أشكر الأستاذ الكتاب M. Dietel وديرك شوماخر لدعم هذا العمل وقراءة نقدية للمخطوطة. تلقت البحوث التي تؤدي إلى هذه النتائج بدعم من مبادرة مبتكرة التعهد الأدوية المشتركة في إطار اتفاقية المنحة رقم 115234، والموارد التي تتكون من مساهمة مالية من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) والشركات EFPIA &#39;في مساهمة عينية. كما أيد هذا العمل من قبل Krebsgesellschaft برلين (BKG).

الخطة الشاملة للتجربة بما في ذلك إعداد الخلايا الأولية واحد من أنسجة الورم، وتوصيف للثقافة الخلية الأولية، واستنفاد الخلايا الليفية والفرز المغناطيسي CD133 + خلية من خلايا وCD133 - يظهر خلايا سرطان الجلد في الشكل 1. 1. عينة اكتساب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من وجود الموافقة الأخلاقية قبل النظر في الخطوات التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أنبوب 50 مل العقيمة مع PBS تستكمل مع تركيز البنسلين الستربتوميسين-1٪ النهائية وتسليم لعملية جراحية أو الفريق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيم النقل السريع للأنسجة الورم من عملية جراحية لزراعة الخلايا في المختبر C. ° 4 </li></ol> 2. إعداد الميلانوما أساسي واحد من خلايا أنسجة الورم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ كافة الخطوات تحت ظروف معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الإستئصال للورم، ويحتاج المرء لإعداد مزيج التفكك. مطلوب 10 مل لكل مزيج التفكك الأنسجة ز 2-4. ويمكن استخدام هذا المزيج immediately أو تخزينها في 10 مليلتر مأخوذة في -20 ° C لاستخدامها لاحقا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول يحتوي على 150 ملم كلوريد الصوديوم. خلط باستخدام الدوامة إلى أن الحل واضح. إذا لزم الأمر كلوريد الصوديوم العقيمة، الترشيح باستخدام فلتر حل ميكرون 0.22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن من الدناز I وإعداد محلول يحتوي على 10 ملغ / مل الدناز I في كلوريد الصوديوم 150mM. مزيج من قلب إلى أن الحل واضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول يحتوي على 100mg/ml كولاجيناز الرابع في برنامج تلفزيوني. مزيج من قلب إلى أن الحل واضح. ويمكن تخزين مأخوذة من حل كولاجيناز في -20 درجة مئوية لمدة عدة أشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج التفكك مع تركيز النهائي من 1٪ البنسلين الستربتوميسين،، 1 ملغ / مل IV كولاجيناز و 0.1 ملغ / مل الدناز I في المتوسط ​​263 الكم. خلط باستخدام الدوامة. اختياري: عند استخدام الأنسجة المستمدة من سرطان الجلد الجلد إضافة إلى حل B الامفوتريسين المزيج التفكك إلى تركيز النهائي من 1.5 ميكروغرام / مل الامفوتريسين B. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الدافئة للمساuired كميات من مزيج التفكك، وPBS الكم المتوسطة 263 حتي 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان أنسجة الورم على طبق بتري معقمة. نضح حل المفرط من النسيج وإضافة 500 ميكرولتر مزيج التفكك. اللحم المفروم الورم إلى أجزاء صغيرة من 2-4 مم باستخدام الطازجة والمشارط العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مفروم 2-4 ز أنسجة الورم في أنبوب C gentleMACS تحتوي على 5 مل مزيج التفكك. شطف طبق بتري مع مزيج إضافية 4،5 مل التفكك وإضافة شظايا الأنسجة المتبقية إلى أنبوب C gentleMACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق أنبوب gentleMACS C ونعلق عليه رأسا على عقب على الكم من Dissociator gentleMACS. تشغيل برنامج gentleMACS &quot;h_tumor_01&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل أنبوب C gentleMACS من dissociator واحتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت التناوب المستمر باستخدام أنبوب MACSmix الدوار على سرعة أعلى المدى (12 دورة في الدقيقة) أو عن طريق تحويل أنبوب يدويا كل 5 دقائق ل resuspend شظايا استقرت الأنسجة . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق gentleMACS C أنبوب رأسا على عقب على الكم رانه gentleMACS Dissociator وتشغيل البرنامج gentleMACS &quot;h_tumor_02&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل أنبوب C gentleMACS من dissociator واحتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت التناوب المستمر باستخدام أنبوب MACSmix الدوار على سرعة أعلى المدى (12 دورة في الدقيقة) أو عن طريق تحويل أنبوب يدويا كل 5 دقائق ل resuspend شظايا استقرت الأنسجة . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق gentleMACS C أنبوب رأسا على عقب على الكم من Dissociator gentleMACS وتشغيل البرنامج gentleMACS &quot;h_tumor_03&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل أنبوب C gentleMACS من العينة، dissociator إعادة تعليق وتطبيق التعليق الخلية إلى خلية مصفاة ميكرومتر 70 وضعت على أنبوب 50 مل. إذا انسداد الفلتر يحدث، وإثارة التعليق الخلية مع تلميح مرشح معقمة حتى التعليق الكامل من خلال ركض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مصفاة الخلية مع 5 مل المتوسطة الكم 263. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: إذا كنت لا تزال شظايا الأنسجة المتبقية في شظايا، فلتر resuspend في المتوسط ​​263 الكم والبذور منهم في ديس خلية ثقافة المناسبةح. احتضان عند 37 درجة شظايا C و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل مصفاة الخلية وإغلاق أنبوب 50 مل مع التعليق الخلية هضمها. أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 300 XG وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: إذا الخلية بيليه يظهر الحمراء بسبب وجود كمية عالية من كرات الدم الحمراء إعداد 1X خلايا الدم الحمراء عن طريق تمييع الحل يزيس 1:10 10X حل في الماء المقطر المزدوج، إعادة تعليق بيليه الخلية في 500 ميكرولتر PBS وإضافة 5 مل 1X خلايا الدم الحمراء يزيس الحل. دوامة 5 ثانية واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 XG وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الخلايا السرطانية مع 263 الكم والبذور الخلايا في خلية المناسبة قارورة الثقافة. الخلايا السرطانية في الثقافة 37 ° C و 5٪ CO 2 و الخلايا مرور روتينية عندما تصل إلى نقطة التقاء 80٪. </li></ol> 3. توصيف الثقافة الخلية الأولية واستنفاد الخلايا الليفية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الأساسي باستخدام زراعة الخلايا ظاهريا على microscoبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد كمية صغيرة (0.5x 10 6 خلايا) من زراعة الخلايا الأولية وأداء RT-PCR مع الاشعال للرمي، سرطان الجلد، الخلايا الجذعية، والجينات سدى علامة الخلية. الجينات لتحليل أهم CD90 هي (علامة الخلايا الليفية)، TYR (سرطان الجلد / علامة الخلايا الصباغية)، CD133 (سرطان الخلايا الجذعية علامة)، CD83 (علامة للحصول على الخلايا الجذعية الناضجة) والجينات التدبير المنزلي (مثل HPRT أو GAPDH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان التحليل المجهري والتعبير عالية من CD90 خلال RT-PCR كشفت عن وجود تلوث شديد للثقافة سرطان الجلد مع الخلايا الليفية الأولية، تحتاج إلى استنزاف الخلايا الليفية باستخدام MicroBeads مكافحة الخلايا الليفية وأعمدة D من Miltenyi. </li></ol> 4. المغناطيسي الفرز الخلية من CD133 + وCD133 - خلايا سرطان الجلد باستخدام أعمدة LS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد MACS العازلة التي تحتوي على 2 مم EDTA وFCS 5٪ في برنامج تلفزيوني. مزيج من قلب عازلة ومعقمة باستخدام الترشيح، 0،22 ميكرون وحدة تصفية Steritop-GP. البرد عازلة ل4-8 ° Cوديغا قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الدافئة Accutase، PBS الكم والمتوسطة 263 حتي 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا متموجة 80٪ مع PBS. إضافة كمية مناسبة من Accutase واحتضان الخلايا حتى فصل من سطح الثقافة. جمع الخلايا في أنبوب 50 مل باستخدام الكم 263 متوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي العدد المطلوب من الخلايا (وفقا لبروتوكول Miltenyi ليمكن تحميل أكبر عدد ممكن من 2X الخلايا 9 10 لكل عمود LS. ينبغي تحديد خلية خط الأعداد الأمثل محددة، ويمكن أن يكون أقل من ذلك بكثير.) لمدة 5 دقائق في 300 XG ° C. و 4-8 نضح طاف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بحد أقصى 10 8 خلايا 1X العازلة مع 350 ميكرولتر MACS (للأرقام أعلى الخلية توسيع نطاق جميع العازلة MACS التالية، FCR الكاشف الحظر، وCD133/1-Biotin MicroBeads المضادة للكميات البيوتين وفقا لذلك). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر الكاشف FCR الحظر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر CD133/1-Biotin. تخلط جيدا باستخدام الدوامة واحتضان 4-8 في ° C Fأو 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا بإضافة 10 مل العازلة MACS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 XG ° C. و 4-8 نضح طاف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة غسل (4.8) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه الخلية مع 400 ميكرولتر العازلة MACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر مكافحة البيوتين MicroBeads. تخلط جيدا باستخدام الدوامة واحتضان 4-8 في درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه، تعد الفاصل MACS للمغناطيس. إرفاق QuadroMACS للوقوف فاصل MACS موضوع. إدراج العدد المطلوب من الأعمدة LS مع أجنحة العمود إلى الأمام في المجال المغناطيسي للQuadroMACS. وضع فلتر قبل فصل (مع 30 ميكرومتر شبكة النايلون) في كل عمود وLS أنبوب جمع المناسبة (15 مل أو 50 مل) تحت كل عمود. إعداد تصفية والعمود وذلك بدهن مع 3 مل العازلة MACS. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا بإضافة 10 مل العازلة MACS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 XG ° C. و 4-8 نضح طاف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الخلايا مع 500 ميكرولترMACS العازلة وتطبيق التعليق على الخلية العمود LS مع تصفية ما قبل الانفصال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل ثلاث مرات مع 3 مل العازلة MACS لكل عمود. فقط إضافة جديدة عازلة عند الخزان عمود فارغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع النفايات السائلة مجموع يحتوي على CD133 لا تحمل علامات - جزء الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل ما قبل تصفية الفاصل، إزالة عمود من الفاصل ووضعه على أنبوب جمع مناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 تطبيق العازلة MACS مل. طرد فورا من العلامات الخلايا CD133 + عن طريق دفع المكبس بقوة في العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لزيادة نسبة نقاء السلبية، وتطبيق التعليق على الخلية عمود LS معايرتها الجديدة المدرجة في QuadroMACS. النفايات السائلة تحتوي على CD133 - الكسر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل الأعمدة. </li></ol>

