se muestra en la figura 1. 1. Ejemplo de Adquisición <ol><li> Compruebe si la aprobación ética antes de considerar los próximos pasos. </li><li> Preparar un tubo de 50 ml con PBS estéril suplementado con penicilina-estreptomicina al 1% concentración final y entregar a la cirugía o equipo. </li><li> Organizar el transporte rápido de tejido tumoral de la cirugía para laboratorio de cultivo celular a 4 ° C. </li></ol> 2. Preparación de melanoma primarios individuales de células de tejido tumoral <ol><li> Realizar todos los pasos en condiciones estériles. </li><li> Antes de la resección del tumor, se necesita para preparar la mezcla de disociación. 10 ml por mezcla de disociación 2-4 g de tejido se requiere. La mezcla se puede usar immediatamente o almacenado en alícuotas de 10 ml a -20 ° C para su uso posterior. <ol><li> Preparar una solución que contiene 150 mM de cloruro sódico. Mezclar utilizando un vortex hasta que la solución es clara. Si es necesario estéril filtrado solución de cloruro sódico utilizando un filtro de 0,22 micras. </li><li> Pesar DNasa I y preparar una solución que contiene 10 mg / ml de DNasa I en cloruro sódico 150 mM. Mezclar por inversión hasta que la solución es clara. </li><li> Preparar una solución que contiene 100mg/ml de colagenasa IV en PBS. Mezclar por inversión hasta que la solución es clara. Las alícuotas de solución de colagenasa se pueden almacenar a -20 ° C durante varios meses. </li><li> Preparar la mezcla de disociación con una concentración final de 1% de penicilina-estreptomicina, 1 mg / ml de colagenasa IV y 0,1 mg / ml de DNasa I en Quantum medio 263. Mezclar utilizando un vórtice. Opcional: cuando se utiliza tejido de melanoma derivada de la piel Agregar solución de anfotericina B a la mezcla de disociación a una concentración final de 1,5 mg / ml de anfotericina B. </li></ol></li><li> Pre-caliente el reqcantidades uired mezcla de disociación, PBS y medianas Quantum 263 a 37 ° C. </li><li> Place tejido tumoral en una placa Petri estéril. Aspirar solución excesivo del tejido y añadir 500 l mezcla de disociación. Picar en trozos pequeños tumor de 2-4 mm utilizando escalpelos frescos y estériles. </li><li> Transferencia de 2-4 g picado tejido tumoral en un tubo gentleMACS C que contiene 5 ml de mezcla de disociación. Enjuague adicional con placa de Petri 4,5 ml Mezclar y añadir la disociación restantes fragmentos de tejido al tubo gentleMACS C. </li><li> Cerrar gentleMACS tubo C y adjuntarlo al revés sobre la manga de la disociador gentleMACS. Ejecute el programa gentleMACS &quot;h_tumor_01&quot;. </li><li> Separar el tubo gentleMACS C del disociador e incubar la muestra durante 30 min a 37 º C bajo rotación continua usando el Rotor de Tubo MACSmix en la velocidad de ejecución más alta (12 rpm) o bien girando el tubo manualmente cada 5 minutos para resuspender asentadas fragmentos de tejido . </li><li> Conecte gentleMACS tubo C al revés sobre la manga de la camisetaél gentleMACS disociador y ejecutar el programa gentleMACS &quot;h_tumor_02&quot;. </li><li> Separar el tubo gentleMACS C del disociador e incubar la muestra durante 30 min a 37 º C bajo rotación continua usando el Rotor de Tubo MACSmix en la velocidad de ejecución más alta (12 rpm) o bien girando el tubo manualmente cada 5 minutos para resuspender asentadas fragmentos de tejido . </li><li> Adjuntar gentleMACS tubo C al revés sobre el manguito de la disociador gentleMACS y ejecutar el programa gentleMACS &quot;h_tumor_03&quot;. </li><li> Separar el tubo gentleMACS C del disociador, muestra resuspender y aplicar la suspensión de células a un colador de 70 micras celda colocada en un tubo de 50 ml. Si la obstrucción del filtro se produce, se agita la suspensión celular con una punta de filtro estéril hasta que la suspensión completa corrió a través. </li><li> Enjuague filtro de células con 5 ml de medio de Quantum 263. </li><li> Opcional: si usted todavía tiene fragmentos de tejido que quedan en los fragmentos de filtro, se resuspenden en medio Quantum 263 y sembrarlos en un cultivo celular apropiado dish. Incubar fragmentos a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Descartar filtro de células y cerrar el tubo de 50 ml con la suspensión celular digerido. Se centrifuga la suspensión celular durante 5 min a 300 xg y desechar el sobrenadante. </li><li> Opcional: si sedimento celular aparece de color rojo debido a la alta cantidad de eritrocitos preparar 1x glóbulos rojos Solución de Lisis por dilución de 1:10 10x solución en agua doblemente destilada, se resuspende el sedimento de células en 500 l de PBS y añadir 5 ml 1x lisis de glóbulos rojos Solución. Vortex 5 segundos e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Centrifugar durante 5 min a 300 xg y desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células tumorales con Quantum 263 y sembrar las células en matraz de cultivo celular