Damos las gracias a la Sra. Caroline Robertson por la voz en off y la señora Elena Pirovano por su ayuda en la producción de video. Este estudio fue apoyado por la Universidad de Milano Bicocca, &quot;Fondo di Ateneo 2011&quot;.

1. Cómo hacer que el soporte giratorio (de un solo sitio o varios centros) <ol><li> Los materiales necesarios son el caucho natural, pequeños tubos de plástico y un estilete de metal. El soporte de la sonda puede ser personalizado para el tamaño del animal, el número y tamaño de las sondas láser Doppler, y el territorio vascular cerebral que necesita ser monitorizado. </li><li> Cortar el caucho natural del tamaño necesario (aproximadamente 10 mm x 10 mm para una rata de 300 g). </li><li> Marcar las posiciones de la sonda (s) y el bregma en el caucho natural, de acuerdo con las coordenadas estereotáxicas deseados; para la oclusión de la arteria cerebral media, las coordenadas típico para el núcleo isquémico se espera a bregma -1 mm, 5 mm lateral a la línea media; para un territorio isquémico borderzone periférica, las coordenadas pueden ser esperados en bregma +2 mm, 2 mm lateral a la línea media. </li><li> Marcar muy claramente la posición del bregma con una X, éste es el punto de referencia para fijar el soporte de la sonda en el cráneo. &lt;/ Li&gt; <li> Insertar el estilete dentro de un pequeño tubo de plástico (su tamaño debe coincidir con el tamaño de la sonda). </li><li> Insertar el estilete en el caucho natural en el punto donde la sonda tiene que ser colocado; empujar el estilete en el caucho hasta que el tubo de plástico ha sido insertado en el caucho también. </li><li> Retire el estilete. </li><li> Si se necesitan varias sondas, repita los pasos 1.5-1.7 para las posiciones sonda. </li><li> Opcional para múltiples sondas: envolver una cinta alrededor de los tubos de plástico para garantizar una mejor estabilización de las sondas. </li><li> Opcional: realizar la esterilización química de los titulares de varias sondas para usos futuros. </li></ol> 2. Preparación prequirúrgica <ol><li> MCAO modelo de carrera se realiza generalmente como una cirugía de supervivencia. En este caso, como se muestra en nuestro vídeo (tiempo de supervivencia 24 horas después de la cirugía), el cirujano utiliza una técnica aséptica con instrumentos esterilizados y suministros. </li><li> Se anestesia la rata con isoflurano (3% induction fase, 1,5% de mantenimiento). </li><li> Coloque el ratón en la posición en decúbito prono sobre la mesa de operaciones. </li><li> Suavemente afeitar la cabeza de la rata. </li><li> Aplique una solución antiséptica para una gasa y desinfectar la piel. </li><li> Administrar lidocaína 2% 5 mg / kg por vía subcutánea en la zona craneal. </li></ol> 3. Sonda de posicionamiento y sujeción sobre el cráneo intacto <ol><li> Haga una incisión paramediana derecha de la piel (por derecho MCAO) y disecar el tejido subcutáneo para alcanzar la fascia craneal (galea aponeurótica). </li><li> Hacer una incisión paramediana derecha en la fascia craneal y realizar una disección roma para alcanzar el hueso del cráneo; preparar un área de hueso del cráneo, que es lo suficientemente grande para la aplicación del soporte de la sonda. </li><li> Atención: no hay necesidad de perforar o adelgazamiento de los huesos. </li><li> Aplique la solución Merbromina para desinfectar y secar la superficie del cráneo. </li><li> Use un secador de pelo (fijada en el aire frío) para acelerar el secado de la superficie del cráneo. </li&gt; <li> En este punto, las suturas craneales y el bregma son claramente visibles. </li><li> Personalice el soporte de la sonda cortando los bordes con unas tijeras estériles. </li><li> Aplique una pequeña cantidad de pegamento quirúrgico (cianoacrilato, veterinario aprobado) a la superficie por debajo del soporte de la sonda, evitando cuidadosamente la abertura inferior de los tubos de plástico (tenga en cuenta: si una cantidad significativa de restos de pegamento entre la superficie óptica de la sonda y el cráneo, esto puede producir una señal de bajo y puede dañar la sonda después de múltiples usos). </li><li> Aplicar el soporte de la sonda a la superficie del cráneo, el bregma cuidadosamente a juego con el punto de referencia X. Aplique una leve presión sobre el soporte de la sonda. </li><li> Use un secador de pelo (fijada en el aire frío) para acelerar el secado del pegamento quirúrgico. </li><li> Fijar el soporte de la sonda mediante la vinculación de un hilo quirúrgico alrededor del soporte de la sonda y la cabeza del animal; tener cuidado de colocar el hilo quirúrgico sobre la mandíbula, evitando la región submandibular y the cuello. </li><li> Opcional: llenar el tubo de plástico (s) del soporte de la sonda con un gel óptico (por ejemplo, un ultrasonido común o gel electrocardiografía), lo que aumentará la calidad de la señal LD. </li><li> Coloque la sonda (s) en el soporte de la sonda y verificar la lectura real del medidor de caudal LD. Utilice el medidor de caudal LD ​​según las instrucciones del fabricante. </li><li> Asegure la sonda (s) atándolos alrededor de la cabeza del animal; tener cuidado de colocar el hilo quirúrgico sobre la mandíbula, evitando la región submandibular y el cuello. </li></ol> 4. Monitoreo perfusión cerebral durante la MCAO <ol><li> Coloque el ratón en la posición supina, evitando cuidadosamente las fuerzas traccionales en la sonda (s) o titular de la sonda. </li><li> Empiece monitorización de la perfusión cerebral durante MCAO. </li></ol> 5. Extracción de la sonda (s) y de la Sonda Holder <ol><li> Cortar las suturas alrededor de la sonda (s), el soporte de la sonda y la cabeza del animal. </li><li> Suavemente contundente disección de los tejidos blandos del cráneo y la piel alrededor de la base de goma natural del soporte de la sonda. </li><li> Retire el soporte de la sonda. </li><li> Aplicar una solución antiséptica para la superficie del cráneo. </li><li> Sutura de la piel del cráneo. </li></ol> 6. Cuidados postoperatorios <ol><li> Administrar 2,5 ml de solución salina por vía subcutánea para prevenir la deshidratación y mantener caliente el animal usando una compresa caliente después de dejar de anestesia gaseosa. </li><li> Para la cirugía de la supervivencia: proporcionar analgesia preventiva con Ketoprofeno 4 mg / kg por vía subcutánea y repetir la misma dosis a las 12 h post-operativamente </li><li> Bajo nuestras condiciones experimentales, la eutanasia se realizó a las 24 horas después de la cirugía por inhalación de CO 2. </li></ol>

