Os autores agradecem a Prof M. Dietel e Dirk Schumacher por apoiar este trabalho e leitura crítica do manuscrito. A investigação conducente a estes resultados foi recebido apoios da Empresa Iniciativa sobre Medicamentos Inovadores comum ao abrigo do acordo de subvenção n ° 115234, os recursos de que são compostos de contribuição financeira do Programa da União Europeia Quadro (FP7/2007-2013) e empresas da EFPIA &quot;em contribuição em espécie. Este trabalho também foi apoiado pelo Krebsgesellschaft Berliner (BKG).

O esquema geral da experiência, incluindo a preparação de primários de um único células de tecido de tumor, a caracterização da cultura celular primária, a depleção de células de fibroblastos e de triagem magnética de CD133 CD133 + e - células de melanoma é mostrado na Figura 1. 1. Aquisição Amostra <ol><li> Verifique para aprovação ética antes de considerar os próximos passos. </li><li> Prepare um tubo de 50 ml com PBS estéril suplementado com 1% de concentração de Penicilina Estreptomicina-de-final e entregar à cirurgia ou equipe. </li><li> Organizar o transporte rápido de tecido de tumor a partir de cirurgia de laboratório de cultura de células a 4 ° C. </li></ol> 2. Preparando Melanoma primário individuais a partir de células de tecido de tumor <ol><li> Executar todas as etapas sob condições estéreis. </li><li> Antes da ressecção do tumor, é necessário para preparar a mistura de dissociação. Mistura de 10 ml de dissociação por 2-4 g de tecido é necessária. A mistura pode ser usada immediadiatamente ou armazenada em alíquotas de 10 ml a -20 ° C para uso posterior. <ol><li> Prepara-se uma solução contendo cloreto de sódio 150 mM. Misturar utilizando um vortex até que a solução fique límpida. Se necessário estéril, solução de cloreto de sódio filtrado através de um filtro de 0,22 ^ m. </li><li> Pesar DNase I e preparar uma solução contendo 10 mg / ml de DNase I em cloreto de sódio 150 mM. Misturar por inversão até a solução estar límpida. </li><li> Prepara-se uma solução contendo 100mg/ml de colagenase IV em PBS. Misturar por inversão até a solução estar límpida. Alíquotas da solução de colagenase pode ser armazenada a -20 ° C durante vários meses. </li><li> Preparar a mistura de dissociação com uma concentração final de 1% de Penicilina-Estreptomicina, 1 mg / ml de colagenase IV e 0,1 mg / ml de DNase I em Quantum médio 263. Misturar utilizando um vortex. Opcional: quando se utiliza tecido de melanoma derivada de pele add solução de anfotericina B na mistura de dissociação para uma concentração final de 1,5 ug / ml de anfotericina B. </li></ol></li><li> Pré-aquecer o reqquantidades uired mistura de dissociação, PBS e meio Quantum 263-37 ° C. </li><li> Tecido local do tumor em uma placa de Petri esterilizada. Aspirar solução excessivo do tecido e adicionar 500 ul de mistura de dissociação. Picar tumor em pequenos pedaços de 2-4 mm utilizando frescos, bisturis esterilizados. </li><li> Transferência de 2-4 g picada tecido do tumor em um tubo C gentleMACS contendo 5 ml de mistura de dissociação. Lavar placa de Petri com o adicional de 4,5 ml dissociação mistura e adicionar fragmentos de tecido restantes para a C Tube gentleMACS. </li><li> Fechar gentleMACS tubo C e anexá-lo de cabeça para baixo na manga do dissociador gentleMACS. Execute o programa gentleMACS &quot;h_tumor_01&quot;. </li><li> Separe o gentleMACS tubo C do dissociador e incubar a amostra durante 30 min a 37 ° C sob rotação constante do tubo usando o Rotator MACSmix sobre a maior velocidade de execução (12 rpm), ou, rodando o tubo manualmente a cada 5 min para ressuspender os fragmentos de tecidos estabelecidas . </li><li> Anexar gentleMACS tubo C de cabeça para baixo sobre a manga de tele gentleMACS dissociador e execute o programa gentleMACS &quot;h_tumor_02&quot;. </li><li> Separe o gentleMACS tubo C do dissociador e incubar a amostra durante 30 min a 37 ° C sob rotação constante do tubo usando o Rotator MACSmix sobre a maior velocidade de execução (12 rpm), ou, rodando o tubo manualmente a cada 5 min para ressuspender os fragmentos de tecidos estabelecidas . </li><li> Anexar gentleMACS tubo C de cabeça para baixo sobre a manga da dissociador gentleMACS e execute o programa gentleMACS &quot;h_tumor_03&quot;. </li><li> Separe o gentleMACS tubo C do dissociador amostra, ressuspender e aplicar a suspensão de células para uma célula 70 um filtro colocado sobre um tubo de 50 ml. Se o entupimento do filtro de ocorrer, agitar a suspensão de células com uma ponta de filtro estéril até a suspensão completa percorreu. </li><li> Lavar o filtro com 5 ml de células médio 263 Quantum. </li><li> Opcional: se você ainda tem fragmentos de tecido deixado no filtro, fragmentos ressuspender em 263 Quantum médio e sementes-los de forma adequada cultura de células dish. Incubar fragmentos a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Descartar coador de células e fechar o tubo de 50 ml, com a suspensão de células digerido. Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 300 xg e rejeitar o sobrenadante. </li><li> Opcional: se a célula pellet aparece a vermelho, devido a uma grande quantidade de eritrócitos preparar 1x Red Blood Solução de Lise Celular por diluição 1:10 de solução 10x em água bidestilada, ressuspender sedimento de células em 500 ul de PBS e adicionam-se 5 ml de 1x lise de glóbulos vermelhos solução. Vortex 5 seg e incubar à temperatura ambiente durante 10 min. Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg e rejeitar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células tumorais com Quantum 263 e semear as células em frasco de cultura de células apropriado. As células de tumor de cultura a 37 ° C e 5% de CO 2 e de células, rotineiramente passagem quando atingem confluência de 80%. </li></ol> 3. Caracterização da cultura primária de células de fibroblasto e Exaustão <ol><li> Analisar a cultura primária de células fenotipicamente utilizando uma microscopiape. </li><li> Colher uma pequena quantidade (0,5 x 10 6 células) da cultura de células primária e realizar a RT-PCR com iniciadores para neoplásicas-,-melanoma, células-tronco e genes marcadores de células do estroma. Os genes mais importantes a analisar são CD90 (marcador de fibroblasto), TYR (melanoma / marcador de melanócitos), CD133 (cancro do marcador de células-tronco), CD83 (marcador de células dendríticas maduras) e um gene housekeeping (eg HPRT ou GAPDH). </li><li> Se a análise microscópica e alta expressão de CD90 durante a RT-PCR revelou uma elevada contaminação da cultura melanoma primário com fibroblastos, você precisa esgotar fibroblastos utilizando as microesferas de Anti-fibroblastos e colunas D da Miltenyi. </li></ol> 4. Classificando celular magnético de CD133 + e CD133 - células de melanoma Usando Colunas LS <ol><li> Prepare MACS tampão contendo EDTA 2 mM e FCS a 5% em PBS. Mix por tampão invertendo e estéril-filtrado usando um 0,22 um Steritop-GP unidade de filtro. Frio buffer para 4-8 ° Ce desgaseificar antes da utilização. </li><li> Pré-aquecer Accutase, PBS e Quantum meio 263-37 ° C. </li><li> Lave 80% de células confluentes com PBS. Adicionar quantidade apropriada de Accutase e incubar as células até desprendimento da superfície da cultura. Recolher as células num tubo de 50 ml, utilizando meio de Quantum 263. </li><li> Determinar o número de células e centrifugar a quantidade necessária de células (de acordo com o protocolo Miltenyi de um número máximo de 2x 10 9 células podem ser carregadas por coluna LS. Linha celular específicos números óptimos deverá ser determinado e pode ser consideravelmente mais baixa.) Durante 5 min a 300 xg e 4-8 ° C. Aspirar o sobrenadante completamente. </li><li> Ressuspender um máximo de 1x 10 8 células com 350 tampão MACS ul (para números mais elevados de células escalar todos tampão MACS seguinte, FcR reagente de bloqueio, CD133/1-Biotin e anti-Biotina micropérolas volumes em conformidade). </li><li> Adicionam-se 100 ul de reagente de bloqueio FcR. </li><li> Adicionar 50 ul CD133/1-Biotin. Misturar bem utilizando um vortex e incubar a 4-8 ° C fou 10 min. </li><li> Lave as células por adição de 10 ml de tampão de MACS e centrifugação durante 5 minutos a 300 xg e 4-8 ° C. Aspirar o sobrenadante completamente. </li><li> Repita o passo de lavagem (4.8) </li><li> Ressuspender o sedimento celular com 400 ul de tampão MACS. </li><li> Adicionar 100 ul de anti-biotina micropérolas. Misturar bem utilizando um vortex e incubar a 4-8 ° C durante 15 min. </li><li> Ao mesmo tempo, preparar o separador MACS para a separação magnética. Anexar QuadroMACS para MACS suporte Separador Multi. Inserir o número necessário de colunas LS com as asas da coluna para a frente no campo magnético do QuadroMACS. Colocar um filtro de pré-separação (com 30 mesh nylon mm) em cada coluna LS e de um tubo de recolha apropriado (15 ml ou 50 ml) debaixo de cada coluna. Prepare filtro e da coluna por lavagem com 3 ml de tampão MACS. Descarte fluxo através. </li><li> Lave as células por adição de 10 ml de tampão de MACS e centrifugação durante 5 minutos a 300 xg e 4-8 ° C. Aspirar o sobrenadante completamente. </li><li> Ressuspender as células com 500 uLMACS tampão e aplicar a suspensão de células na coluna LS com o filtro de pré-separação. </li><li> Lavar três vezes com 3 ml de tampão por coluna MACS. Apenas adicionar novo buffer quando o reservatório coluna está vazio. </li><li> O efluente coletado total contém o CD133 sem rótulo - fração celular. </li><li> Jogue fora o filtro de pré-separação, remover a coluna do separador e colocá-lo em um tubo de coleta adequado. </li><li> Aplicar 5 ml de tampão de MACS. Lave imediatamente as rotulados células CD133 + com firmeza empurrando o êmbolo para a coluna. </li><li> Para aumentar a pureza da fracção negativa, aplicam-se a suspensão de células numa coluna LS novo equilibrada inserido no QuadroMACS. O efluente contém o CD133 - fracção. </li><li> Descartar colunas. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

