El Citrus Research y Development Foundation es reconocido por proveer financiamiento. Gracias a Angel Hoyte y Michael Flores para la realización de bioensayos.

<ol><li> Montaje de un diseño personalizado, de dos puertos dividido T-olfatómetro se ha descrito previamente en Mann et al. 10 se muestra en la figura 1. El olfatómetro consiste en un tubo de vidrio de 30 cm que se bifurca en dos puertos separados con una tira de teflón formando un laberinto en T. Cada mitad es análogo a un brazo de un olfatómetro estilo 2-opción que permite al sujeto de prueba para elegir entre dos campos de olores potenciales. <ol><li> Los ensayos de montaje y posterior debe tener lugar dentro de una habitación con temperatura controlada o cámara ambiental. </li><li> Mount vidrio laberinto en T olfatómetro verticalmente como se muestra en la Figura 1 y colocarlo debajo de una bombilla de luz fluorescente 900 lux. </li><li> Para la difusión óptima de la luz, la asamblea debe ser montado en un 1,0 x 0,6 x 0,6 m recipiente opaco para maximizar la difusión uniforme de la luz. </li><li> Conectar los brazos olfatómetro a fuentes de olor que se alojarán en fase sólida micro-extracción fuente chamb explotación / olorer (SPMEC) (ARS, Inc., Gainesville, FL) a través de teflón, conectores de tubo de vidrio. Cada SPMEC se compone de un tubo de vidrio recto (17,5 cm de largo x 3,5 cm de ancho) apoyado con una entrada y una válvula de salida para las corrientes de aire entrante y saliente (Figura 1). </li><li> Conectar el sistema de suministro de aire a una fuente externa de aire humidificado y purificado de carbono-que está bajo presión constante (el sistema de suministro de aire tiene tanto un filtro de carbono interno para la purificación de aire y un burbujeador de aire para la humidificación de fuentes externas si están disponibles). </li><li> Disolver muestras químicas deseadas dentro de diluyente apropiado (disolvente) y pipeta sobre un sustrato de liberación lenta tal como una mecha de algodón (John Petty Packaging, Inc., Concord, NC). El tratamiento de control debe constar de una mecha de algodón impregnado con disolvente solo. </li><li> Para evitar la contaminación significativa de la cristalería, envuelven las mechas de algodón tratados y de control en el tejido de laboratorio (Kimwipes, Kimberly-Clark, Roswell, GA) y ponerlo en los dos brazos SPMEC (ARS, Inc., Gainesville, FL). En el caso de muestras de plantas vivas, una cámara de recogida de guillotina volátil puede estar unido a la olfatómetro contiene tratamientos en lugar de la SPMEC (Figura 1). </li><li> Entregar purificado y aire humidificado a través de la SPMEC (o cámara de guillotina volátil) a través de dos bombas conectadas a un sistema de suministro de aire (Figura 1). Mantener la tasa de flujo de aire a 0,1 L / min a través de ambos brazos del olfatómetro. </li></ol></li><li> Empleando olfatómetro para probar la respuesta a los repelentes de artrópodos putativo. En la presente descripción, un insecto hemíptero, psílido asiático de los cítricos, Diaphorina citri, se utilizó como un artrópodo prueba. Respuesta fue probado a volátiles de cítricos solos o en combinación con un (disulfuro de dimetilo) y repelente de aire limpio como fuentes de olor. <ol><li> Llevar a cabo todos los experimentos a una temperatura normalizada y la humedad relativa. </li><li> Antes de todas las pruebas, exponer test temas para limpiar el aire acondicionado o aire limpio en comparación con solvente limpio en comparación con el olfatómetro T-laberinto para verificar la ausencia de sesgo posicional o un efecto del solvente sobre la conducta del sujeto de prueba. </li><li> Asignar una fuente de olor al azar a uno de los brazos del olfatómetro al comienzo de cada bioensayo. Invertir esta posición después de cada 10 sujetos de prueba ensayadas, como mínimo, para eliminar el potencial de sesgo posicional. </li><li> Pon a prueba la respuesta de un mínimo de 30 (y hasta 120) sujetos de prueba por combinación del tratamiento. </li><li> Permita que los sujetos de prueba 100-300 sec para exhibir una respuesta de comportamiento basado en la respuesta previamente establecida (latencia) intervalo. </li><li> Record si el sujeto entra en el brazo de tratamiento, o brazo de control permanece en el puerto de liberación o por debajo de la división T-laberinto. </li><li> Puntuación elegir brazo de tratamiento o de control cuando un sujeto de prueba cruza la división en el laberinto en T y se mueve en cualquiera de los brazos olfatómetro. </li><li> Marca un brazo de liberación elección cuando una prueba sSujeto permanece en el puerto de liberación o por debajo de la división T-laberinto. </li><li> Limpiar el olfatómetro y tubos de conexión a fondo con solución de jabón 2% y hornear los componentes de vidrio a 200 ° F entre el uso de tratamientos de olor diferentes. </li><li> Para los ensayos en los que putativo tratamientos repelentes se presentan en el olfatómetro laberinto en T con o sin un tratamiento químico en comparación con el aire limpio, comparar el número de sujetos de prueba restantes en el punto de descarga, y no entrar en el olfatómetro entre los tratamientos por una forma de análisis de varianza ( ANOVA) seguido por el test HSD de Tukey (α &lt;0,05). En los casos en los que los sujetos de prueba dejan el brazo de liberación, comparar el número de la elección del brazo de control versus el grupo de tratamiento con Chi cuadrado (χ 2) análisis en α &lt;0,05. </li></ol></li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+foreign+oviposition+marking+pheromone+in+a+multitrophic+context.">Recognition of foreign oviposition marking pheromone in a multitrophic context.</a> Naturwissenschaften. 96 (5), 585-592 (2009).</li><li>G&#246;k&#231;e, A., Stelinski, L. L., Whalon, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+electrophysiological+responses+of+leafroller+moths+to+selected+plant+extracts.">Behavioral and electrophysiological responses of leafroller moths to selected plant extracts.</a> Environmental Entomology. 34 (6), 1426-1432 (2005).</li><li>Ali, J. G., Alborn, H. 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El autor recibió financiamiento que fue proporcionado por la Fundación de Investigación de Cítricos y Desarrollo.