<ol>
	<li>Garibyan, L., Fisher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sunlight+causes+melanoma.">How sunlight causes melanoma.</a> Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).</li><li>Radovic-Kovacevic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+in+patients+with+cutaneous+malignant+melanoma.">Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma.</a> Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).</li><li>Lens, M. B., Eisen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+chemotherapy+in+the+treatment+of+malignant+melanoma.">Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma.</a> Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).</li><li>Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+therapy+of+disseminated+malignant+melanoma:+an+evidence-based+overview+of+the+state-of-the-art+in+daily+routine.">Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine.</a> J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).</li><li>Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Der Onkologe. 16, 1160-1166 (2010).</li><li>Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemische+Therapie+des+metastasierten+Melanoms:+Ergebnisse+randomisierter+Studien+der+letzten+zehn+Jahre.">Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre.</a> Deutsches &#196;rzteblatt. 100, (2003).</li><li>Chapman, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+with+vemurafenib+in+melanoma+with+BRAF+V600E+mutation.">Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation.</a> N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).</li><li>Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines:+friend+or+foe.">Breast cancer cell lines: friend or foe.</a> Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).</li><li>Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+differences+among+MCF-7+human+breast+cancer+cell+lines+from+different+laboratories.">Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).</li><li>Hiorns, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA+expression+and+genomic+DNA+content+acquired+during+cell+culture.">Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture.</a> Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).</li><li>Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-contamination+of+cells+in+culture.">Cross-contamination of cells in culture.</a> Science. 212, 446-452 (1981).</li><li>MacLeod, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+intraspecies+cross-contamination+of+human+tumor+cell+lines+arising+at+source.">Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source.</a> Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).</li><li>Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cancer+cell+lines:+fact+and+fantasy.">Human cancer cell lines: fact and fantasy.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).</li><li>Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Single-Cell+Suspensions+from+Mouse+Neural+Tissue.">Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue.</a> J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).</li><li>Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermis-derived+stem+cells:+a+source+of+epidermal+melanocytes+and+melanoma.">Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li><li>Ieta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+genetic+characteristics+of+tumor-initiating+cells+in+colon+cancer.">Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer.</a> Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).</li><li>Bertolini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+tumorigenic+lung+cancer+CD133++cells+display+stem-like+features+and+are+spared+by+cisplatin+treatment.">Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).</li><li>Monzani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+contains+CD133+and+ABCG2+positive+cells+with+enhanced+tumourigenic+potential.">Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential.</a> Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).</li><li>Gedye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer/testis+antigens+can+be+immunological+targets+in+clonogenic+CD133++melanoma+cells.">Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).</li><li>Kobari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++cell+selection+is+an+alternative+to+CD34++cell+selection+for+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+cells.">CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).</li><li>Quirici, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+expansion+of+endothelial+cells+from+human+bone+marrow+CD133(+)+cells.">Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells.</a> Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).</li><li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone,+but+on+embryonic+neural+stem+cells,+ependymal+cells,+and+glioblastoma+cells.">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).</li><li>Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbody+and+primary+cilium+of+neural+progenitors+release+extracellular+membrane+particles+enriched+in+the+stem+cell+marker+prominin-1.">Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1.</a> J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).</li><li>Florek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+neural+and+hematopoietic+stem+cell+marker,+is+expressed+in+adult+human+differentiated+cells+and+certain+types+of+kidney+cancer.">a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer.</a> Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+Mouse+Lymph+Nodes+Using+Miltenyi+MACS+Purification.">Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification.</a> J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).</li><li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Immune+Cells+from+Primary+Tumors.">Isolation of Immune Cells from Primary Tumors.</a> J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).</li><li>Mollamohammadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+cryopreservation+method+for+feeder-free+dissociated+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+human+embryonic+stem+cells.">A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).</li></ol>