<ol>
	<li>Sutherland, B. A., Papadakis, M., Chen, R. L., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+blood+flow+alteration+in+neuroprotection+following+cerebral+ischemia.">Cerebral blood flow alteration in neuroprotection following cerebral ischemia.</a> J. Physiol. 589, 4105-4114 (2011).</li><li>Prinz, V., Endres, M., Dirnagl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3+Modeling+focal+cerebral+ischemia+in+rodents:+Introduction+and+overview.">Chapter 3 Modeling focal cerebral ischemia in rodents: Introduction and overview.</a> Rodent models of stroke. , (2010).</li><li>Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+reevaluation+of+the+intraluminal+thread+model+of+focal+cerebral+ischemia:+evidence+of+inadvertent+premature+reperfusion+and+subarachnoid+hemorrhage+in+rats+by+laser-Doppler+flowmetry.">A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry.</a> Stroke. 29, 2162-2170 (1998).</li><li>Riva, M., Pappad&#224;, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+monitoring+of+intracranial+collateral+flow+predicts+tissue+and+functional+outcome+in+experimental+ischemic+stroke.">Hemodynamic monitoring of intracranial collateral flow predicts tissue and functional outcome in experimental ischemic stroke.</a> Exp. Neurol. 233, 815-820 (2012).</li><li>Menon, B. K., Smith, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+leptomeningeal+score+on+CT+angiography+predicts+clinical+and+imaging+outcomes+in+patients+with+acute+anterior+circulation+occlusions.">Regional leptomeningeal score on CT angiography predicts clinical and imaging outcomes in patients with acute anterior circulation occlusions.</a> Am. J. Neuroradiol. 32, 1640-1645 (2011).</li><li>Bang, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+flow+predicts+response+to+endovascular+therapy+for+acute+ischemic+stroke.">Collateral flow predicts response to endovascular therapy for acute ischemic stroke.</a> Stroke. 42, 693-699 (2011).</li><li>Shuaib, A., Butcher, K., Mohammad, A. A., Saqqur, M., Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+blood+vessels+in+acute+ischaemic+stroke:+a+potential+therapeutic+target.">Collateral blood vessels in acute ischaemic stroke: a potential therapeutic target.</a> Lancet Neurol. 10, 909-921 (2011).</li><li>Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+Stroke+Model+Guidelines+for+preclinical+stroke+trials+(1st+edition).">Rodent Stroke Model Guidelines for preclinical stroke trials (1st edition).</a> J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).</li><li>Shepherd, A. P., &#214;berg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser-Doppler Blood Flowmetry. , (1990).</li><li>Ulu&#231;, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akt&#252;re, E., Ba&#351;kaya, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+Cerebral+Ischemia+Model+by+Endovascular+Suture+Occlusion+of+the+Middle+Cerebral+Artery+in+the+Rat.">Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat.</a> J. Vis. Exp. (48), e1978 (2011).</li><li>Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurological+deficit+and+extent+of+neuronal+necrosis+attributable+to+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats.+Statistical+validation.">Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Statistical validation.</a> Stroke. 26, 627-634 (1995).</li></ol>