En la presente memoria, un dispositivo de ensayo y el protocolo se ha descrito para la medición de la respuesta de los artrópodos pequeños (Insecta: Hemiptera: Psyllidae) a odorantes. El método implica una prueba de elección, permitiendo que el insecto que hacer una elección entre dos campos odorantes en el caso de los ensayos de evaluación de un atrayente putativo. Por otra parte, el sujeto de prueba puede mostrar tres tipos de comportamientos dejando el brazo de liberación y entrar uno de los dos campos potenciales de olor, o que permanece en el brazo de liberación, en el caso de los ensayos de repelencia. El olfatómetro permite un alto rendimiento de recolección de datos, ya que se aprovecha de la geotáctico negativo (tendencia a moverse hacia arriba) y fototácticas positivo (tendencia a moverse hacia la luz) respuesta de comportamiento natural de muchos artrópodos. Aunque la manifestación presente ejemplo utiliza un insecto de prueba psílido, el ensayo puede ser fácilmente adaptado a los artrópodos en general, tanto los que utilizan vuelo o caminar como modos predominantes de transporte. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; olfatómetros diseñados para medir la respuesta de los insectos fueron inicialmente desarrollados hace décadas y han desempeñado un papel importante en la aclaración de los atrayentes y repelentes de insectos 12. Los diseños específicos de olfatómetros pueden variar ampliamente, sin embargo, variaciones sobre el tema general de el ensayo de dos elección descrito aquí, así como, de tubos similar Y-ensayos se han utilizado a menudo para medir la respuesta de artrópodos a los productos químicos. Túneles más grandes de vuelo que pueden causar vuelo sostenido de insectos 9 también han dado lugar a la recopilación de datos innovadores elucidar los mecanismos fundamentales de vuelo de los insectos y la orientación de semioquímicos, así como, datos informando uso práctico de las herramientas de control de plagas. A menudo es necesario adaptar el diseño a un olfatómetro e instrumentación asociada para la biología del sujeto de la prueba específica de artrópodos. Esos olfatómetros que se pueden utilizar entre un grupo general de los insectos son más útiles que los specific a un pequeño grupo, sin embargo, a veces la importancia económica de un reducido grupo de insectos que dicta la necesidad del desarrollo de un olfatómetro muy específica y técnica de ensayo. El diseño describe actualmente se basa en técnicas de artrópodos anteriormente conocidas. Además, permite una mayor elección estándar de dos tubos de ensayo de bioensayos Y-en el que el recinto experimental o prueba de elección toma la forma de un dispositivo de cristal en forma de Y 7. Típicamente, un brazo de un tubo en Y recibirá un odorante tratamiento, mientras que el otro será dejado en blanco 13. Variaciones sobre olfatómetros tales pueden incluir la adición de múltiples brazos radiales 14 e incluso la adición de un medio de suelo para someter a ensayo el comportamiento de los organismos que se desplazan a través del suelo 15. En el desarrollo de tales olfatómetros y ensayos asociados, es importante considerar cómo de cerca las condiciones naturales se replican y por lo tanto la verdadera relevancia de las respuestas conductuales evaluados en términos de biología los sujetos de prueba. A una la-rge grado, los datos recogidos sólo serán tan útiles como la relevancia del bioensayo de comportamiento con respecto a la ecología del comportamiento del organismo 16. El olfatómetro actualmente descrito y bioensayo de comportamiento está diseñado específicamente para un insecto hemíptero que tiende a iniciar el vuelo como cortas &quot;saltos&quot; 16. La orientación vertical de la olfatómetro y la disposición de fuente de luz facilitar el inicio de movimiento de los insectos y por tanto, posterior químicamente mediada comportamiento de orientación se pueden ensayar de manera eficiente y con un alto rendimiento. Esta disposición ensayo de conducta probablemente se puede utilizar para una amplia gama de volar o caminar taxones de artrópodos o podría ser también fácilmente modificados para adaptarse a la necesidad de no artrópodos organismos.

