Yazarlar bu işi desteklemek ve eleştirel bir yazının okunması için M. Dietel ve Dirk Schumacher ederim. Bu sonuçlara yol açan araştırma hibe anlaşması n altında Yenilikçi İlaçlar Girişimi Ortak Taahhüt ° 115234, Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) ve EFPIA şirketlerin &#39;in mali katkı oluşmaktadır hangi kaynaklardan destek aldı Ayni katkı. Bu çalışma aynı zamanda Berliner Krebsgesellschaft (BKG) tarafından desteklenmiştir.

Birincil hücre kültürü, fibroblast tükenmesi ve CD133 manyetik hücre sıralama tümör dokusu, karakterizasyonu ikinci birincil tek hücrelerin hazırlanmasını da içeren deney genel düzeni + ve CD133 - melanom hücrelerinin Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. 1. Örnek Toplama <ol><li> Sonraki adımlar dikkate alınarak önce etik kurul onayı için kontrol edin. </li><li> Steril PBS cerrahi OR ekibine% 1 Penisilin-Streptomisin final konsantrasyon ve el ile desteklenmiş bir 50 ml tüp hazırlayın. </li><li> 4 ° C&#39;de cerrahi hücre kültürü laboratuarına tümör dokusunun hızlı ulaşım Organize </li></ol> 2. Tümör Dokusu Primer Melanom Tek hücre hazırlanması <ol><li> Steril koşullar altında tüm adımları uygulayın. </li><li> Tümör rezeksiyonu önce, bir ayrışma karışımı hazırlamak gerekmektedir. 2-4 g doku başına 10 ml ayrışma karışımı gereklidir. Karışım immedia kullanılabilirlarına ya da daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de 10 ml alikots içinde saklanmıştır. <ol><li> 150 mM sodyum klorid içeren bir çözelti hazırlayın. Çözümü netleşene kadar bir girdap kullanarak karıştırın. Eğer bir 0.22 um filtre kullanılarak steril gerekli-Süzülen madde sodyum klorür çözeltisi. </li><li> DNaz I tartılır ve 10 mg / 150mm sodyum klorür ml DNaz I içeren bir solüsyon hazırlanır. Çözümü netleşene kadar alt üst edilerek karıştırılır. </li><li> PBS içinde 100mg/ml Kollajenaz IV içeren bir solüsyon hazırlayın. Çözümü netleşene kadar alt üst edilerek karıştırılır. Kolajenaz çözeltisi alikotlar birkaç ay boyunca -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> % 1 Penisilin-Streptomisin, 1 mg / ml kollajenaz IV, ve 0.1 mg / Quantum 263 orta ml DNase I, bir son konsantrasyon ile ayrışma karışım hazırlayın. Bir girdap kullanarak karıştırın. İsteğe: 1.5 ug / ml amfoterisin B&#39;nin bir nihai konsantrasyon için ayrışma karışımına ekleyin cilt amfoterisin B çözeltisi elde edilen melanom doku kullanıldığında </li></ol></li><li> Pre-sıcak req37 disosiyasyon karışımı, PBS ve Kuantum 263 orta uired miktarda ° C. </li><li> Steril bir Petri kabı yerleştirin tümör dokusu. Doku aşırı çözüm aspire ve 500 ul dissosiyasyon karışımı ekleyin. Taze, steril neşter kullanılarak 2-4 mm küçük parçalar halinde doğrayın tümörü. </li><li> Transferi 2-4 gr 5 ml dissosiasyon karışımını içeren GentleMACS C Tüp içine tümör dokusu kıyılmış. Ek 4.5 ml disosiyasyon karışımı ile Petri durulayın ve GentleMACS C Tüp kalan doku parçaları ekleyin. </li><li> GentleMACS C tüpü kapatın ve GentleMACS Dissociator bir kol üzerine ters takın. GentleMACS programı &quot;h_tumor_01&quot; çalıştırın. </li><li> Dissociator gelen GentleMACS C tüpü ayırın ve 37 az 30 dakika örnek inkübe ° C yerleşti dokusu parçalanmakta süspansiyonu her 5 dk yüksek çalışma hızı (12 rpm) veya manuel olarak tüp çevirerek MACSmix Tüp Rotator kullanarak sürekli rotasyon altında . </li><li> T kol üzerine baş aşağı GentleMACS C boru takınO GentleMACS Dissociator ve GentleMACS programı &quot;h_tumor_02&quot; çalıştırın. </li><li> Dissociator gelen GentleMACS C tüpü ayırın ve 37 az 30 dakika örnek inkübe ° C yerleşti dokusu parçalanmakta süspansiyonu her 5 dk yüksek çalışma hızı (12 rpm) veya manuel olarak tüp çevirerek MACSmix Tüp Rotator kullanarak sürekli rotasyon altında . </li><li> GentleMACS Dissociator bir kol üzerine baş aşağı GentleMACS C tüpü takın ve GentleMACS programı &quot;h_tumor_03&quot; çalıştırın. </li><li> Dissociator, tekrar süspansiyon örnek GentleMACS C tüp ayırın ve bir 50 ml tüp üzerine yerleştirilmiş bir 70 mikron hücre süzgeci için hücre süspansiyonu uygulanır. Filtrenin tıkanma oluşursa komple süspansiyon koştu kadar steril bir filtre ucu ile hücre süspansiyonu karıştırın. </li><li> 5 ml Kuantum 263 orta hücre süzgecinden durulayın. </li><li> İsteğe bağlı: Eğer hala Kuantum 263 orta ve uygun bir hücre kültürü dis tohum onları filtre, tekrar süspansiyon parçaları kalan doku parçaları varsah. 37 parça inkübe ° C ve% 5 CO2. </li><li> Hücre süzgecinden atın ve sindirilmiş hücre süspansiyonu ile 50 ml tüp kapatın. 