A fim de eliminar contaminações de eritrócitos do tumor pellet celular recomendamos usar o vermelho sangue solução de lise celular de Miltenyi. As vantagens de lisar os eritrócitos durante a centrifugação em gradiente de Ficoll tradicional densidade são que é mais rápida e mais simples. Além disso, as contaminações com Ficoll ou glóbulos vermelhos do sangue e da perda de células tumorais são evitados. Quando se observa o crescimento de fibroblastos em cultura primária de células que deve ser removido ...

Melanomas malignos cutâneos são o tipo menos comum, mas mais letal de câncer de pele. Devido a uma incidência crescente, um alto grau de malignidade e uma rápida disseminação, melanomas, hoje, representam 75% dos tumores malignos de pele relacionadas com 1,2 mortes. Além de excisão cirúrgica do tumor primário, quimioterapia, radioterapia, imunoterapia e quimioterapia combinada e imunoterapia de melanoma metastático são as estratégias de estado-da-arte para o tratamento de melanoma 3,4. No entanto, o melanoma maligno é caracterizado por uma má resposta à quimioterapia (5-12%) 5,6, e apenas os 50-70% dos pacientes com melanoma que carregam o BRAF V600E benefício mutação genética do prometendo novas terapias-alvo como o tratamento com vemurafenib 7 Para melhorar a sobrevida global, uma melhor compreensão dos mecanismos de tumorigênese melanoma é necessário. Para estudar estes mecanismos, no passado, comercialmente bem estabelecidacialmente disponíveis linhas celulares foram usados. Abordagens mais recentes para estudar os eventos moleculares de iniciação e progressão do câncer utilizam culturas primárias derivadas diretamente de tecido do tumor - uma estratégia benefícios múltiplos de rolamento: O pesquisador tem controle total do paciente e seleção de tecidos. As células da amostra obtida a partir habilmente seleccionados tecido do tumor, o tumor se assemelham com toda a sua heterogeneidade e dados de seguimento do paciente e uma patologia detalhadas estão disponíveis para permitir que as características da cultura a ser comparados com aqueles do tumor original 8. Em contraste, a utilização de linhas celulares estabelecidas, como sistemas modelo relevantes na investigação do cancro é discutida de forma controversa. Já em 1987 Osborne e colegas descreveram significativas diferenças biológicas entre MCF-7 de mama humano linhas celulares de cancro de diferentes laboratórios 9. Esta instabilidade genómica e extensa variação na expressão de RNA durante a subcultura foi confirmed por Hiorns et al. e forneceram dados de apoio à evidência de que as linhas de células evoluem na cultura, enfraquecendo assim a relevância direta de tais culturas estabelecidas como modelos de câncer humano 10. Outra consideração importante, que tem sido largamente ignorado ao longo dos anos, o risco de contaminação ou crescimento de culturas não relacionadas com as células &quot;falsos&quot;, que foi pela primeira vez destacadas mais de vinte anos atrás, demonstrando que um grande número de linhas de células HeLa foram contaminadas pelos células 8,11. A má interpretação de dados de &quot;falsos&quot; linhas celulares recentemente veio à luz na literatura novamente. Usando uma combinação de perfis de ADN e citogenética molecular, MacLeod et ai. Revelou que de 252 novos derivadas de tumor de linhas de células humanas depositados na Colecção Alemã de Microorganismos e Culturas Celulares (DSMZ), cerca de 18% foram consideradas intra-espécies ou interespécies cruz -contaminantes 12,13. Para evitar estes problemas e para fazer uso das vantagens acima mencionadas, decidimos estabelecer passagem baixa as linhas de células de melanoma a partir de metástases recentemente excisadas. Tecnologias de células robustas de separação e análise exigem unicelulares preparações a serem gerados ao mesmo tempo, limitar a morte celular e a destruição das proteínas de superfície característicos. Um instrumento de bancada para a dissociação automatizado de tecidos em suspensões de célula única é o dissociador gentleMACS fabricado pela Miltenyi. Quando utilizado em combinação com tubos gentleMACS C e dissociação optimizado soluções, uma dissociação eficaz e suave do tecido do tumor, num sistema fechado é conseguido preservando epítopos de antigénios e reduzindo a perda de células. O instrumento dispõe optimizados, os programas pré-estabelecidos para uma variedade de aplicações específicas e garantias preparação padronizada de suspensões unicelulares a partir de tecido de melanoma 14. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Relatórios recentes revelaram que a maioria dos tumores de abrigar uma pequena subpopulação de células cancerosas chamados estaminais (CSCs), os quais apresentam exclusivamente tumor de iniciação e capacidade de auto-renovação. A identificação das células de melanócitos produtoras de tronco na derme da pele levou à hipótese de que estas células podem ser a origem das células de cancro da haste (CSCs) em melanoma vez que a exposição à radiação UVA podem preparar estas células para a transformação maligna 15. O resultado de tal lesão genética seriam as células que abrigam uma combinação de características de tumor e de células estaminais. Um dos marcadores chave proposto para representar a subpopulação de CSCs em melanoma é CD133 16-20. CD133 (também conhecido como Prominin 1), um membro de glicoproteínas transmembranares pentaspan, é expresso em células progenitoras hematopoiéticas, células progenitoras endoteliais, células estaminais neuronais e gliais 21-23. A expressão de CD133 está correlacionada com adivisão celular assimétrica 24, e do epítopo glicosilada de CD133 mostrou ser downregulated upon a diferenciação das células 25. Recentemente, CD133 + de melanoma foram mostrados para ter auto-renovação e tumor de iniciação capacidade 19,20. Para estudar a função das células CD133 + putativo melanoma CSCs, modificamos e otimizou a separação celular magnética Ativado (MACS), sistema de Miltenyi Biotech obter populações altamente enriquecido e viáveis ​​de CD133 + e CD133 - células. Separação magnética de células grânulo-based permite para qualquer seleção negativa, como mostrado por Matheu et al. 26 ou seleção positiva como mostramos aqui. Durante a selecção positiva do tipo de célula alvo específico, por exemplo, as células que expressam CD133, é magneticamente marcadas com micro-esferas, partículas de 50 nm que são superparamagnéticas conjugados com anticorpos altamente específicos contra umo antigénio de superfície celular específico. Durante a separação, as células magneticamente marcadas são retidas no interior da coluna no campo magnético do separador, enquanto que as células não marcadas fluir. Seguindo os passos de lavagem, a coluna é removida do campo magnético do separador, e as células alvo são eluídos a partir da coluna. O LS ou colunas MS utilizada durante a sequência de selecção positiva em fracções de células marcadas e não marcadas com elevado grau de pureza. Por outro lado, as colunas de LD, usado para a selecção negativa, resultam em uma pureza ligeiramente inferior a fracção marcada. Devido à densa embalagem da sua matriz a taxa de fluxo nestas colunas é mais baixa resultante de um risco maior de células não marcadas para serem retidas na coluna. Colunas LD deve, portanto, ser utilizado apenas para a depleção rigoroso de uma subpopulação de células não desejados. Selecção positiva pode ser realizada por directa (anticorpo acoplado a microesferas) ou indirecta rotulagem magnética (incubação com microesferas após a incubation com o anticorpo primário). Microesferas MACS específicos estão disponíveis para a selecção positiva de numerosos tipos de células primárias de células de tumor da próstata, como melanoma ou 27.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> Solução de anfotericina B de 250 ug / mL em água desionizada </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> A2942-50ml </td><td></td></tr><tr><td> anti-fibroblastos micropérolas </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase IV </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> APPLICHEM GmbH </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS sem Ca, Mg </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> H15-002 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Ácido etilenodiaminotetracético dissódico desidratado sal (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS Superior </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> Indireta CD133 humano Kit Micro-Bead </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-091-895 </td><td> Inclui: CD133 / 1 (AC133)-biotina, anti-biotina e micropérolas FcR reagente Blocking </td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina líquido, (100x) </td><td> Invitrogen GmbH </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Quantum 263 </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> Red Blood Solução de Lise Celular (10x) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr> &lt;td&gt; Cell filtro (70 mm) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS C Tubos </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS dissociador </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> MACS suporte multi Separador </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Colunas separação 25 colunas LS </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> MACSmix Rotator Tubo </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Merck KGaA </td><td> 567.440-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Pré-separação Filtros </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-041-407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Separador QuadroMACS </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Rotilabo-seringa filtros (de 0,22, PES) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP Filtrar Unidade 500 ml </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma

Apesar de melhores opções de tratamentos para o melanoma disponível hoje, os pacientes com melanoma maligno avançado ainda tem um prognóstico ruim de sobrevivência livre de progressão e global. Portanto, a pesquisa translacional precisa fornecer mais evidências molecular para melhorar terapias direcionadas para melanomas malignos. No passado, os mecanismos de oncogénicos relacionadas com melanoma foram extensivamente estudados em linhas celulares estabelecidas. No caminho para tratamentos mais personalizados baseados em perfis genéticos individuais, propomos usar linhas celulares derivadas paciente em vez de linhas celulares genéricos. Juntamente com os dados clínicos de alta qualidade, especialmente no acompanhamento do paciente, essas células serão fundamentais para compreender melhor os mecanismos moleculares por trás de progressão do melanoma. Aqui, nós relatamos o estabelecimento de culturas primárias de melanoma tecido tumoral dissecados fresco. Este procedimento inclui a trituração ea dissociação do tecido em células individuais re,moval de contaminação com eritrócitos e fibroblastos, bem como de cultura primária e uma verificação fiável da origem das células de melanoma. Relatórios recentes revelaram que melanomas, como a maioria dos tumores, porto uma pequena subpopulação de células-tronco cancerosas (CSCS), que parecem alimentar exclusivamente de iniciação e progressão tumoral em direção ao estado metastático. Um dos marcadores essenciais para a identificação e isolamento de CSC no melanoma é CD133. Para isolar CD133 + CSCs a partir de culturas primárias de melanoma, temos modificado e optimizado a separação de células magnético-Activated (MACS) procedimento de Miltenyi resultando em pureza elevada e classificação viabilidade de CD133 + CSCs e CD133 - a granel, que podem ser cultivados e analisados ​​funcionalmente depois disso.