El financiamiento para la producción de este video-artículo fue proporcionado por Moor Instruments Ltd (Axminster, Devon, Reino Unido), que produce los instrumentos de láser Doppler muestra en nuestro estudio experimental. El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Milano Bicocca, de acuerdo con las directrices nacionales sobre el uso de animales de laboratorio (DL 116/1992) y la Directiva de la Unión Europea para los experimentos con animales (2010/63/UE ), bajo licencia de proyecto (n. 219/2011-B) del Ministerio de Sanidad italiano.

Hemos desarrollado internamente un sistema simple y de bajo costo para una fijación segura de una o varias sondas de doble fibra LD (penetración profunda) en el cráneo intacto de ratas durante el procedimiento MCAO. Aunque al parecer un problema trivial, la obtención de una fijación fiable de la sonda de LD al cráneo es realmente un problema importante en esta configuración experimental, ya que es el requisito previo para una detección de señal suave y un control exitoso de la perfusión cerebral. Los procedimientos invasivos, tales como trepanaciones y tornillos para huesos, por lo general prolongar el tiempo quirúrgico e introducir más variables experimentales relacionados con la craneotomía, y esto puede desalentar a los investigadores y los que se abstengan de utilizar el seguimiento LD. Por otro lado, el uso de una sola fibra (baja penetración) sondas, que son más delgados y más fácil relativamente a ser pegado directamente a la superficie del cráneo, da de baja calidad de la señal y no puede utilizarse de forma fiable con ratas adultas sin la perforación o adelgazamiento del cráneo. Se utilizaron materiales simples y de bajo costo, tales como caucho natural, tubos de plástico y un estilete de metal. Un soporte de sonda de medida se puede producir en unos pocos minutos y adaptado a las condiciones experimentales. Estos titulares de la sonda puede alojar uno o más de profundidad de penetración sondas LD, para el control clásico único sitio en el núcleo isquémico o para múltiples sitios de monitoreo en diferentes territorios arteriales en el mismo hemisferio o en los dos hemisferios. Muchos titulares de la sonda podría ser producido, esterilizar químicamente, y se almacena para uso futuro. Veterinario aprobado por pegamento quirúrgico (cianoacrilato), acelerado por aire frío, se utiliza para unir el soporte de la sonda a la superficie intacta de la calavera de rata, de acuerdo con las coordenadas deseadas craneales. Finalmente, la sonda puesta a punto se ve asegurada en su lugar por medio de suturas comunes. El tiempo total de esta sonda LD puesta en marcha, después de dominar esta técnica, es de aproximadamente 10 min. Como he mostradon este vídeo, de manera rutinaria controlar la perfusión cerebral en el territorio central MCA (LD sonda 1: núcleo isquémico) y en el periférico territorio MCA (LD sonda 2: principalmente una zona de penumbra). En nuestro estudio reciente mostró que la variabilidad de los cambios de flujo sanguíneo en LD sonda 2 (media 52% ± 16% SD, en comparación con la línea de base) es mayor en comparación con LD sonda 1 (media 31% ± 6% SD, en comparación con la línea de base) y puede ser usado para predecir 4 pronóstico del accidente cerebrovascular. Podemos proporcionar algunos consejos de solución de problemas para los investigadores que deseen utilizar nuestro propio sistema desarrollado. Al comienzo del experimento, tener cuidado para secar muy bien la superficie del cráneo (con Merbromina y el aire frío) antes de fijar el soporte de la sonda para evitar el desprendimiento prematuro. Además, asegúrese de aplicar la cola sobre el caucho natural, evitando el contacto con el extremo abierto del tubo de plástico y la superficie óptica de la sonda de LD, para evitar que la señal pobre y el daño potencial a la sonda. Al atar la sutura alrededor de la cabeza del animal, tenga cuidado para evitar la obstrucción de las vías respiratorias (esto se evita mediante la colocación de la sutura en el hueso mandibular). Después de colocar y asegurar las sondas, tenga cuidado de no cables de las sondas de tracción al girar el animal en decúbito supino para la cirugía cervical, este paso suele requerir dos personas, una persona que tiene el animal y una segunda persona que sostiene los cables de las sondas y suavemente colocando a la posición deseada. Finalmente, eventual contaminación de la sangre de la sonda de doble fibra de LD se maneja fácilmente siguiendo las instrucciones de limpieza proporcionadas por el fabricante. Nuestro sistema optimizado para la monitorización de la perfusión cerebral, como se muestra en este video, podría ser una alternativa más fácil, más rápido y más fiable a la sonda puesta a punto de sistemas que se venden actualmente por empresas comerciales en este campo. Además, creemos que el uso de este sistema por otros investigadores pueden mejorar el espárragoy de la hemodinámica cerebral en el accidente cerebrovascular experimental campo, que conducen al desarrollo de una nueva generación de agentes terapéuticos colaterales cerebrales.