apropiado. Las células tumorales Cultura a 37 º C y 5% de CO 2 y rutinariamente células de paso cuando llegan a 80% de confluencia. </li></ol> 3. Caracterización de cultivos celulares de fibroblastos primarios y agotamiento <ol><li> Analizar cultivo de células primarias fenotípicamente mediante un microscope. </li><li> Cosechar una cantidad pequeña (0,5 x 10 6 células) del cultivo celular primario y realizar RT-PCR con cebadores para neoplásica, melanoma, células madre y los genes marcadores de células del estroma. Los genes más importantes en el análisis son CD90 (marcador de fibroblastos), Tyr (melanoma / marcador de melanocitos), CD133 (marcador de células madre de cáncer), CD83 (marcador de células dendríticas maduras) y un gen de mantenimiento (por ejemplo, HPRT o GAPDH). </li><li> Si el análisis microscópico y alta expresión de CD90 durante la RT-PCR reveló una alta contaminación de la cultura de melanoma primario de fibroblastos, es necesario agotar los fibroblastos utilizando los Fibroblastos MicroBeads Anti-D y columnas de Miltenyi. </li></ol> 4. Clasificación celular magnética de CD133 + y CD133 - Células de Melanoma el uso de columnas LS <ol><li> Preparar tampón MACS que contiene 2 mM EDTA y 5% de FCS en PBS. Mezcla de tampón de inversión y estéril filtrado que utilizan un 0,22 micras Steritop-GP unidad de filtro. Chill buffer 4-8 ° Cy desgasificar antes de usar. </li><li> Pre-caliente Accutase, PBS y medianas Quantum 263 a 37 ° C. </li><li> Lávese 80% de células confluentes con PBS. Añadir la cantidad apropiada de Accutase y se incuba hasta que las células se desprenden de la superficie de cultivo. Recoger las células en un tubo de 50 ml usando medio Quantum 263. </li><li> Determinar el número de células y centrifugar el número necesario de células (Según protocolo Miltenyi de un número máximo de 2 x 10 9 células se pueden cargar por columna LS. Línea celular óptimos números específicos debe determinarse y puede ser considerablemente menor.) Durante 5 min a 300 xg y 4-8 ° C. Aspirar el sobrenadante por completo. </li><li> Resuspender un máximo de 1 x 10 8 células con tampón MACS 350 l (para un mayor número de células ampliar el tampón de MACS siguiente, reactivo FcR bloqueo, CD133/1-Biotin y MicroBeads anti-biotina volúmenes en consecuencia). </li><li> Añadir 100 l de reactivo FcR bloqueo. </li><li> Añadir 50 l CD133/1-Biotin. Mezclar bien usando un vórtice y se incuba a 4-8 ° C fo 10 min. </li><li> Lavar las células mediante la adición de 10 ml de tampón MACS y se centrifuga durante 5 min a 300 xg y 4-8 ° C. Aspirar el sobrenadante por completo. </li><li> Repita el paso de lavado (4,8) </li><li> Resuspender el sedimento celular con 400 l tampón de MACS. </li><li> Añadir 100 ml anti-biotina MicroBeads. Mezclar bien usando un vórtice y se incuba a 4-8 ° C durante 15 min. </li><li> Mientras tanto, preparar el separador MACS para la separación magnética. Conecte QuadroMACS Soporte para separador MACS Multi. Insertar el número requerido de columnas LS con las alas de columna a la parte delantera en el campo magnético de la QuadroMACS. Colocar un filtro de pre-separación (con 30 micras de malla de nylon) en cada columna LS y un tubo de recogida apropiado (15 ml o 50 ml) bajo cada columna. Preparar filtro y la columna de lavado con 3 ml de tampón MACS. Deseche el filtrado. </li><li> Lavar las células mediante la adición de 10 ml de tampón MACS y se centrifuga durante 5 min a 300 xg y 4-8 ° C. Aspirar el sobrenadante por completo. </li><li> Resuspender las células con 500 lMACS amortiguar y aplicar suspensión de células en la columna LS con el filtro pre-separación. </li><li> Lavar tres veces con 3 ml de tampón MACS por columna. Sólo añadir nuevo buffer cuando el depósito está vacío columna. </li><li> El efluente recogido total contiene el no marcado CD133 - fracción celular. </li><li> Deseche el filtro pre-separación, quitar la columna del separador y colocarlo en un tubo de recogida adecuado. </li><li> Aplicar 5 ml de tampón MACS. Inmediatamente enjuagar las células CD133 + etiquetados con firmeza empujando el émbolo en la columna. </li><li> Para aumentar la pureza de la fracción negativa, aplicar suspensión de células en una columna LS nuevo equilibrio, insertado en el QuadroMACS. El efluente contiene el CD133 - fracción. </li><li> Eliminar columnas. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Con el fin de eliminar contaminaciones de eritrocitos de la célula tumoral pellet es muy recomendable el uso de la célula de sangre roja solución de lisis de Miltenyi. Las ventajas de la lisis de los eritrocitos durante la centrifugación en gradiente de Ficoll densidad tradicional son que es más rápido y sencillo. Además, contaminaciones con Ficoll o células rojas de la sangre y la pérdida de las células tumorales se evitan. Cuando se observa el crecimiento de los fibroblastos en el cultivo de células primari...