300 x g&#39;de 5 dakika süreyle hücre süspansiyonu santrifüjleyin ve supernatant atın. </li><li> İsteğe bağlı: hücre pelletini nedeniyle eritrositler 500 ul PBS çift damıtık su, tekrar süspansiyon hücre pelletini 10x çözümü 01:10 sulandırarak 1x Kırmızı Kan Hücresi Lizis Çözüm hazırlamak yüksek miktarda ve 5 ml 1x Kırmızı Kan Hücresi Lizis ekleyebilir, kırmızı görünüyorsa Çözüm. 10 dk için oda sıcaklığında Vortex 5 saniye ile inkübe edin. 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve supernatant atın. </li><li> Quantum 263 ve tohum uygun hücre kültürü şişesi içinde hücreleri ile tümör hücrelerinin yeniden süspanse edin. 37 Kültür tümör hücrelerinin ° C ve% 5 CO2 ve% 80 izdiham ulaşmak rutin olarak geçit hücreleri. </li></ol> 3. Primer Hücre Kültürü ve Fibroblast tükenmesi Karakterizasyonu <ol><li> Fenotipik bir microsco kullanılarak primer hücre kültürü analizpe. </li><li> Primer hücre kültürü küçük bir miktar (0.5x 10 6 hücre) Hasat ve neoplastik-, melanom-, kök hücre ve stroma hücre işaretleyici genler için primerler ile RT-PCR işlemi gerçekleştirmek. Analiz etmek için en önemli genler CD90 (fibroblast işaretleyici), TYR (melanom / melanosit işaretleyici), CD133 (kanser kök hücre belirteci), CD83 (olgun dendritik hücreler için marker) ve bir temizlik gen (örn. HPRT ya GAPDH) vardır. </li><li> RT-PCR sırasında mikroskopik analizi ve CD90 yüksek ifade fibroblast ile primer melanom kültürünün yüksek kontaminasyon saptandı varsa, Miltenyi gelen Anti-Fibroblastlar microbeads ve D sütunları kullanarak fibroblastlar tüketmek gerekir. </li></ol> 4. Manyetik Hücre CD133 arasında Ayırma + ve CD133 - LS sütunlar kullanma Melanom Hücreleri <ol><li> PBS içinde 2 mM EDTA,% 5 FCS ihtiva eden tampon MACS hazırlayın. 0.22 mikron Steritop-GP Filtre Ünitesi kullanarak eviren ve steril-süzüntü tampon ile karıştırın. 4-8 ° C Hissedilen tamponKullanmadan önce ve degas. </li><li> 37 Pre-sıcak Accutase, PBS ve Kuantum 263 orta ° C. </li><li> PBS ile 80% konfluent hücreleri yıkayın. Accutase uygun miktarda ekleyin ve hücrelerin kültür yüzeyden koparak kadar inkübe edin. Quantum 263 ortamı kullanılarak bir 50 ml tüp içinde hücreler toplayın. </li><li> Hücre sayısı belirleyin ve az 5 dakika boyunca hücrelerinin gerekli sayıda (2x 10 9 hücrelerin azami sayıda LS Sütun başına yüklenmiş olabilir. Hücre hattı belirli optimum numaralarını tespit edilmeli ve oldukça düşük olabilir Miltenyi protokolüne göre.) Santrifüj 300 xg ve 4-8 ° C&#39;de Tamamen süpernatant aspire. </li><li> 350 ul MACS tamponu ile 1x 10 8 hücre azami (yüksek hücre numaraları buna göre aşağıdaki tüm MACS tamponu büyütmek, FCR Engelleme Reaktif, CD133/1-Biotin ve anti-Biotin microbeads birimler için) tekrar. </li><li> 100 ul FCR Engelleme Reaktif ekleyin. </li><li> 50 ul CD133/1-Biotin ekleyin. 4-8 bir vorteks ve inkübe kullanarak iyice karıştırın ° C fya da 10 dk. </li><li> 300 xg ve 4-8 ° C sıcaklıkta 5 dk için 10 ml MACS tampon ve santrifüj ekleyerek yıkayın hücrelerini Tamamen süpernatant aspire. </li><li> Yıkama adımı (4.8) tekrarlayın </li><li> 400 ul MACS tamponu ile tekrar süspansiyon hücre pelletini. </li><li> 100 ul anti-biotin mikro-küreler ekleyin. 15 dakika boyunca 4-8 ° C&#39;de bir vorteks ve inkübe kullanarak iyice karıştırın. </li><li> Bu arada, manyetik ayırma için MACS ayırıcı hazırlamak. MACS Ayırıcı Çoklu Stand QuadroMACS takın. QuadroMACS bir manyetik alanda ön sütun kanatlarıyla LS sütun gerekli sayıda yerleştirin. Her sütun altında her bir LS kolon ve uygun bir toplama tüpü (15 ml, 50 ml) içine bir ön ayırma filtresi (30 um Naylon filtre) yerleştirin. 3 ml MACS tamponu ile durulama filtre ve sütun hazırlayın. Flow-through atın. </li><li> 300 xg ve 4-8 ° C sıcaklıkta 5 dk için 10 ml MACS tampon ve santrifüj ekleyerek yıkayın hücrelerini Tamamen süpernatant aspire. </li><li> 500 ul hücreler süspanseMACS Pre-Ayırma Filtre ile LS kolona hücre süspansiyonu tampon ve uygulamak. </li><li> Sütun başına 3 ml MACS tamponu ile üç kez yıkayın. Sütun haznesi boşaldığında Sadece yeni bir tampon ekleyin. </li><li> Hücre fraksiyonu - toplanan toplam atık etiketsiz CD133 içerir. </li><li> Pre-Ayırma Filtre atın, ayırıcı gelen sütunu kaldırmak ve uygun bir toplama tüpü üzerine yerleştirin. </li><li> 5 ml MACS tamponu uygulayın. Hemen sıkıca sütuna pistonu iterek etiketli CD133 + hücreler dışarı floş. </li><li> Negatif fraksiyonunun saflığı arttırmak için, QuadroMACS yerleştirilen yeni bir LS dengelenmiş sütun üzerine hücre süspansiyonu uygulanır. Fraksiyon - atık CD133 içerir. </li><li> Sütunlar atın. </li></ol>