Investigación traslacional sobre los factores hemodinámicos que afectan a la fisiopatología y el tratamiento trazo debe aplicarse, ya que esta cuestión importante es a menudo descuidado paradójicamente por estudios de investigación básica 1. Monitorización de la perfusión cerebral es una herramienta esencial, pero infrautilizado, para modelar con precisión el accidente cerebrovascular isquémico 2. Aparte de la confirmación de la oclusión del vaso arterial y la exclusión de la hemorragia subaracnoidea 3, la supervisión continua de perfusión cerebral puede proporcionar datos útiles sobre el grado y la consistencia de déficit de perfusión, el estado funcional de los vasos colaterales intracraneales y el efecto hemodinámico de nuevos enfoques terapéuticos. Un estudio reciente de nuestro grupo indican que el control hemodinámico multi-sitio puede ser utilizada para evaluar la circulación colateral intracraneal y puede predecir el tamaño del infarto y déficit funcional 4. Estos resultados experimentales son consistent con estudios clínicos que demostraron que el rendimiento funcional de la circulación colateral cerebral es predictivo de la evolución clínica en pacientes con ictus isquémico 5, 6. Por esta razón, los colaterales cerebrales se han recomendado como una potencial diana terapéutica en la fase aguda del accidente cerebrovascular isquémico 7. Laser-Doppler (LD) Los instrumentos son la herramienta más utilizada para medir la perfusión cerebral en el ictus isquémico experimental y su uso está recomendado por las guías recientes sobre el tema 8. LD instrumentos miden la perfusión microvascular en un pequeño volumen cortical, la profundidad de la señal grabada ser dependiente de la anchura de separación de las fibras, con dos sondas de fibra LD permitiendo una penetración más profunda en comparación con las sondas de fibra única LD 9. Los valores de flujo de sangre se expresan como unidades arbitrarias de perfusión (PU) que indican relativa en lugar de absoluta flujo sanguíneo cerebral. Calibración de PU se realiza generalmente usinnormas g motilidad, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. LD flujometría permite un monitoreo continuo dinámico y la generación de datos cuantitativos dentro de la misma sesión. Entre los problemas técnicos que actualmente limitan el uso de LD, una cuestión importante es la obtención de un apego seguro y prolongado de una profunda penetración de la sonda láser Doppler en el cráneo animal. Esto es esencial para el control prolongado y si se utilizan varias sondas para diferentes territorios arteriales cerebrales, ya que estamos llevando a cabo en nuestro laboratorio. En particular, el tiempo quirúrgico prolongado es necesaria si las sondas están unidas al cráneo utilizando orificios de trepanación o tornillos craneales, mientras que la señal pobre y la unión no segura se produce si sola fibra (baja penetración) LD sondas están unidas al cráneo mediante cola quirúrgica simple. Gemelas de fibra (de penetración profunda) sondas LD proporcionar una señal mayor y más consistente, pero son más grandes que las sondas de fibra individuales, no puede ser entached en el cráneo con pegamento quirúrgico solamente. En este video, mostramos nuestro sistema optimizado para la monitorización de la perfusión cerebral durante la oclusión transitoria de la arteria cerebral media por filamento intraluminal en la rata. Se describe un método simple para obtener una eficiente, personalizado titular hecho, de bajo costo para un solo o múltiples de doble fibra (profundidad de penetración) sondas de LD, que se utilizará para el seguimiento prolongado de la perfusión cerebral durante el cráneo intacto. El procedimiento quirúrgico para MCAO transitoria en la rata podría ser visto en el video-artículo de Uluc y compañeros de trabajo 10 y no se muestra en este vídeo.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipo </td></tr><tr><td> MoorVMS LDF-2-canales Laser Doppler monitor </td><td> Moor Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> VP12 sonda </td><td> Moor Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reactivo / Material </td></tr><tr><td> Doccol silicio recubierto con filamentos de tamaño de 4-0, diámetro con recubrimiento 0,39 mM </td><td> Doccol Corporación </td><td> 403956PK10 </td><td></td></tr><tr><td> El caucho natural, por ejemplo, chupetes común para los recién nacidos </td><td></td><td></td><td> Múltipleproveedores </td></tr><tr><td> Estilete de metal, por ejemplo de la aguja espinal 18 x 90 mm ​​GA </td><td></td><td></td><td> Múltiples proveedores </td></tr><tr><td> Tubos de plástico, por ejemplo de la vena establecido para perfusión 25 x 20 mm GA </td><td></td><td></td><td> Múltiples proveedores </td></tr><tr><td> Sutura no absorbible de seda recubierto, trenzado </td><td></td><td></td><td> Múltiples proveedores </td></tr><tr><td> Pegamento de cianoacrilato quirúrgico </td><td></td><td></td><td> Múltiples proveedores </td></tr><tr><td> Isoflurano (100% v / v) para uso veterinario </td><td></td><td></td><td> Múltiples proveedores </td></tr></tbody></table>