Melanomas malignos cutáneos son el tipo menos común, pero más mortal de cáncer de piel. Debido a una incidencia cada vez mayor, de alto grado de malignidad y una rápida difusión, los melanomas representan actualmente el 75% de los tumores malignos de la piel relacionados con 1,2 muertes. Además de la extirpación quirúrgica del tumor primario, quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia y combinada de quimioterapia e inmunoterapia del melanoma metastatizado son las estrategias de estado-de-la-arte para el tratamiento de melanoma 3,4. Sin embargo, el melanoma maligno se caracteriza por una mala respuesta a la quimioterapia (5-12%) 5,6, y sólo los que 50-70% de los pacientes con melanoma llevan el gen BRAF V600E beneficio mutación de nuevas y prometedoras terapias específicas como el tratamiento con vemurafenib 7 Para mejorar la supervivencia global, una mejor comprensión de los mecanismos de tumorigénesis melanoma es necesaria. Para el estudio de estos mecanismos en el pasado, bien establecida comercialmentelíneas celulares cialmente disponibles fueron utilizados. Los enfoques más recientes para el estudio de los eventos moleculares de la iniciación y progresión del cáncer utilizan cultivos primarios derivados directamente del tejido tumoral - a los beneficios de soporte estrategia múltiple: El investigador tiene el control completo del paciente y la selección de los tejidos. Las células de la muestra obtenida a partir de tejido tumoral experta seleccionado, se asemejan al tumor con toda su heterogeneidad y los datos de seguimiento del paciente y de una patología detallado está disponible para permitir las características de la cultura de ser comparados con los del tumor original 8. En contraste, el uso de líneas celulares establecidas, como sistemas modelo en la investigación del cáncer se han despertado controversia. Ya en 1987 Osborne et al describieron importantes diferencias biológicas entre MCF-7 líneas celulares de cáncer de mama humanos de diferentes laboratorios 9. Esta inestabilidad genómica y extensa variación en la expresión del ARN durante subcultivo fue confirmed por Hiorns et al. y proporcionaron datos de apoyo para las pruebas de que las líneas celulares evolucionan en la cultura, lo que debilita la importancia directa de dichas culturas establecidas como modelos de cáncer humano 10. Otra consideración importante, que ha sido en gran parte ignorado en los últimos años, es el riesgo de contaminación o crecimiento excesivo de las culturas no relacionadas con &quot;falsas&quot; las células, que se destacó primero hace más de veinte años atrás, demostrando que un gran número de líneas de células HeLa fueron contaminados por células 8,11. La mala interpretación de los datos de las líneas celulares &#39;false&#39; ha salido a la luz recientemente en la literatura de nuevo. Usando una combinación de análisis de ADN y citogenética molecular, MacLeod et al. Reveló que 252 de los nuevos derivados del tumor líneas celulares humanas depositados en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ), casi el 18% se encontró que dentro de una especie o entre especies cruz -contaminantes 12,13. Para evitar estos problemas y para hacer uso de las ventajas mencionadas anteriormente, se decidió establecer bajo pasaje líneas celulares de melanoma de metástasis recién extirpadas. Robustos celulares tecnologías de separación y análisis requieren una sola célula de preparaciones que se genere limitando al mismo tiempo la muerte celular y la destrucción de las proteínas de superficie característicos. Un instrumento de mesa para la disociación automatizado de tejidos en una sola célula de suspensiones es el disociador gentleMACS fabricado por Miltenyi. Cuando se utiliza en combinación con gentleMACS C Tubos y soluciones optimizado disociación, una disociación eficaz y suave de tejido tumoral en un sistema cerrado se logra conservando epítopos antigénicos y la reducción de la pérdida de células. El instrumento ofrece optimizados, programas preestablecidos para una variedad de aplicaciones específicas y las garantías de preparación estandarizada de solo suspensiones de células de tejido de melanoma 14. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Informes recientes revelaron que la mayoría de los tumores albergar una pequeña subpoblación de las llamadas células madre cancerosas (CSC), que presentan exclusivamente iniciadoras del tumor y la capacidad de auto-renovación. La identificación de las células madre de melanocitos que producen en la dermis de la piel llevado a la hipótesis de que estas células podría ser el origen de las células madre cancerosas (CSC) en melanoma ya que la exposición a la radiación UVA puede cebar estas células para la transformación maligna 15. El resultado de tal lesión genética sería células que albergan una combinación de tumor y las características de células madre. Uno de los indicadores clave propuestos para representar a la subpoblación de células madre cancerosas en el melanoma es CD133 16-20. CD133 (también conocido como Prominin 1), un miembro de glicoproteínas transmembrana pentaspan, se expresa en las células madre hematopoyéticas, células progenitoras endoteliales, células madre neuronales y gliales 21-23. La expresión de CD133 se correlaciona conla división celular asimétrica 24, y el epítopo glicosilado de CD133 mostró ser downregulated a la diferenciación celular 25. Recientemente, CD133 + células de melanoma se han mostrado a la auto-renovación y la iniciación del tumor capacidad 19,20. Para estudiar la función de CD133 + putativo melanoma CSC, se ha modificado y optimizado la clasificación celular activado magnético (MACS) Sistema de Miltenyi Biotech para obtener poblaciones altamente enriquecido y viables de CD133 + y CD133 - células. Magnética basado en perlas separación celular permite a una selección negativa, como se muestra por Matheu et al. 26 o selección positiva como se muestra aquí. Durante la selección positiva del tipo de célula diana particular, por ejemplo, las células que expresan CD133, está magnéticamente etiquetados con microperlas, partículas superparamagnéticas 50-nm que están conjugados con anticuerpos altamente específicos contra unantígeno de superficie celular particular. Durante la separación, las células marcadas magnéticamente quedan retenidas dentro de la columna en el campo magnético del separador, mientras que las células no marcadas fluya a través. Después de etapas de lavado, la columna se retira del campo magnético del separador, y las células diana se eluyó de la columna. El LS o columnas MS utilizado durante resultado de la selección positiva en fracciones de células marcadas y no marcadas con alta pureza. Por otra parte, las columnas de LD, que se utilizan para la selección negativa, dan como resultado una pureza ligeramente inferior de la fracción de marcado. Debido a la más denso de su matriz de la velocidad de flujo en estas columnas es menor que resulta en un riesgo más alto de células no marcadas para ser atrapadas en la columna. Columnas LD por lo tanto debe ser utilizado sólo por el agotamiento estricto de una subpoblación de células no deseadas. La selección positiva se puede realizar por medio del etiquetado magnético directo (anticuerpo acoplado a MicroBeads) o indirecta (incubación con MicroBeads tras la incubation con el anticuerpo primario). MicroBeads MACS específicos están disponibles para la selección positiva de numerosos tipos de células de las células tumorales primarias como la próstata o melanoma 27.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reactivo </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> La anfotericina B solución de 250 mg / ml en agua desionizada </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> A2942-50ml </td><td></td></tr><tr><td> anti-fibroblastos microperlas </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> La colagenasa IV </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> DNasa I </td><td> AppliChem GmbH </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS sin Ca, Mg </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> H15-002 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica dihidrato (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS Superior </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> Indirecta CD133 Micro-Bead Kit humano </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-091-895 </td><td> Incluye: CD133 / 1 (AC133)-biotina, MicroBeads anti-biotina y el reactivo de bloqueo FcR </td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina, líquido (100x) </td><td> Invitrogen GmbH </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Quantum 263 </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> Red Cell Lysis Solution Blood (10x) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipo </td></tr><tr> &lt;td&gt; Cell filtro (70 micras) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS C Tubos </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS disociador </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> Separador Soporte multi MACS </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> MACS separación Columnas 25 Columnas LS </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> MACSmix Rotator Tube </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Merck KGaA </td><td> 567440-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Separación Pre-Filtros </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-041-407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> QuadroMACS Separador </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Los filtros de jeringa Rotilabo (0,22 m, PES) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP Filtrar Unidad de 500 ml </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma

A pesar de las opciones de mejora de los tratamientos para el melanoma disponibles en la actualidad, los pacientes con melanoma maligno avanzado todavía tienen un mal pronóstico para la supervivencia libre de progresión y global. Por lo tanto, la investigación traslacional tiene que proporcionar más pruebas moleculares para mejorar las terapias dirigidas para los melanomas malignos. En los últimos mecanismos oncogénicos, relacionados con el melanoma se estudiaron extensamente en líneas celulares establecidas. En el camino a los regímenes de tratamiento más personalizadas basadas en perfiles genéticos individuales, nos proponemos utilizar paciente derivados de las líneas celulares en lugar de líneas celulares genéricos. Junto con los datos clínicos de alta calidad, especialmente en el seguimiento del paciente, estas células serán fundamentales para comprender mejor los mecanismos moleculares de la progresión del melanoma. Aquí reportamos el establecimiento de cultivos de melanoma primario de tejido tumoral fresco disecado. Este procedimiento incluye la disociación de picar carne y el tejido en células individuales, reremoción de contaminación con eritrocitos y fibroblastos, así como cultivo primario y verificación fiable del origen de las células de melanoma. Informes recientes revelan que los melanomas, como la mayoría de los tumores, puerto una pequeña subpoblación de células madre de cáncer (CSC), que parecen alimentar exclusivamente la iniciación del tumor y la progresión hacia el estado metastático. Uno de los marcadores principales de la identificación y el aislamiento CSC en el melanoma es CD133. Para aislar CD133 + células madre cancerosas a partir de cultivos primarios de melanoma, se ha modificado y optimizado la clasificación de células activada por Magnetic (MACS) procedimiento de Miltenyi resultante en clasificación de alta pureza y viabilidad de las células madre cancerosas CD133 + y CD133 - a granel, que pueden ser cultivadas y analizadas funcionalmente a partir de entonces.