Preparação de células de um único tecido tumoral A Figura 2 exemplifica uma ressecado metástase de nódulo linfático de um paciente de melanoma fase final antes (A) e depois (B) de dissociação mecânica em 2-4 pedaços mm. Seguindo dissociação enzimática do tecido e filtração através de uma malha de nylon de 70 um, as células foram sedimentadas e o sobrenadante foi descartado. Nesta etapa foi observada uma elevada contaminação com eritrócitos, como indicado pe...

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Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Este artigo descreve a preparação do tecido acabado de melanoma obtidas em culturas primárias de células, e como para remover contaminações de eritrócitos e fibroblastos a partir de células tumorais. Finalmente, descrevemos como CD133<sup&gt; +</sup&gt; De células estaminais putativas de melanoma são classificados do CD133<sup&gt; -</sup&gt; Massa usando separação celular magnética activado (MACS).

Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

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Medicine

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

21.1K visualizações.  Charité - Universitätsmedizin Berlin. Este artigo descreve a preparação do tecido acabado de melanoma obtidas em culturas primárias de células, e como para remover contaminações de eritrócitos e fibroblastos a partir de células tumorais. Finalmente, descrevemos como CD133 + De células estaminais putativas de melanoma são classificados do CD133 - Massa usando separação celular magnética activado (MACS).

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Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Isolamento dos núcleos dos cardiomiócitos a partir de Post-mortem de tecidos

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Medicina

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolamento de células-tronco cancerosas em amostras de câncer de próstata humano

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Enriquecimento para resistente à quimioterapia do cancro do ovário células-tronco de linhas de células humanas

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Isolamento e Imortalidade de linhas celulares derivadas do paciente a partir de biópsia muscular para a doença Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Estudar o cancro do pâncreas Stem características celulares para desenvolver estratégias Novo tratamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolamento e Cultura de Expansão de células endoteliais específicos de tumores

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Geração de paciente com câncer de próstata Derivado modelos de xenotransplante de células tumorais circulantes

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Isolation and Cellular fenotipagem de células-tronco mesenquimais derivadas do líquido sinovial e Medula Óssea de miniporcos

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...