Los artrópodos (incluidos los insectos y arácnidos) se define a menudo como plagas, ya sea porque compiten con el consumo humano en entornos agrícolas o urbanos o transmitir agentes patógenos causales de la enfermedad 1. Una gran cantidad de inversión se realiza en el desarrollo de herramientas de control de plagas. Estas herramientas pueden variar ampliamente y se han logrado importantes avances en el desarrollo biorracionales herramientas que, o bien modificar o explotar el comportamiento natural de las plagas con el uso de atrayentes o repelentes de comportamiento 2,3. Plagas de artrópodos suelen basarse en las señales olfativas o señales de pareja y / o host ubicación 4. Por lo tanto, el descubrimiento de atrayentes o repelentes eficaces para las plagas a menudo puede conducir al desarrollo de herramientas de control. Este proceso de descubrimiento implica varios pasos. En primer lugar, el comportamiento natural del sujeto de prueba debe ser entendido. Por ejemplo, uno debe determinar si un sexo de una especie dada atrae el opuestosexo por ubicación mate. Si es así, se debe determinar si esta atracción está mediada por un producto químico y donde química que se produce. Otros pasos incluyen la determinación de si la sustancia química que se produce y su eventual identificación. A lo largo de este procedimiento, el sujeto de prueba (de insectos o ácaros) respuesta de comportamiento a los olores debe ser probado. Inicialmente, el comportamiento del sujeto de ensayo se probará para el material natural. Por ejemplo, la respuesta de una polilla macho puede ser analizada para que la del extracto de su misma especie hembra de la glándula de feromonas. Por otra parte, la respuesta de un herbívoro a los olores naturales de su planta hospedante puede ser probado. Mientras que estas investigaciones tienen un enfoque práctico en el desarrollo de herramientas de gestión de 5,6, también se puede aplicar a la investigación que se ocupa de cuestiones más fundamentales, tales como la especiación 7. Los pasos siguientes implican probar la respuesta del artrópodo para determinadas versiones sintéticas de productos naturales. Untender artrópodos cómo responder a los productos químicos requiere el desarrollo de herramientas adecuadas para medir su comportamiento. Los datos generados por estos instrumentos dependerá de lo bien que el investigador es capaz de medir los comportamientos naturales en un entorno controlado. Más de seis décadas, olfatómetros sostenidos de vuelo y túneles fueron desarrollados para medir la respuesta de los insectos a los olores 8,9. Olfatómetros variar significativamente en diseño y están sujetos a los insectos o problema específico se está investigando. El objetivo de este artículo es describir el diseño y el uso de una orientación vertical, T-laberinto olfatómetro para medir la respuesta de los insectos a los olores (Figura 1). La orientación vertical olfatómetro se aprovecha de la geotaxis negativo (tendencia a moverse hacia arriba) exhibida por muchos insectos. Una fuente de luz situada directamente encima de la olfatómetro se aprovecha de la phototaxis positivo (tendencia a moverse hacia la fuente de luz) exhibido por muchos insectos. El olfactometer es particularmente útil para insectos hemípteros que tienden a no exhibir movimiento fácilmente en olfatómetros orientados horizontalmente y que están muy influenciados por la intensidad de la luz con respecto a la orientación. Sin embargo, este dispositivo se puede utilizar para una amplia gama de insectos voladores y rastreros, así como arácnidos. El olfatómetro puede emplearse para evaluar tanto los atrayentes y repelentes. En el caso de los atrayentes, el campo olor bifurcada (Figura 1) se establece con el atrayente putativo liberado en un lado versus aire limpio liberada en el lado opuesto. Una selección es registrada cuando el insecto liberado en la base del olfatómetro elige uno de los dos campos de olor. En el caso de repelentes, un comportamiento tercero es posible. Además del movimiento hacia arriba en cualquiera de los dos campos de olor, la falta de movimiento hacia arriba puede estar grabada que indica un estímulo que no responde o repeler estímulo de los campos de olor sea.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Equipo </td><td> Empresa </td><td> El número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Dos puertos dividido T-olfatómetro </td><td> Analytical Systems Research (ARS), Inc. Gainesville, FL </td><td> Ninguno (por encargo) </td><td> Si no está disponible a partir de ARS, Científica del Sur (Gainesville, FL) también actualmente construye y distribuye equipos. </td></tr><tr><td> En fase sólida micro-extracción explotación / cámara de fuente de olor con Teflon;-conectores de tubo de vidrio. </td><td> Analytical Systems Research (ARS), Inc. Gainesville, FL </td><td> RV-R3 </td><td> Véase el comentario </td></tr><tr><td> Sistema de aire de suministro </td><td> Analytical Systems Research (ARS), Inc. Gainesville, FL </td><td> HADS-2AFM2C.4 </td><td> Véase el comentario </td></tr><tr><td> Guillotina cámara </td><td> Analítica Researco Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL </td><td> L3GP3 </td><td> Véase el comentario </td></tr></tbody></table>

