Agradecemos a Ye Zhang por la ayuda con los trazos de muestra y Tin Ki Tsang por la ayuda con las fotos. Este trabajo fue apoyado por un Premio de carrera temprana de la fundación de Ray Thomas Edwards y una concesión de NIH (R01DC015519) a las concesiones de C.-YS y de NIH (R01DC009597 y R01DK092640) a JWW

1. Preparación del hardware para la grabación de at4 <ol><li> Utilice un instrumento de extracción de pipeta para preparar electrodos con tubos de vidrio de aluminosilicato (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Blunt la punta del electrodo de referencia ligeramente con un par de pinzas finas para facilitar la inserción en el clypeus de la mosca ( es decir, una placa redondeada en la parte delantera de la cabeza de la mosca, por encima de las partes bucales). NOTA: En este estudio se utilizaron varones WT de 7 días de edad (Berlín). Utilice solución salina AHL 14 como el electrolito para ambos electrodos. </li><li> Preparar 1 L de AHL mediante la mezcla de 900 ml de agua destilada con 6,312 g de NaCl, 0,373 g de KCl, 0,337 g de NaHCO 3, 0,1120 g de NaH 2 PO 4, 1,892 g de trehalosa ּ 2 H 2 O, 3,423 g de sacarosa, 1,192 g de HEPES y 8,2 ml de MgCl _ { 2} 1M. Utilizando agua destilada, llevar el volumen total hasta 1 L. Llevar el pH a 7,4 usando NaOH 1 N y esterilizar la solución con unSistema de filtro accionado por vacío. Para almacenamiento a largo plazo, mantenga las alícuotas de AHL a 4 ° C. NOTA: Las entregas consistentes de ácido palmitoleico dependen de la uniformidad entre los cartuchos. Es crítico que cada cartucho esté ensamblado de una manera reproducible. </li><li> Utilizando una cuchilla de afeitar, retire 0,9 cm de la punta de una punta de pipeta de 200 μl para crear la primera sección del cartucho, que mide 4,1 cm; Consulte las dimensiones detalladas en la Figura 1A . Utilice otra punta de pipeta de 200 μl y quite 1,7 cm y 1,5 cm de la punta y la base, respectivamente, para crear la segunda sección del cartucho, midiendo 1,8 cm ( Figura 1A ). Utilice una regla para asegurar la reproducibilidad. </li><li> Utilice un perforador de ⅛ &quot;para cortar los discos del papel de filtro. </li><li> Utilice fórceps para colocar un disco de papel de filtro en la punta de la segunda sección del cartucho. Confirme visualmente que hay una abertura en la punta del cartucho a través de la cual puede pasar el aire. </li><li> Conecte las secciones de cartucho primero y segundo juntos, como se muestra en la Figura 1A . Ángulo de la segunda sección del cartucho hacia abajo para facilitar la orientación cuadrada en la preparación ( Figura 1B ). </li><li> Conecte el cartucho con el tubo de suministro de olor, que está montado en un micromanipulador. NOTA: Este diseño permite que el cartucho sea girado hacia afuera para facilitar el intercambio ( Figura 1C ). </li><li> Ajuste el flujo de aire humidificado constante a 2 L / min en un controlador de masa y el flujo de odorante a 500 mL / min en otro controlador de masa. </li><li> Usando el software (vea la Tabla de Materiales ), programe el procedimiento para administrar un soplo de olor de 500 ms. </li></ol> 2. Preparación de Soluciones Odorantes de Ácido Palmitoleico para Entrega NOTA: Or47b ORNs responder tanto a cis - y ácido -palmitoleic trans. Como el ácido palmitoleico es inestable en RT, las existencias se almacenan a -20 ° C y se utilizan dentro de un mes tras la apertura. El etanol es el disolvente de elección para el ácido palmitoleico. <ol><li> Utilice un mezclador de vórtice para mezclar bien 10 μl de ácido cis- o trans- palmitoleico o diluciones con 90 μl de etanol al 100% para diluciones en serie de diez veces en microtubos de 1,7 ml. Preparar diluciones frescas de ácido palmitoleico diariamente antes de los experimentos y usarlos en un día. NOTA: Para los odorantes que no son solubles en etanol, se recomienda un vial de vidrio para preparar diluciones de olor con otros tipos de disolventes orgánicos. </li><li> Utilizando una micropipeta P10, aplicar 5 μl de soluciones de ácido cis- palmitoléico de las diluciones deseadas al papel de filtro en cada cartucho correspondiente. NOTA: La dosis más alta (10 -1 ) contiene 450 μg del compuesto. Para las soluciones de ácido trans -palmitoleico, aplique 4,5 μL en lugar de modo que la dosis más alta (10 -1 ) también contenga 450 μg de tÉl