<ol>
	<li>Garibyan, L., Fisher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sunlight+causes+melanoma.">How sunlight causes melanoma.</a> Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).</li><li>Radovic-Kovacevic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+in+patients+with+cutaneous+malignant+melanoma.">Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma.</a> Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).</li><li>Lens, M. B., Eisen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+chemotherapy+in+the+treatment+of+malignant+melanoma.">Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma.</a> Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).</li><li>Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+therapy+of+disseminated+malignant+melanoma:+an+evidence-based+overview+of+the+state-of-the-art+in+daily+routine.">Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine.</a> J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).</li><li>Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Der Onkologe. 16, 1160-1166 (2010).</li><li>Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemische+Therapie+des+metastasierten+Melanoms:+Ergebnisse+randomisierter+Studien+der+letzten+zehn+Jahre.">Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre.</a> Deutsches &#196;rzteblatt. 100, (2003).</li><li>Chapman, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+with+vemurafenib+in+melanoma+with+BRAF+V600E+mutation.">Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation.</a> N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).</li><li>Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines:+friend+or+foe.">Breast cancer cell lines: friend or foe.</a> Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).</li><li>Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+differences+among+MCF-7+human+breast+cancer+cell+lines+from+different+laboratories.">Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).</li><li>Hiorns, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA+expression+and+genomic+DNA+content+acquired+during+cell+culture.">Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture.</a> Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).</li><li>Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-contamination+of+cells+in+culture.">Cross-contamination of cells in culture.</a> Science. 212, 446-452 (1981).</li><li>MacLeod, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+intraspecies+cross-contamination+of+human+tumor+cell+lines+arising+at+source.">Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source.</a> Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).</li><li>Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cancer+cell+lines:+fact+and+fantasy.">Human cancer cell lines: fact and fantasy.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).</li><li>Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Single-Cell+Suspensions+from+Mouse+Neural+Tissue.">Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue.</a> J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).</li><li>Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermis-derived+stem+cells:+a+source+of+epidermal+melanocytes+and+melanoma.">Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li><li>Ieta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+genetic+characteristics+of+tumor-initiating+cells+in+colon+cancer.">Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer.</a> Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).</li><li>Bertolini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+tumorigenic+lung+cancer+CD133++cells+display+stem-like+features+and+are+spared+by+cisplatin+treatment.">Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).</li><li>Monzani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+contains+CD133+and+ABCG2+positive+cells+with+enhanced+tumourigenic+potential.">Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential.</a> Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).</li><li>Gedye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer/testis+antigens+can+be+immunological+targets+in+clonogenic+CD133++melanoma+cells.">Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).</li><li>Kobari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++cell+selection+is+an+alternative+to+CD34++cell+selection+for+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+cells.">CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).</li><li>Quirici, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+expansion+of+endothelial+cells+from+human+bone+marrow+CD133(+)+cells.">Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells.</a> Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).</li><li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone,+but+on+embryonic+neural+stem+cells,+ependymal+cells,+and+glioblastoma+cells.">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).</li><li>Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbody+and+primary+cilium+of+neural+progenitors+release+extracellular+membrane+particles+enriched+in+the+stem+cell+marker+prominin-1.">Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1.</a> J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).</li><li>Florek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+neural+and+hematopoietic+stem+cell+marker,+is+expressed+in+adult+human+differentiated+cells+and+certain+types+of+kidney+cancer.">a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer.</a> Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+Mouse+Lymph+Nodes+Using+Miltenyi+MACS+Purification.">Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification.</a> J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).</li><li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Immune+Cells+from+Primary+Tumors.">Isolation of Immune Cells from Primary Tumors.</a> J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).</li><li>Mollamohammadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+cryopreservation+method+for+feeder-free+dissociated+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+human+embryonic+stem+cells.">A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Tümör hücre pelet eritrosit kontaminasyonu kaldırmak için biz son derece Miltenyi gelen kırmızı kan hücre lizis çözüm kullanmanızı öneririz. Geleneksel Ficoll yoğunluk gradyan santrifüj üzerine eritrositlerin parçalayıcı avantajları, daha hızlı ve daha basit olmasıdır. Ayrıca, Ficoll ve kırmızı kan hücreleri ve tümör hücreleri kaybı ile kirlilikler önlenir. Çok uzun beklerken normalde tümör hücrelerinin Overgrow beri primer hücre kültürü fibroblastların büyümesini gözlemle...