vertical t-maze choice assay for arthropod response to odorants

Dada la importancia económica de los insectos y arácnidos como plagas de cultivos agrícolas, los entornos urbanos o como vectores de enfermedades de plantas y humanos, diversas tecnologías están siendo desarrollados como herramientas de control. Un subconjunto de estas herramientas se centra en la modificación del comportamiento de los artrópodos por atracción o repulsión. Por lo tanto, los artrópodos son a menudo el foco de las investigaciones del comportamiento. Diversas herramientas se han desarrollado para medir el comportamiento de los artrópodos, incluyendo túneles de viento, molinos de vuelo, servospheres, y varios tipos de olfatómetros. El propósito de estas herramientas es para medir la respuesta del insecto o arácnido a las señales visuales o más a menudo olfativo. La vertical T-laberinto oflactometer descrito aquí mide elecciones realizadas por los insectos en respuesta a atrayentes o repelentes. Se trata de un dispositivo de ensayo de alto rendimiento que se aprovecha de la phototaxis positivo (atracción a la luz) y negativos (geotaxis tendencia a caminar o volar hacia arriba) exhibidas por muchos artrópodos. El olfactometer consiste en un tubo de vidrio de 30 cm que se divide por la mitad con una tira de teflón formando un laberinto en T. Cada mitad sirve como un brazo del olfatómetro que permite a los sujetos de prueba para hacer una elección entre dos campos de olores potenciales en ensayos que implican atrayentes. En los ensayos que implican repelentes, la falta de respuesta normal a los atrayentes conocidos también se puede medir como una tercera variable.