optimized system for cerebral perfusion monitoring in the rat stroke model of intraluminal middle cerebral artery occlusion

El potencial de traslación de la investigación preclínica carrera depende de la precisión de los modelos experimentales. Monitorización de la perfusión cerebral en modelos animales de accidente cerebrovascular isquémico agudo permite confirmar la oclusión arterial éxito y no incluyen hemorragia subaracnoidea. Monitorización de la perfusión cerebral también puede ser usado para estudiar la circulación colateral intracraneal, que está surgiendo como un poderoso factor de pronóstico del accidente cerebrovascular y un posible objetivo terapéutico. A pesar de un reconocido papel de supervisión Laser Doppler perfusión en el marco de las directrices actuales para la isquemia cerebral experimental, una serie de dificultades técnicas existentes que limitan su uso generalizado. Uno de los principales problemas es la obtención de una fijación segura y prolongada de una profunda penetración de la sonda de láser Doppler en el cráneo animal. En este video, mostramos nuestro sistema optimizado para la monitorización de la perfusión cerebral durante la oclusión transitoria de la arteria cerebral media por filamento intraluminal en la rata. Hemos desarrollado in-casa de un método simple para obtener un soporte hecho a medida para doble fibra (profundidad de penetración) láser sondas Doppler, que permiten multi-sitio de monitoreo si es necesario. Una vigilancia continua y prolongada de la perfusión cerebral puede ser fácilmente obtenido en el cráneo intacto.