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

من أجل إزالة التلوث من كرات الدم الحمراء بيليه الخلايا السرطانية نوصي بشدة باستخدام خلايا الدم الحمراء تحلل من حل Miltenyi. مزايا lysing في الكريات الحمراء خلال الطرد المركزي Ficoll التقليدية التدرج الكثافة هي أنه من أسرع وأبسط. وعلاوة على ذلك، يتم تجنب التلوث مع Ficoll أو خلايا ?...

الميلانينية الخبيثة الجلدية هي نوع أقل شيوعا، ولكن القاتل من سرطان الجلد الأكثر. نتيجة لتزايد، ودرجة عالية من الخباثة والانتشار السريع، الميلانينية تمثل الآن 75٪ من الأورام الخبيثة الجلد الوفيات المرتبطة 1،2. وبالاضافة الى الاستئصال الجراحي للورم الأولية، والعلاج الكيميائي، العلاج الإشعاعي، العلاج المناعي الكيميائي ومجتمعة والعلاج المناعي للسرطان الجلد انتشر هي الاستراتيجيات للدولة من بين الفن للعلاج سرطان الجلد 3،4. ومع ذلك، يتميز سرطان الجلد الخبيث من ضعف الاستجابة لمبحث المعالجة الكيميائية (5-12٪) 5،6، وتلك فقط 50-70٪ من مرضى سرطان الجلد يحمل الجين V600E BRAF فائدة من طفرة جديدة واعدة لعلاج العلاجات المستهدفة مع 7 لvemurafenib تحسين البقاء على قيد الحياة عموما، هناك حاجة إلى فهم أفضل بكثير لآليات تكون الأورام سرطان الجلد. لدراسة هذه الآليات في الماضي تسويقية راسخة،واستخدمت خطوط الخلايا المتاحة cially. نهج أكثر حداثة لدراسة الأحداث الجزيئية للسرطان والتقدم بدء استخدام الثقافات الأولية المستمدة مباشرة من أنسجة الورم - وهي فوائد متعددة تحمل استراتيجية: وقد قام الباحث السيطرة الكاملة على المريض واختيار الأنسجة. الخلايا عينات أنسجة الورم المكتسبة من اختيار بخبرة، تشبه الورم مع عدم التجانس في جميع ومتابعة البيانات للمريض والأمراض مفصلة متاح للسماح مقارنة خصائص الثقافة مع تلك الورم الأصلي 8. في المقابل، ويناقش استخدام خطوط الخلايا على النحو المنصوص عليه في الأنظمة ذات الصلة نموذج أبحاث السرطان للجدل. بالفعل في عام 1987 وصف أوسبورن وزملاء الاختلافات البيولوجية بين كبير MCF-7 خطوط الإنسان خلايا سرطان الثدي من مختبرات مختلفة 9. كان هذا عدم الاستقرار الجيني واسعة والاختلاف في التعبير RNA المشترك خلال ثقافة فرعيةnfirmed من Hiorns وآخرون، وقدمت بيانات داعمة لدليل على أن خطوط الخلايا لم تتطور في الثقافة، مما يضعف أهمية مباشرة لمثل هذه الثقافات التي أنشئت كنماذج لسرطان الإنسان 10. وهناك اعتبار آخر مهم، التي تم تجاهلها إلى حد كبير على مر السنين، هو خطر التلوث أو فرط نمو الخلايا لا علاقة لها مع الثقافات &#39;كاذبة&#39;، والتي تم تسليط الضوء الأول على عشرين عاما من خلال إظهار أن كانت ملوثة عدد كبير من خطوط الخلايا بواسطة هيلا الخلايا 8،11. لقد حان سوء تفسير البيانات من &#39;كاذبة&#39; خطوط الخلايا مؤخرا إلى النور في الأدب مرة أخرى. باستخدام مزيج من التنميط الحمض النووي علم الوراثة الخلوية الجزيئية وكشف ماكلويد وآخرون أن الورم من 252 الجديدة المستمدة من خطوط الخلايا البشرية المودعة لدى مجموعة الألمانية الكائنات الدقيقة والثقافات الخلية (DSMZ)، تم العثور على ما يقرب من 18٪ لتكون إختلافات بين الأنواع أو بين الأنواع عبر 12،13-الملوثات. لتجنب هذه المشاكل، والاستفادة من المزايا المذكورة أعلاه، قررنا إنشاء المنخفضة مرور خطوط الخلايا سرطان الجلد من الانبثاث رفعه حديثا. فصل الخلايا قوية وتقنيات التحليل يتطلب أن تكون ولدت وحيدة الخلية مع الحد في الوقت نفسه الاستعدادات موت الخلايا وتدمير البروتينات السطحية مميزة. A صك الفوق للالتفكك الآلي