Atracción de psílidos asiáticos de cítricos (Diaphorina citri) adultos a los olores de sus volátiles natales de plantas hospederas (cítricos) se representa en la figura 2A. Los adultos de manera significativa (α &lt;0,05) más eligió el brazo del olfatómetro laberinto en T recibir los olores de las plantas de cítricos que viven en comparación con un blanco (aire limpio) de control. Un ejemplo de repulsión se muestra en la Figura 2B. En este caso, los insectos fueron expuestos a un brazo de los volátiles de cítricos laberinto T-receptores, mientras que el segundo brazo recibido volátiles a partir de una planta de cítricos que se trató con el conocido disulfuro repelente, dimetil 11. En este caso, tres tipos de comportamientos fueron observados. El número de psílidos detenidos en el brazo de liberación y que no responden no fue diferente estadísticamente del número que entra en el brazo de la recepción de los olores de las plantas de cítricos sola (Figura 2B). Sin embargo, no psílidos entrado en el brazo que contiene tque acogerá la planta volátil cuando co-presentó con el repelente (Figura 2B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50229/50229fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático de la orientación vertical laberinto en T olfatómetro se unió a sistema de suministro de aire y los dispositivos de tratamiento de olores de liberación. El diagrama es una adaptación de la figura 1 en Mann et al. 10. Un sujeto de ensayo se colocaron individualmente en la cámara de liberación de la 2-puerto dividido T-olfatómetro. Se mueve hacia los olores a través de una válvula de compuerta que permite el movimiento controlado hacia arriba en el olfatómetro y evita que el insecto se arrastra de nuevo en el área del punto de liberación. El tubo se bifurca 10 cm después del valor de entrada. Una respuesta positiva a un olor se graba una vez que el insecto se mueve 0,5 cm en un lado específico de la división. La cámara de guillotina colección volátil puede ser utilizado en lugar de un sólido PHAse micro-extracción explotación / cámara de olor fuente (SPMEC) como una fuente de olor. <img alt="Figura 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50229/50229fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50229/50229fig2.jpg" /> Figura 2. Respuesta de asiáticos psílido de los cítricos (Diaphorina citri) adultos a volátiles de plantas hospedantes cítricos versus un control de aire limpio (A) o volátiles de cítricos contra los volátiles de cítricos co-editado con un (disulfuro de dimetilo) repelente (B) en una orientación vertical T -laberinto olfatómetro Figura 2A:. Una forma de análisis de varianza (ANOVA) seguido por el test HSD de Tukey (α &lt;0,05) se realizó para comparar el número de psílido hacer una elección entre cualquiera de los brazos (2 tratamientos, n = 120). Las columnas indicadas por letras diferentes son significativamente diferentes de otro (α &lt;0,05) una figura 2B:. Unidireccionales analyses de la varianza (ANOVA) seguido por el test HSD de Tukey (α &lt;0,05) se realizó para comparar el número de psílido hacer una elección entre cualquiera de los brazos o la permanencia en el punto de liberación (3 tratamientos, n = 120). Las columnas indicadas por letras diferentes son significativamente diferentes uno del otro (α &lt;0,05).

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Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

Una vertical, laberinto en T olfatómetro se describe para el ensayo de la respuesta de comportamiento de los artrópodos. El olfatómetro permite al experimentador para medir las opciones realizadas por los sujetos del ensayo cuando a dos campos de olores potenciales. Tanto atracción y repulsión a partir de sustancias olorosas se pueden medir con este dispositivo.

Vertical T-laberinto Choice Ensayo para la respuesta a los olores artrópodos

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, ...

vertical-t-maze-choice-assay-for-arthropod-response-to-odorants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K vistas.  University of Florida. Una vertical, laberinto en T olfatómetro se describe para el ensayo de la respuesta de comportamiento de los artrópodos. El olfatómetro permite al experimentador para medir las opciones realizadas por los sujetos del ensayo cuando a dos campos de olores potenciales. Tanto atracción y repulsión a partir de sustancias olorosas se pueden medir con este dispositivo.