Kutanöz malign melanom cilt kanseri en sık görülen, ama en ölümcül türüdür. Artan bir insidans, ölümleri 1,2 ilişkili malign deri tümörlerinin% 75 malignite ve hızlı yayılması bir yüksek dereceli, şimdi melanomlar hesabı nedeniyle. Primer tümör, kemoterapi, radyoterapi, immünoterapi ve metastas melanom kombine kemoterapi ve immünoterapi cerrahi eksizyon yanında melanom tedavisinde 3,4 için state-of-the-art stratejilerdir. Ancak, malign melanom kemoterapötiklerin zayıf yanıt (% 5-12) 5,6 ve Hazır vemurafenib 7 ile tedavi gibi yeni hedefli tedaviler vadeden BRAF V600E gen mutasyonunun yararı taşıyan melanom hastalarının yalnızca% 50-70 ile karakterizedir sağkalımı, melanom Tümörgenez mekanizmaların daha iyi anlaşılması gereklidir. Geçmişte, köklü ticari bu mekanizmaların incelenmesilikle mevcut hücre çizgileri kullanıldı. Kanser başlangıcı ve ilerlemesindeki moleküler olayları incelemek için daha yeni yaklaşımlar tümör dokusunun doğrudan elde primer kültürlerinde kullanmak - bir strateji rulman manifoldu faydaları: araştırmacı hasta ve doku seçimi üzerinde tam denetime sahiptir. Örneklenen hücreler ustaca seçilen tümör dokusu elde, tüm heterojenite ile tümörü andıran ve takip hastanın verileri ve ayrıntılı patoloji kültürünün özelliklerini orijinal tümör 8 ile karşılaştırıldı izin vermek için kullanılabilir. Buna karşılık, kanser araştırma ilgili model sistem olarak oluşturulmuş hücre hattını kullanmak tartışılmaktadır. Zaten 1987 yılında Osborne ve arkadaşları farklı laboratuvarlarda 9 MCF-7 insan meme kanseri hücre hatları arasında önemli biyolojik farklılıklar açıklanmıştır. Altkültür sırasında RNA ekspresyonunda Bu geniş genomik kararsızlık ve değişkenlik işbirliği olduHiorns ark nfirmed. ve hücre hatları böylece insan kanser 10 modelleri gibi kurulan kültürlerin doğrudan alaka zayıflaması, kültür gelişmeye emin delil destekleyici veriler sağladı. Büyük ölçüde yıllar boyunca ihmal edilen bir diğer önemli göz, hücre hatları çok sayıda HeLa ile kirlenmiş olduğunu ilk göstererek yirmi yıl önce çizildi ilgisiz &#39;false&#39; hücreleri ile kültürlerin kontaminasyon veya büyümesi riski olduğunu hücreleri 8,11. &#39;Yanlış&#39; hücre hatları verilerin yanlış yorumlanmasına son zamanlarda tekrar literatürde açık olarak ortaya çıkmıştır. DNA profili ve moleküler sitogenetik bir arada kullanarak, McLeod ve ark. 252 yeni tümör türevli insan hücre hatları, Mikroorganizmalar ve Hücre Kültürleri (DSMZ), Alman Collection tevdi yaklaşık% 18 oranında intraspecies olduğu bulunmuştur ya da çapraz türler arası olduğunu göstermiştir -kirletici 12,13. Bu sorunları önlemek için ve yukarıda belirtilen avantajlardan yararlanmak için, biz yeni eksize metastaz düşük-geçiş melanom hücre hatları kurmaya karar verdi. Sağlam hücre ayırma ve analiz teknolojileri eşzamanlı karakteristik yüzey proteinleri hücre ölüm ve yıkım sınırlayan ise tek hücreli preparatlar elde edilecek gerektirir. Tek hücre süspansiyonları içine dokuların otomatik ayrışma için benchtop enstrüman Miltenyi tarafından imal GentleMACS Dissociator olduğunu. Antijen epitoplarının korunması ve hücre kaybını azaltma süre GentleMACS C tüp ve optimize edilmiş ayrışma çözeltiler, kapalı bir sistem içerisinde tümör dokusunda etkili ve yumuşak bir ayrılma ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman elde edilir. Enstrüman özel uygulamalar ve teminatlar melanom dokusunun 14 tek hücre süspansiyonları standardize hazırlık çeşitli için optimize edilmiş, önceden ayarlanmış programları sunmaktadır. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; tümörlerin çoğunluğu sadece tümör başlatılması ve kapasite kendini yenileyen sergilerler denilen kanser kök hücreleri (rulmanları), küçük bir subpopülasyonu liman ortaya çıkanlar raporlar. Derinin dermis melanosit üreten kök hücrelerinin tanımlanması UVA ışınlarına maruz malign transformasyon 15 için bu hücreleri hazırlamak çünkü bu hücrelerin melanom kanser kök hücreleri (rulmanları) kökeni olabileceği hipotezini doğurmuştur. Bu tür bir genetik lezyon sonucu, tümör ve kök hücre özelliklerinin bir kombinasyonu liman hücreler olacaktır. Melanom rulmanları ve alt sınıfı için önerilen anahtar belirteçlerin biri CD133 16-20 olduğunu. CD133 (ayrıca Prominin 1 olarak da bilinir), pentaspan transmembran glikoproteinler üyesi, hematopoetik kök hücreler, endotelyal progenitör hücreleri, nöronal