Transitoria MCAO (60 min) fue inducida mediante la inserción de un filamento recubierto de silicona en la arteria carótida externa. El filamento se empuja entonces a través del extremo terminal de la arteria carótida interna hasta el origen de la MCA, con monitorización LD. Arteria carótida común y la arteria ocluida fueron pterygopalatin transitoriamente durante la inserción quirúrgica del filamento. Una representación esquemática del procedimiento quirúrgico se muestra en la Figura 1A. Las coordenadas craneal para posicionar las dos sondas LD fueron elegidos en función del territorio arterial subyacente. Los experimentos preliminares con gelatina-tinta de perfusión (Figura 1B) mostró que el núcleo isquémico se espera en el territorio central MCA (bregma -1 mm, 5 mm de la línea media; Sonda 1), mientras que el flujo colateral que se espera en el territorio borderzone entre la ramas corticales de las arterias cerebrales medias y anterior (bregma +2 mm, 2 mm desde la línea media; Probe 2). Hemodinámica cerebral se estudió usando multi-sitio de sondas Doppler láser durante todo el período del procedimiento quirúrgico, es decir, antes, durante y después de MCAO (Figura 2). El déficit de perfusión cerebral durante la MCAO era más pequeña y mostró un alto grado de variabilidad en la sonda 2 en comparación con la sonda 1, lo que sugiere diferencias interindividuales en el rendimiento funcional de colaterales intracraneales durante la isquemia. El sitio multi-láser Doppler de seguimiento también permite estudiar las alteraciones hemodinámicas cerebrales durante la oclusión proximal de extra-craneales arterias cerebrales (arteria carótida común, la arteria carótida interna, arteria pterygopalatin). Pronóstico del accidente cerebrovascular se evaluó 24 horas después de la reperfusión por el volumen del infarto, calculado en 19 secciones consecutivas teñidas con violeta de cresilo (Figura 3), y García funcional neuroscore 11. La inmunohistoquímica para marcadores específicos asociados con la lesión cerebral isquémica se realizó, con el fin de obtener una distribución topográfica de la pérdida neuronal (proteína asociada a microtúbulos 2, MAP2) y penumbra isquémica (proteína de choque térmico-70, Hsp70) en relación con el control hemodinámico multi-sitio de la circulación intracraneal (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/50214/50214fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50214/50214fig1highres.jpg"/> Figura 1. Monitorización de la perfusión cerebral durante la MCAO intraluminal en la rata. A. Representación esquemática del procedimiento quirúrgico para MCAO transitoria. Un filamento revestido de silicona se usó para ocluir el origen de la MCA, después de ser introducido en la arteria carótida externa y se empujó a través de la arteria carótida interna. Proximal arterias cervicales se ligaron bien (arteria carótida externa) o transitoriamente ocluida (arteria pterygopalatin y la arteria carótida común) durante el procedimientomiento. B. Un cerebro representativo se muestra después de gelatina de tinta manche. Perfusión transcardiaca de gelatina tinta solución se realizaron 60 min después de la aparición de la isquemia, sin reperfusión. El cerebro normalmente perfundidos se tiñó por gelatina tinta y apareció como de color gris con negro vasos teñidos, mientras que el área isquémica (no perfundido) permanecieron sin teñir (color rosa). Craneales coordenadas para posicionar las dos sondas de LD se muestran. Sonda 1 = -1 mm desde el bregma, 5 mm de la línea media; Probe 2 = 2 mm desde el bregma, 2 mm de la línea media. <img src="/files/ftp_upload/50214/50214fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50214/50214fig2highres.jpg"/> Figura 2. Hemodinámicas cerebrales utilizando grabaciones multi-sitio de sondas de láser Doppler. Un patrón hemodinámico típico que sugiere colaterales intracraneales funcionalmente activos bajo condiciones de isquemia se muestra. En este animal, los trazados de LD mostró una pequeñaer déficit de perfusión en la sonda de 2 canales, en comparación con la sonda 1 canal, tanto durante la CCA oclusión y oclusión MCA. MCA-O = oclusión de arteria cerebral media. CCA-O = oclusión arteria carótida común. Unidad = unidades de la perfusión. <img src="/files/ftp_upload/50214/50214fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50214/50214fig3highres.jpg"/> Figura 3. Representante secciones cerebrales para el cálculo del volumen de infarto histológicos secciones coronales (50 micras; n = 19 con intervalo de 250 micras; bregma 2,5 mm a -3,0 mm). Se fijan en paraformaldehído al 4% y se tiñeron con violeta de cresilo 0,1%. Volumen del infarto se calcula utilizando ImageJ software de procesamiento de imagen, corregido para inter-hemisféricos asimetrías debido a un edema cerebral, y se expresa en mm 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50214/50214fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> <img src = &quot;/ files/ftp_upload/50214/50214fig4.jpg&quot; alt = &quot;Figura 4&quot; fo: content-width = &quot;6in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50214/50214fig4highres.jpg&quot; /&gt; Figura 4. La inmunotinción de los marcadores moleculares de la pérdida neuronal y la penumbra representativos secciones del cerebro se muestran consecutivos, que se tiñeron con violeta de cresilo 0,1% (A) o inmunotiñeron con los marcadores de la pérdida neuronal (proteína asociada a microtúbulos 2, MAP2, B). Y penumbra isquémica (calor proteína de choque-70, Hsp70, C).