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T-maze Forced Alternation and Left-right Discrimination Tasks for Assessing Working and Reference Memory in Mice

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in rodents. In our laboratory, we evaluated the two types of memory in more than 30 strains of genetically engineered mice using the automated version of this apparatus. Here, we present the modified T-maze apparatus operated by a computer with a video-tracking system and our protocols in a movie format. The T-maze apparatus consists of runways partitioned off by sliding doors that can automatically open downward, each with a start box, a T-shaped alley, two boxes with automatic pellet dispensers at one side of the box, and two L-shaped alleys. Each L-shaped alley is connected to the start box so that mice can return to the start box, which excludes the effects of experimenter handling on mouse behavior. This apparatus also has an advantage that in vivo microdialysis, in vivo electrophysiology, and optogenetics techniques can be performed during T-maze performance because the doors are designed to go down into the floor. In this movie article, we describe T-maze tasks using the automated apparatus and the T-maze performance of &alpha;-CaMKII+/- mice, which are reported to show working memory deficits in the eight-arm radial maze task. Our data indicated that &alpha;-CaMKII+/- mice showed a working memory deficit, but no impairment of reference memory, and are consistent with previous findings using the eight-arm radial maze task, which supports the validity of our protocol. In addition, our data indicate that mutants tended to exhibit reversal learning deficits, suggesting that &alpha;-CaMKII deficiency causes reduced behavioral flexibility. Thus, the T-maze test using the modified automatic apparatus is useful for assessing working and reference memory and behavioral flexibility in mice.

This article presents the protocol of T-maze tests using a modified automated apparatus for assessing the learning and memory functions in mice.

T-laberinto alternancia forzada y la izquierda-derecha para la evaluación de las tareas de discriminación y de trabajo de la memoria de referencia en ratones

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in ...

Investigación

Neurociencias

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Métodos de ensayo a Drosophila Comportamiento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). There are several behavioral mechanisms through which an insect learns salient associations and relates them to these events. It is important to understand this behavioral plasticity for programs aimed toward assisting insects that are beneficial for agriculture. This understanding can also be used for discovering solutions to biomedical and agricultural problems created by insects that act as disease vectors and pests. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol was developed for honey bees (Apis mellifera) over 50 years ago to study how they perceive and learn about floral odors, which signal the nectar and pollen resources a colony needs for survival. The PER procedure provides a robust and easy-to-employ framework for studying several different ecologically relevant mechanisms of behavioral plasticity. It is easily adaptable for use with several other insect species and other behavioral reflexes. These protocols can be readily employed in conjunction with various means for monitoring neural activity in the CNS via electrophysiology or bioimaging, or for manipulating targeted neuromodulatory pathways. It is a robust assay for rapidly detecting sub-lethal effects on behavior caused by environmental stressors, toxins or pesticides.
We show how the PER protocol is straightforward to implement using two procedures. One is suitable as a laboratory exercise for students or for quick assays of the effect of an experimental treatment. The other provides more thorough control of variables, which is important for studies of behavioral conditioning. We show how several measures for the behavioral response ranging from binary yes/no to more continuous variable like latency and duration of proboscis extension can be used to test hypotheses. And, we discuss some pitfalls that researchers commonly encounter when they use the procedure for the first time.

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

Un Protocolo de Respuesta de probóscide Extensión para la Investigación de la plasticidad de comportamiento en Insectos: Aplicación a Basic, Biomédica y de Investigación Agrícola

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Incremento dependiente del tiempo en la respuesta de la red a la estimulación de cultivos de células neuronales en matrices de microelectrodos

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Electroencephalographic, Heart Rate, and Galvanic Skin Response Assessment for an Advertising Perception Study: Application to Antismoking Public Service Announcements

The evaluation of advertising, products, and packaging is traditionally performed through methods based on self-reports and focus groups, but these approaches often appear poorly accurate in scientific terms. Neuroscience is increasingly applied to the investigation of the neurophysiological bases of the perception of and reaction to commercial stimuli to support traditional marketing methods. In this context, a particular sector or marketing is represented by public service announcements (PSAs). The objective of this protocol is to apply electroencephalography (EEG) and autonomic signal analysis to study responses to selected antismoking PSAs. Two EEG indices were employed: the frontal alpha band EEG asymmetry (the Approach Withdrawal (AW) index) and the frontal theta (effort index). Furthermore, the autonomic Emotional Index (EI) was calculated, as derived from the Galvanic Skin Response (GSR) and Heart Rate (HR) signals. The present protocol describes a series of operational and computational steps required to properly estimate, through the aforementioned indices, the emotional and cerebral reaction of a group of subjects towards a selected number of antismoking PSAs. In particular, a campaign characterized by a symbolic communication style (classified as "awarded" on the basis of the prizes received by specialized committees) obtained the highest approach values, as estimated by the AW index. A spot and an image belonging to the same PSA campaign based on the "fear arousing appeal" and with a narrative/experiential communication style (classified as "effective" on the basis of the economical/health-related improvements promoted) reported the lowest and highest effort values, respectively. This is probably due to the complexity of the storytelling (spot) and to the immediateness of the image (a lady who underwent a tracheotomy). Finally, the same "effective" campaign showed the highest EI values, possibly because of the empathy induced by the testimonial and the explicitness of the message.