Preparación de un solo células de tejido tumoral La Figura 2 es un ejemplo de una metástasis de ganglio linfático resecado de un paciente melanoma en etapa tardía antes (A) y después (B) la disociación mecánica en piezas 2-4 mm. Después de la disociación enzimática del tejido y filtración a través de una malla de 70 micras de nylon, las células se sedimentaron y se descartó el sobrenadante. En este paso se observó una elevada contaminación con eritrocitos como ...

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Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

En este artículo se describe la preparación de tejido de melanoma recién obtenido en cultivos de células primarias, y cómo eliminar contaminaciones de los eritrocitos y los fibroblastos de las células tumorales. Por último, se describe cómo CD133<sup&gt; +</sup&gt; Supuestas células madre de melanoma se ordenan desde el CD133<sup&gt; -</sup&gt; Granel usando magnética Clasificación de células activadas (MACS).

Paciente celulares derivadas Cultura y aislamiento de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativos células madre del cáncer de melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

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Research

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Medicine

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

21.1K vistas.  Charité - Universitätsmedizin Berlin. En este artículo se describe la preparación de tejido de melanoma recién obtenido en cultivos de células primarias, y cómo eliminar contaminaciones de los eritrocitos y los fibroblastos de las células tumorales. Por último, se describe cómo CD133 + Supuestas células madre de melanoma se ordenan desde el CD133 - Granel usando magnética Clasificación de células activadas (MACS).

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Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

El aislamiento de núcleos de cardiomiocitos a partir de tejidos post-mortem

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Investigación

Medicina

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

El aislamiento de las células madre del cáncer de muestras de cáncer de próstata humano

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

El enriquecimiento de las células madre quimiorresistente cáncer ovárico de líneas celulares humanas

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Aislamiento y cultivo de expansión de las células endoteliales-tumorales específicas

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Generación del paciente con cáncer de próstata Derivado modelos de xenoinjertos de células tumorales circulantes

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Aislamiento y Celular del fenotipo de células madre mesenquimales derivadas del líquido sinovial y la médula ósea de cerdos enanos

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...