Watch this Scientific Journal Video about Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion at JoVE.com

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

Monitorización de la perfusión cerebral se ha demostrado para mejorar la precisión en modelos de ictus isquémicos. Las dificultades técnicas a menudo limitan el uso de esta herramienta esencial para la investigación cerebrovascular. En este vídeo, un sistema optimizado se muestra para obtener una monitorización hemodinámica única o multi-sitio durante la oclusión intraluminal de la arteria cerebral en ratas.

Sistema optimizado para la monitorización de la perfusión cerebral en el modelo de rata de Carrera intraluminal oclusión arteria cerebral media

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

optimized-system-for-cerebral-perfusion-monitoring-rat-stroke-model

Research

JoVE Journal

Medicine

23.0K vistas.  University of Milano Bicocca. Monitorización de la perfusión cerebral se ha demostrado para mejorar la precisión en modelos de ictus isquémicos. Las dificultades técnicas a menudo limitan el uso de esta herramienta esencial para la investigación cerebrovascular. En este vídeo, un sistema optimizado se muestra para obtener una monitorización hemodinámica única o multi-sitio durante la oclusión intraluminal de la arteria cerebral en ratas.

Video: Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

Modelado de accidente cerebrovascular en ratones - Oclusión arteria cerebral media con el modelo de filamento

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Investigación

Medicina

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Modelo de ratón de la oclusión arteria cerebral media

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United States in 20091,2. The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was developed by Koizumi4 in 1986 to simulate this 
impactful human pathology in the rat. A modification of the MCAO method was later presented by Longa3. Both techniques have been widely used to identify 
molecular mechanisms of brain injury resulting from ischemic stroke and potential therapeutic modalities5. This relatively noninvasive method in rats has been 
extended to use in mice to take advantage of transgenic and knockout strains6,7. To model focal cerebral ischemia, an intraluminal suture is advanced via 
the internal carotid artery to occlude the base of the MCA. Retracting the suture after a specified period of time mimics spontaneous reperfusion, but the 
suture can also be permanently retained. This video will be demonstrating the two major approaches for performing intraluminal MCAO procedure in mice in a 
stepwise fashion, as well as providing insights for potential drawbacks and pitfalls. The ischemic brain tissue will subsequently be stained by 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to evaluate the extent of cerebral infarction8.

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is the most frequent used model among experimental ischemic stroke models. Here we will demonstrate the entire model in detail with the guide of Laser Doppler flowmetry, and its representative results.

Intraluminal la arteria cerebral media de oclusión (MCAO) Modelo para el ictus isquémico con Orientación flujometría láser Doppler en ratones

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

La aplicación de la Permanente Ligadura arteria cerebral media en el ratón

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Bilateral Común oclusión de la arteria carótida como un estímulo de preacondicionamiento adecuado para inducir la tolerancia isquémica precoz de isquemia cerebral focal

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in 20091, 2. Several models of cerebral ischemia have been developed to mimic the human condition of stroke. It has been suggested that up to 80% of all strokes result from ischemic damage in the middle cerebral artery (MCA) area3. In the early 1990s, endothelin-1 (ET-1) 4 was used to induce ischemia by applying it directly adjacent to the surface of the MCA after craniotomy. Later, this model was modified 5 by using a stereotaxic injection of ET-1 adjacent to the MCA to produce focal cerebral ischemia. The main advantages of this model include the ability to perform the procedure quickly, the ability to control artery constriction by altering the dose of ET-1 delivered, no need to manipulate the extracranial vessels supplying blood to the brain as well as gradual reperfusion rates that more closely mimics the reperfusion in humans5-7. On the other hand, the ET-1 model has disadvantages that include the need for a craniotomy, as well as higher variability in stroke volume8. This variability can be reduced with the use of laser Doppler flowmetry (LDF) to verify cerebral ischemia during ET-1 infusion. Factors that affect stroke variability include precision of infusion and the batch of the ET-1 used6. Another important consideration is that although reperfusion is a common occurrence in human stroke, the duration of occlusion for ET-1 induced MCAO may not closely mimic that of human stroke where many patients have partial reperfusion over a period of hours to days following occlusion9, 10. This protocol will describe in detail the ET-1 induced MCAO model for ischemic stroke in rats. It will also draw attention to special considerations and potential drawbacks throughout the procedure.

Several animal models of cerebral ischemia have been developed to simulate the human condition of stroke. This protocol describes the endothelin-1 (ET-1) induced middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke in rats. In addition, important considerations, advantages, and shortcomings of this model are discussed.