The following protocol describes a series of operational and computational steps required to properly estimate the emotional and cerebral reaction of a group of subjects towards a selected number of Public Service Announcements (PSAs) against smoking, aired in the USA and Europe during the period between 1998 and 2015.

Estudian electroencefalográfico, de ritmo cardíaco, respuesta galvánica de la piel evaluación y para la percepción de la publicidad: aplicación para anuncios de servicio público antitabaco

The evaluation of advertising, products, and packaging is traditionally performed through methods based on self-reports and focus groups, but these ...

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, oviposition, and mating. Myriad chemicals of varying volatilities have been identified as natural odorants that activate insect Olfactory Receptor Neurons (ORNs). However, studying the olfactory responses to low-volatility odorants has been hampered by an inability to effectively present such stimuli using conventional odor-delivery methods. Here, we describe a procedure that permits the effective presentation of low-volatility odorants for in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). By minimizing the distance between the odor source and the target tissue, this method allows for the application of biologically salient but hitherto inaccessible odorants, including palmitoleic acid, a stimulatory pheromone with a demonstrated effect on ORNs involved in courtship and mating behavior1. Our procedure thus affords a new avenue to assay a host of low-volatility odorants for the study of insect olfaction and pheromone communication.

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

The overall goal of this protocol is to demonstrate how to present odorants of low volatility for single-sensillum recording from Drosophila olfactory receptor neurons that respond to long-chain cuticular pheromones.

Registro electrofisiológico de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tricoide Sensilla en Respuesta a Odorantes de Baja Volatilidad

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Desarrollo de ensayos para cuantificación de contenido alto de Sod1 mutante de la proteína total formación en células vivas

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Seguimiento de comportamiento larvario de Drosophila en respuesta a la estimulación de la Optogenetic de las neuronas olfatorias

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

Un análisis del flujo de calcio de alto rendimiento para el estudio de los receptores NMDA con sensibilidad D/glicina-serina y glutamato

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Data Acquisition and Analysis In Brainstem Evoked Response Audiometry In Mice

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as visually evoked potentials (VEPs) or somatosensory evoked potentials (SEPs), the auditory evoked potentials (AEPs) are triggered by the repetitive presentation of identical stimuli, the electroencephalographic (EEG) response of which is subsequently averaged resulting in distinct positive (p) and negative (n) deflections. In humans, both the amplitude and the latency of individual peaks can be used to characterize alterations in synchronization and conduction velocity in the underlying neuronal circuitries. Importantly, AEPs are also applied in basic and preclinical science to identify and characterize the auditory function in pharmacological and genetic animal models. Even more, animal models in combination with pharmacological testing are utilized to investigate for potential benefits in the treatment of sensorineural hearing loss (e.g., age- or noise-induced hearing deficits). Here we provide a detailed and integrative description of how to record auditory brainstem-evoked responses (ABRs) in mice using click and tone-burst application. A specific focus of this protocol is on pre-experimental animal housing, anesthesia, ABR recording, ABR filtering processes, automated wavelet-based amplitude growth function analysis, and latency detection.

Brainstem evoked response audiometry is an important tool in clinical neurophysiology. Nowadays, brainstem evoked response audiometry is also applied in the basic science and preclinical studies involving both pharmacological and genetic animal models. Here we provide a detailed description of how auditory brainstem responses can be successfully recorded and analyzed in mice.

Adquisición y análisis de datos en Brainstem Evocada Audiometría de Respuesta en Ratones

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as ...