ve glial kök hücreleri 21-23 olarak ifade edilir. CD133 ekspresyonu ile korelasyonasimetrik hücre bölünmesi 24, ve CD133 ve glikosilatlı epitop 25 hücre farklılaşması üzerine aşağı regüle olduğu gösterilmiştir. Son zamanlarda, CD133 + melanom hücrelerinin kendini yenileme ve tümör-inisiyasyon kapasitesi 19,20 olduğu gösterilmiştir. CD133 + olası melanom rulmanları fonksiyonunu incelemek için, değiştirilmiş ve CD133 yüksek derecede zenginleştirilmiş ve canlı popülasyonları + ve CD133 elde Miltenyi Biotech gelen Manyetik-Aktif Hücre Ayırma (MACS) sistemi optimize - hücreleri. Matheu ark gösterildiği gibi Manyetik boncuk tabanlı hücre ayırma ya negatif seçim için izin verir. 26 veya pozitif seleksiyon Burada göstereceğimiz gibi. Pozitif seçimi sırasında özellikle hedef hücre tipi, örneğin CD133 eksprese eden hücrelerin, manyetik bir karşı yüksek düzeyde özgül antikorlarla konjuge olan microbeads, 50-nm Süperparamanyetik parçacıkları ile etiketlenmiştirözel hücre yüzeyi antijenine. Etiketsiz hücreleri akmasına ise ayrılık sırasında, manyetik etiketli hücreleri, ayırıcı manyetik alanında sütun içinde korunur. Yıkama adımları takiben, sütun ayırıcı manyetik alan kaldırılır ve hedef hücrelerin sütundan elüt edilmiştir. LS veya MS sütunları yüksek saflıkta etiketli ve etiketsiz hücre fraksiyonları pozitif seleksiyon sonucu sırasında kullanılır. Diğer taraftan, negatif seleksiyon için kullanılan LD kolonlar, etiketli fraksiyonunun biraz daha düşük bir saflık ile sonuçlanır. Bunların matris ambalaj yoğun olması nedeniyle bu sütunlarda debi sütununda tuzağa, etiketsiz hücrelerin daha yüksek bir risk düşük sonuç olduğunu. LD sütunları nedenle istenmeyen bir hücrenin alt populasyonun sıkı tükenmesi için kullanılmalıdır. Pozitif seçim incubatio aşağıdaki mikro-küreler ile doğrudan (mikro-küreler bağlanmış antikor) veya dolaylı manyetik etiketleme (kuluçka ile gerçekleştirilebilirN birincil antikor ile birlikte). Spesifik MACS mikro-küreler ya da prostat melanom 27 gibi primer tümör hücrelerinin çok sayıda hücre tiplerinin pozitif seçim için kullanılabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> Amfoterisin B çözeltisi 250 ug / mL deiyonize su içinde </td><td> Sigma-Aldrich Inc </td><td> A2942-50ml </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fibroblastlar mikro-küreler </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz IV </td><td> Sigma-Aldrich Inc </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> DNaz I </td><td> Applichem GmbH </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> Ca, Mg olmadan D-PBS </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> H15-002 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat (EDTA), </td><td> Sigma-Aldrich Inc </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS Üstün </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> Dolaylı CD133 Mikro-Boncuk Kiti insan </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-091-895 </td><td> Kapsar: CD133 / 1 (AC133)-Biotin, anti-Biotin microbeads ve FCR Engelleme Reaktif </td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin, sıvı (100x) </td><td> Invitrogen GmbH </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kuantum 263 </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> Kırmızı Kan Hücre Lizis Solüsyonu (10x) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ekipman </td></tr><tr> &lt;td&gt; Hücre süzgeci (70 mikron) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> GentleMACS C Tüpler </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> GentleMACS Dissociator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Ayırıcı Multi Standı </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Ayırma Sütunlar 25 LS Sütunlar </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> MACSmix Tüp Rotator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Merck KGaA </td><td> 567440-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Pre-Ayırma Filtreler </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-041-407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> QuadroMACS Ayırıcı </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Rotilabo-şırınga filtreleri (0.22 mikron, PES) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP Filtre Birimin&#39;den 500 ml </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma

Mevcut melanom bugün için daha iyi tedaviler seçenekleri rağmen, ileri malign melanom hastalarında hala progresyonsuz ve genel sağkalım için kötü bir prognoza sahiptir. Bu nedenle, translasyonel araştırma malign melanom için hedefli tedaviler geliştirmek için ileri moleküler kanıtlar sağlaması gerekir. Melanom ile ilgili geçmişte, onkojenik mekanizmalar yoğun yerleşik hücre hatları çalışıldı. Bireysel genetik profillerine dayalı daha kişiselleştirilmiş tedavi rejimleri için yolda, biz hasta türevi hücre hatları yerine jenerik hücre hatları kullanmayı öneriyoruz. Birlikte özellikle hasta takibi üzerine yüksek kalitede klinik verilerle birlikte, bu hücreler daha melanoma ilerleme arkasında moleküler mekanizmaları anlamak için vesile olacaktır. Burada disseke taze tümör dokusu primer melanom kültürlere kurulması rapor. Bu işlem, tek bir hücre içine kıyma ve doku ayrışma, yeniden içerireritrositler ve fibroblastlar gibi primer kültür ve hücrelerin melanom kökenli güvenilir doğrulama ile kontaminasyonların moval. Son raporlar ortaya koydu melanomlar, tümörlerin çoğunluğu gibi, limana sadece metastatik devlete karşı tümör gelişimini ve ilerlemesini yakıt gibi kanser kök hücreleri (rulmanları), küçük bir subpopülasyonu. Melanom CSC kimlik ve izolasyon için önemli belirteçler biri CD133 olduğunu. Primer melanom kültürlere ait CD133 + rulmanları yalıtmak için, değiştirilmiş ve Manyetik-Aktif Hücre yüksek sıralama saflıkta sonuçlanan Miltenyi gelen Sıralama (MACS) prosedürü ve CD133 + rulmanları ve CD133 canlılığı optimize - dökme, ekili ve fonksiyonel analiz edilebilir bundan sonra.