La endotelina-1 inducida por la arteria cerebral media oclusión Modelo para el ictus isquémico con Orientación flujometría láser Doppler en la rata

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be performed in many locations overlying the rat cerebrum, but is most easily carried out by creating a craniectomy over the readily accessible frontal or parietal bones. Most frequently, we have used this technique in combination with the endothelin-1 middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke to quantify the changes in middle cerebral artery vessel diameter that occur with injection of endothelin-1 into the brain parenchyma adjacent to the proximal MCA4, 5. In order to visualize the proximal portion of the MCA during endothelin -1 induced MCAO, we use a technique to create a cranial window through the temporal bone on the lateral aspect of the rat skull (Figure 1). Cerebral arteries can be visualized either with the dura intact or with the dura incised and retracted. Most commonly, we leave the dura intact during visualization since endothelin-1 induced MCAO involves delivery of the vasoconstricting peptide into the brain parenchyma. This bypasses the need to incise the dura directly over the visualized vessels for drug delivery. This protocol will describe how to create a cranial window to visualize cerebral arteries in a step-wise fashion, as well as how to avoid many of the potential pitfalls pertaining to this method.

This article describes a method for visualizing rat cerebral arteries through a cranial window using temporal craniectomy in order to view proximal portions of the middle cerebral artery (Figure 1). This versatile method can be combined with various techniques of drug delivery to measure cerebral artery reactivity in vivo.

Utilizando una ventana craneal para visualizar la arteria cerebral media Durante la endotelina-1 inducida por oclusión de la arteria cerebral media

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Carrera Modelado en ratones: Coagulación permanente de la arteria cerebral media Distal

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic stroke. However, the use of tPA is limited by its narrow therapeutic window and by increased risk of hemorrhagic transformation. There is an urgent need to develop suitable stroke models to study new thrombolytic agents and strategies for treatment of ischemic stroke. At present, two major types of ischemic stroke models have been developed in rats and mice: intraluminal suture MCAO and embolic MCAO. Although MCAO models via the intraluminal suture technique have been widely used in mechanism-driven stroke research, these suture models do not mimic the clinical situation and are not suitable for thrombolytic studies. Among these models, the embolic MCAO model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical investigation of thrombolytic therapy. This embolic model was first developed in rats by Overgaard et al.1 in 1992 and further characterized by Zhang et al. in 19972. Although embolic MCAO has gained increasing attention, there are technical problems faced by many laboratories. To meet increasing needs for thrombolytic research, we present a highly reproducible model of embolic MCAO in the rat, which can develop a predictable infarct volume within the MCA territory. In brief, a modified PE-50 tube is gently advanced from the external carotid artery (ECA) into the lumen of the internal carotid artery (ICA) until the tip of the catheter reaches the origin of the MCA. Through the catheter, a single homologous blood clot is placed at the origin of the MCA. To identify the success of MCA occlusion, regional cerebral blood flow was monitored, neurological deficits and infarct volumes were measured. The techniques presented in this paper should help investigators to overcome technical problems for establishing this model for stroke research.

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

Arteria embólico cerebral media oclusión (MCAO) para el ictus isquémico con homólogas coágulos de sangre en las ratas

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Surgical Approach for Middle Cerebral Artery Occlusion and Reperfusion Induced Stroke in Mice

Stroke is a leading cause of death worldwide and continues to be one of the major causes of long-term adult disabilities. About 87% of strokes are ischemic in origin and occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA). Currently the only Food and Drug Administration (FDA) approved drug for the treatment of this devastating disease is tissue plasminogen activator (tPA). However, tPA has a small therapeutic window for administration (3 - 6 hr), and is only effective in 4% of the patients who actually receive it. Current research focuses on understanding the pathophysiology of stroke in order to find potential therapeutic targets. Thus, reliable models are crucial, and the MCA occlusion (MCAo) model (also termed the intraluminal filament or suture model) is deemed to be the most clinically relevant surgical model of ischemic stroke, and is fairly non-invasive and easily reproducible. Typically the MCAo model is used with rodents, especially with mice due to all the genetic variations available for this species. Here we describe (and present in the video) how to successfully perform the MCAo model (with reperfusion) in mice to generate reliable and reproducible data.

In order to understand the pathophysiology of stroke, it is important to use reliable models. This paper will describe one of the most frequently used stroke models in mice, termed the middle cerebral artery occlusion (MCAo) model (also termed the intraluminal filament or suture model) with reperfusion.