من الأنسجة إلى وحيدة الخلية تعليق هو Dissociator gentleMACS المصنعة من قبل Miltenyi. عندما تستخدم بالاقتران مع gentleMACS C أنابيب والحلول الأمثل التفكك، والتفكك فعالة ورقيقة من نسيج الورم في نظام مغلق ويتحقق مع الحفاظ على الحواتم مستضد والحد من فقدان الخلية. الصك يوفر الأمثل، برامج محددة مسبقا لمجموعة متنوعة من تطبيقات محددة وضمانات موحدة من إعداد وحيدة الخلية تعليق من الأنسجة سرطان الجلد 14. &lt;ف الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; كشفت التقارير الأخيرة أن غالبية أورام تؤوي جزء من السكان صغيرة من ما يسمى الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية)، والتي تظهر بشكل حصري للورم والبدء الذاتي تجديد القدرات. أدى تحديد الخلايا الجذعية الخلايا الصباغية التي تنتج في الأدمة من الجلد إلى الفرضية القائلة بأن هذه الخلايا قد يكون منشأ الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية) في سرطان الجلد منذ التعرض للإشعاع UVA يستطيع رئيس هذه الخلايا للتحول الخبيث 15. ونتيجة لهذه الآفة الوراثية تكون الخلايا التي تؤوي مجموعة من الورم وخصائص الخلايا الجذعية. واحدة من علامات الرئيسية المقترحة لتمثيل الخلايا الجذعية السرطانية في حيوانية سرطان الجلد هو CD133 16-20. وأعرب عن CD133 (المعروف أيضا باسم Prominin 1)، وهو عضو في البروتينات السكرية عبر الغشاء pentaspan، في الخلايا الجذعية المكونة للدم، والخلايا البطانية السلف، الخلايا الجذعية العصبية والدبقية 21-23. ويرتبط التعبير عن CD133 معوقد تبين انقسام الخلية غير المتماثلة 24، وحاتمة الغليكوزيلاتي من CD133 أن تكون downregulated على تمايز الخلايا 25. مؤخرا، تم عرض CD133 + خلايا سرطان الجلد أن يكون التجديد الذاتي والقدرة الورم بدء 19،20. لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية السرطانية CD133 + المفترضة سرطان الجلد، وقمنا بتعديل الأمثل لفرز الخلايا المغناطيسي المنشط (MACS) من نظام التكنولوجيا الحيوية Miltenyi للحصول على السكان وقابلة للحياة عالي التخصيب من CD133 + وCD133 - الخلايا. الفصل المغناطيسي خلية حبة القائم يسمح لأي اختيار سلبية كما يتضح من ماثيو وآخرون. اختيار 26 أو إيجابية كما نعرض هنا. أثناء اختيار إيجابية هو المسمى مغناطيسيا الخلية المستهدفة خاصة النوع، على سبيل المثال CD133 الخلايا معربا عن، مع، MicroBeads الجسيمات superparamagnetic 50-نانومتر التي هي الأجسام المضادة لمترافق محددة للغاية ضدخاصة مستضد الخلايا السطحية. خلال الفصل، يتم الاحتفاظ الخلايا المسمى مغناطيسيا داخل العمود في المجال المغناطيسي للفاصل، في حين الخلايا غير المسماة تتدفق من خلال. بعد غسل الخطوات، تتم إزالة العمود من المجال المغناطيسي للفاصل، ومزال الخلايا المستهدفة من العمود. وLS أو الأعمدة التي استخدمت خلال MS نتيجة إيجابية في اختيار أجزاء من خلايا وصفت والخالي من الملصقات مع نقاء عالية. من ناحية أخرى، والأعمدة LD، وتستخدم لاختيار سلبية، تؤدي إلى نقاء أقل قليلا من نسبة المسمى. نظرا لكثافة التعبئة من مصفوفة على معدل التدفق في هذه الأعمدة أقل مما أدى إلى ارتفاع خطر الخلايا غير المسماة إلى أن المحاصرين في العمود. ولذلك ينبغي أن تستخدم الأعمدة LD فقط لاستنزاف الصارمة لخلية حيوانية غير المرغوب فيها. لا يمكن أن يؤديها اختيار وضع العلامات الإيجابية التي المغناطيسي المباشر (الضد بالإضافة إلى MicroBeads) أو غير مباشر (مع MicroBeads الحضانة بعد incubatioن مع الأجسام المضادة الأولية). MACS MicroBeads محددة متاحة للاختيار من أنواع الخلايا إيجابية عديدة من الخلايا السرطانية الأولية مثل البروستاتا أو سرطان الجلد 27.