Tümör dokusu tek-hücrelerinin hazırlanması Şekil 2 (A) ve (B) mekanik ayrışma sonra 2-4 mm parçalar halinde önce bir geç evre melanom hastasının rezeke lenf nodu metastazı örneğidir. Bir 70 mikron naylon ağ gözünden doku ve süzme enzimatik ayrılma sonrasında, hücreler peletlenmiş ve süpernatan atılır. Bu aşamada biz Şekil 2C hücre pelet kırmızımsı bir renk ile belirtilen eritrositler ile yüksek kirlilik gözlenmiştir. Daha so...

Watch this Scientific Journal Video about Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma at JoVE.com

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Bu makale, birincil hücre kültürleri ve nasıl tümör hücrelerinden eritrositler ve fibroblastların kirlilikler çıkarmak için taze olarak elde edilen melanom doku hazırlanmasını tarif etmektedir. Son olarak, biz nasıl tarif CD133<sup&gt; +</sup&gt; Farzedilen melanom kök hücreler CD133 doğru sıralanır<sup&gt; -</sup&gt; Manyetik Aktif Hücre Ayırma (MACS) kullanarak toplu.

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

patient-derived-cell-culture-isolation-cd133-putative-cancer-stem

Research

JoVE Journal

Medicine

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

21.1K Görüntüleme.  Charité - Universitätsmedizin Berlin. Bu makale, birincil hücre kültürleri ve nasıl tümör hücrelerinden eritrositler ve fibroblastların kirlilikler çıkarmak için taze olarak elde edilen melanom doku hazırlanmasını tarif etmektedir. Son olarak, biz nasıl tarif CD133 + Farzedilen melanom kök hücreler CD133 doğru sıralanır - Manyetik Aktif Hücre Ayırma (MACS) kullanarak toplu.

Video: Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Tıp

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

İnsan Prostat Kanseri Örneklerinden Kanser Kök Hücreleri İzolasyon

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

İnsan Hücre Lines Kemorezistans Yumurtalık Kanser Kök Hücreleri Zenginleştirme

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Tümör spesifik Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü Genişleme

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Prostat Kanseri Hasta Üretimi Tümör Hücreleri Sirkülasyon gelen Xenograftlarında Modeller Türetilmiş

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Mini-domuzlarda sinovyal sıvı ve Kemik İliği Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Hücresel Fenotiplendirme

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...