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> كاشف </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA المختبرات محدودة </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> الأمفوتريسين B حل 250 ميكروغرام / مل في الماء منزوع الأيونات </td><td> سيغما الدريخ، وشركة </td><td> A2942-50ML </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الخلايا الليفية microbeads </td><td> Miltenyi بيوتيك شركة محدودة </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi بيوتيك شركة محدودة </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> كولاجيناز IV </td><td> سيغما الدريخ، وشركة </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> الدناز I </td><td> APPLICHEM شركة محدودة </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS دون الكالسيوم، والمغنيسيوم </td><td> PAA المختبرات محدودة </td><td> H15-002 </td><td></td></tص&gt; <tr><td> Ethylenediaminetetraacetic حمض يذوى الملح الصوديوم (EDTA) </td><td> سيغما الدريخ، وشركة </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS فخمة </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> غير المباشرة CD133 الإنسان كيت الصغرى، حبة </td><td> Miltenyi بيوتيك شركة محدودة </td><td> 130-091-895 </td><td> تشمل ما يلي: CD133 / 1 (AC133)-البيوتين، MicroBeads مكافحة البيوتين وFCR الكاشف الحظر </td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين، السائل (100X) </td><td> إينفيتروجن شركة محدودة </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> الكم 263 </td><td> PAA المختبرات محدودة </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> تحلل الخلايا الحمراء في الدم الحل (10X) </td><td> Miltenyi بيوتيك شركة محدودة </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> معدات </td></tr><tr> &lt;TD&gt; الخليوي مصفاة (70 ميكرون) </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS C أنابيب </td><td> Miltenyi بيوتيك شركة محدودة </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS dissociator </td><td> Miltenyi بيوتيك شركة محدودة </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> MACS حامل فاصل موضوع </td><td> Miltenyi بيوتيك شركة محدودة </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> أعمدة الفاصل MACS أعمدة LS 25 </td><td> Miltenyi بيوتيك شركة محدودة </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> MACSmix أنبوب الدوار </td><td> Miltenyi بيوتيك شركة محدودة </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> ميرك KGaA </td><td> 567440-1KG </td><td></td></tr><tr><td> قبل فصل فلاتر </td><td> Miltenyi بيوتيك شركة محدودة </td><td> 130-041-407 </td><td></TD&gt; </tr><tr><td> QuadroMACS فاصل </td><td> Miltenyi بيوتيك شركة محدودة </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Rotilabo-حقنة المرشحات (0.22 ميكرومتر، PES) </td><td> كارل روث GMBH &amp; KG شركة </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP تصفية وحدة 500 مل </td><td> Miltenyi بيوتيك شركة محدودة </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma

على الرغم من خيارات العلاج لسرطان الجلد تحسين المتاحة اليوم، المرضى الذين يعانون من سرطان الجلد الخبيث متقدمة لا تزال لديها بسوء التشخيص من أجل البقاء خالية من التقدم والشاملة. ولذلك، والبحث متعدية في حاجة إلى توفير مزيد من الأدلة الجزيئية لتحسين العلاجات المستهدفة لالميلانينية الخبيثة. في الآليات، أنكجنيك الماضية المتعلقة سرطان الجلد وتمت دراسة على نطاق واسع في خطوط الخلايا الراسخة. في الطريق إلى نظم العلاج أكثر تخصيصا على أساس مواصفات جينية الفردية، نقترح استخدام خطوط الخلايا المشتقة من المريض بدلا من خطوط الخلايا عامة. جنبا إلى جنب مع بيانات عالية الجودة السريرية، وخصوصا على المريض المتابعة، فإن هذه الخلايا تكون مفيدة لفهم أفضل للآليات الجزيئية وراء تطور سرطان الجلد. هنا، ونحن التقرير إنشاء الثقافات سرطان الجلد الأولي من تشريح أنسجة الورم الطازجة. يتضمن هذا الإجراء تنميق وتفكك النسيج إلى خلايا واحدة، وإعادةmoval من التلوث والخلايا الليفية مع كرات الدم الحمراء وكذلك الثقافة الابتدائية والتحقق بصورة موثوق بها من أصل سرطان الجلد الخلايا. كشفت تقارير حديثة أن الميلانينية، مثل معظم الأورام، الميناء جزء من السكان صغيرة من الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية)، والذي يبدو لتغذية حصرا بدء الورم والتقدم نحو الدولة النقيلي. واحدة من علامات رئيسية لتحديد CSC والعزلة في سرطان الجلد هو CD133. CD133 + لعزل الخلايا الجذعية السرطانية من سرطان الجلد الثقافات الأولية، وقمنا بتعديل الأمثل لفرز الخلايا المغناطيسي المنشط (MACS) الإجراء من Miltenyi مما أدى إلى نقاء عالية والفرز CD133 + صلاحية الخلايا الجذعية السرطانية وCD133 - السائبة، والتي يمكن زراعتها وتحليلها وظيفيا بعد ذلك.

إعداد الخلايا واحد من الأنسجة الورم الشكل 2 مثالا على الانبثاث العقدة الليمفاوية مقطوعة لمريض سرطان الجلد في وقت متأخر قبل المرحلة (A) وبعد تفكك الميكانيكية (B) إلى قطع مم 2-4. بعد تفكك الأنزيمية من النسيج والترشيح من خلال شبك...

Watch this Scientific Journal Video about Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma at JoVE.com

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

توضح هذه المقالة إعداد الأنسجة التي تم الحصول عليها حديثا في سرطان الجلد الثقافات الخلية الأولية، وكيفية إزالة التلوث من الكريات الحمراء والخلايا الليفية من الخلايا السرطانية. وأخيرا، نحن تصف كيفية CD133<sup&gt; +</supيتم تصنيف&gt; الجذعية خلايا سرطان الجلد المفترضة من CD133<sup&gt; -</sup&gt; معظم المغناطيسي باستخدام الفرز الخلية المنشط (MACS).

زراعة الخلايا المشتقة المريض وعزل CD133<sup&gt; +</sup&gt; خلايا الجذعية السرطانية المزعومين من الميلانوما

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

patient-derived-cell-culture-isolation-cd133-putative-cancer-stem

Research

JoVE Journal

Medicine

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

21.1K Views.  Charité - Universitätsmedizin Berlin. توضح هذه المقالة إعداد الأنسجة التي تم الحصول عليها حديثا في سرطان الجلد الثقافات الخلية الأولية، وكيفية إزالة التلوث من الكريات الحمراء والخلايا الليفية من الخلايا السرطانية. وأخيرا، نحن تصف كيفية CD133 + الجذعية خلايا سرطان الجلد المفترضة من ...

Video: Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

العزلة نوى Cardiomyocyte من الأنسجة بعد الوفاة

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا الثديية سابق للورم ظهاري الأولية المستمدة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا لسرطان الثدي

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

عزل الخلايا الجذعية للسرطان من العينات البشرية سرطان البروستاتا

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

لتخصيب Chemoresistant سرطان المبيض الخلايا الجذعية من خطوط الخلايا البشرية

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

العزلة وتخليد خطوط الخلايا المشتقة من المريض من خزعة العضلات لمرض النمذجة

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

العزلة وثقافة توسيع ورم محددة الخلايا البطانية

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

جيل من سرطان البروستاتا المريض المشتقة نماذج طعم أجنبي من تعميم الخلايا السرطانية

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

العزلة والخلوية Phenotyping من الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع الزلالية السائل والعظام من Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...