compuesto. </li><li> Para evaporar completamente el disolvente, coloque los cartuchos de ácido palmitoleico en un desecador de vacío durante 1 h a RT y 7,59 mmHg de presión. NOTA: Los cartuchos se pueden utilizar hasta 4 h en RT. </li></ol> 3. Preparación de Drosophila para acceso listo a la Sensilla at4 para grabaciones electrofisiológicas in vivo NOTA: Las moscas WT (Berlín) se crian en medio estándar de harina de maíz a 25 ° C en un ciclo 12:12 luz-oscuridad. Tras la eclosión, las moscas se separan por sexo en grupos de diez, por lo que se alojan en grupo hasta los 7 días de edad. Or47b ORNs tanto en moscas masculinas como femeninas responden al ácido palmitoleico. Por simplicidad, sólo las moscas macho se examinan en el estudio actual. <ol><li> Montar una diapositiva de mosca-prep: en una diapositiva de cristal, coloque un cubreobjetos de vidrio (18 x 18 mm 2 ) sobre una pequeña cantidad de arcilla de modelado, formando un ángulo de ~ 3 ° con el portaobjetos de vidrio. Coloque la cinta de doble cara en el interior eDge de la cubreobjetos y en el área de la corredera inmediatamente debajo. Reemplace con cinta nueva por cada día de grabación ( Figura 2A ). </li><li> Utilice un aspirador de mosca 15 para recoger la mosca de interés en el tubo y luego coloque una punta de pipeta de 200 μL sobre el extremo del tubo. Simultáneamente deslice el tubo hacia adelante mientras sopla aire en el tubo para empujar la mosca hasta el extremo de la punta de la pipeta. Utilice una cuchilla de afeitar para cortar justo debajo del cuerpo de la mosca y 2 longitudes de las cabezas por encima de la mosca. </li><li> Tamp la parte inferior de la punta de la pipeta con la arcilla de modelado, empujando la mosca hacia arriba hasta tanto las antenas y el clypeus están expuestos ( Figura 2B ). Para evitar la muerte de la mosca, agregue sólo suficiente arcilla para exponer las antenas y aristae, ya que esto evita que el abdomen de la mosca de ser aplastado. Además, agregue la arcilla lentamente y suavemente para prevenir cualquier constricción repentina. Confirme que la mosca está viva revisando la antenaO movimiento de probóscide. </li><li> Use fórceps para maniobrar la punta de la pipeta que aloja la mosca. Oriente la cabeza de modo que el clypeus esté mirando a la derecha del observador. Ajustar la preparación a lo largo de la cubreobjetos con una pinza fina hasta que el lado lateral de la antena se apoye contra la superficie tapada de la cubreobjetos ( Figura 2B ). </li><li> Coloque una barra de sujeción en el arista para asegurar la antena a la cinta de doble cara para evitar el movimiento ( Figura 2B ). NOTA: La varilla de sujeción se extrae de un capilar de vidrio de borosilicato con un extractor de pipeta y se mantiene en posición con arcilla de modelado ( Figura 2A ). </li><li> Coloque la preparación en el escenario de la plataforma ( Figura 2C ). Utilizando el microscopio, confirme que los tricoides son visibles a lo largo del borde distal-lateral del tercer segmento de la antena. NOTA: Idealmente, la sensilla debe ser claramente silueta contra el fondo, lo que simplifica su<html> Identificación y facilita el registro ( Figura 3 ). En esta preparación, la mayoría de los accesibles tricino sensilla son del tipo at4. </li><li> Mantenga la preparación bajo flujo de aire humidificado constante (2 L / min) suministrado a través de un tubo de suministro de aire separado a una distancia de aproximadamente 2 cm de la preparación ( Figura 4 ), como se ha descrito anteriormente 2 , 15 . </li></ol> 4. Registro de At4 Sensillum Actividad de Or47b ORNs en los tricoides at4 en respuesta al ácido palmitoleico <ol><li> Inserte el electrodo de referencia en el clypeus ( Figura 3A ). Para evitar daños en los tejidos, asegúrese de que el electrodo se inserta justo debajo de la superficie, donde puede ponerse en contacto con la hemolinfa bajo la cutícula, con un movimiento rápido y suave. </li><li> Baje el electrodo de grabación lentamente hasta que entre en el mismo plano de visión que el objetivo sensillum (= &quot;Xfig&quot;&gt; Figura 3B). Grabe bajo un objetivo de 50X. NOTA: La cutícula tricoidal resistente requiere insertar el electrodo de registro en la base sensilar, cuya área más amplia proporciona un objetivo mayor que reduce la probabilidad de que el electrodo se desvíe ( figura 3B , inserto). </li><li> Antes de aplicar estímulos de olor a un sensor, observe los siguientes criterios de selección: Cualquier tricero que no cumpla con estos estándares debe ser rechazado y otro sensillum elegido en su lugar. <ol><li> Observe una alta relación señal-ruido (vea la Figura 3C para un ejemplo). </li><li> Observar identificables picos de 4A y 4C neuronas ( Figura 3C ]. NOTA: Es de destacar que la amplitud pico at4B parece muy similar a at4A 10 y no se puede identificar fácilmente sin estimulación olor. </li><li> Obsérvese que la tasa de disparo basal de las neuronas at4A esAlrededor o por debajo de 20 Hz. NOTA: Este criterio es específico para at4A porque la tasa de disparo basal para la neurona es mayor que la de los ORN básicos 2 . Un disparo basal mucho más alto indica que las neuronas pueden haber sido dañadas durante la inserción del electrodo. </li></ol></li><li> Conecte el cartucho al tubo de suministro de olor. Comience con el control de disolventes y después los odorantes, desde concentraciones bajas a altas. Utilice el micromanipulador para maniobrar el cartucho hacia la preparación mientras que apunta el cartucho directamente en la cabeza de la preparación. Confirme visualmente que el cartucho está apuntando directamente a la antena ( Figura 4 ) desde unos pocos milímetros de distancia. NOTA: El objetivo es orientar la apertura del cartucho directamente en la antena y colocarla cerca del tejido objetivo. </li><li> Asegúrese de que el cartucho de olor se separa del electrodo de registro a su derecha de 1 - 2 mm y de la mosca preP deslizarse por debajo de aproximadamente 1 mm. NOTA: En la configuración descrita aquí, el cartucho de olor está estrechamente rodeado por el electrodo de registro, el electrodo de referencia y la corredera de preparación de mosca ( Figura 4 ). NOTA: Preste atención a la distancia entre el cartucho y los electrodos de grabación / referencia. Se recomienda una distancia de alrededor de 4 mm 1 . El contacto involuntario puede terminar la señal y romper la punta del electrodo de grabación, dañando la neurona actual y complicando otras grabaciones. NOTA: Considere la distancia que separa el cartucho y la diapositiva de preparación de la mosca. Tocar el cubreobjetos también puede desalojar el electrodo de grabación para interrumpir la grabación. </li><li> Pulse &quot;Grabar&quot; en el software de adquisición de datos para iniciar la grabación. NOTA: Para cada grabación de 10 s, se suministra un solo impulso de olor de 500 ms directamente a la antena, como se describe en el paso 1.9. </li><li> Después de la aplicación odorante,Cuidadosamente retraer el cartucho antes de reemplazarlo con un cartucho de la siguiente concentración más alta. Continúe hasta que se obtenga el rango de dosificación completo. NOTA: Se recomienda que solo se registre un Or47b ORN de cada mosca para evitar posibles efectos de adaptación. </li><li> Enjuague bien el electrodo de registro con agua destilada después de terminar la grabación para el día. </li><li> Analizar y trazar los datos utilizando software de análisis offline disponible comercialmente. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, se describe un procedimiento por el cual las respuestas de Or47b ORNs a palmitoleic ácido puede ser fuertemente inducida y registrada. Se modificó un método convencional de entrega de olores a larga distancia 2 , 7 , 10 para solucionar el problema de suministro insuficiente de odorante de feromonas. Se abordó la cuestión de la baja volatilidad olorosa mediante la entrega del compuesto a través de cartuchos de olor,...

<html> Los ORNs de Drosophila responden a un gran número de odorantes, con longitudes de cadena de carbono ampliamente extendidas y una variedad de grupos funcionales, incluyendo ésteres, alcoholes, cetonas, lactonas, aldehídos, terpenos, ácidos orgánicos, aminas, compuestos de azufre, heterocíclicos y aromáticos 2 , 3 . Odorantes variados en sus características físico-químicas pueden tener volatilidades marcadamente diferentes, indicadas por la presión de vapor del compuesto. En particular, los odorantes biológicamente relevantes para Drosophila melanogaster difieren enormemente en su volatilidad. Por ejemplo, los ORN de Ir92a responden al amoníaco 4 , que es altamente volátil, con una presión de vapor de 6.432 mmHg a 20 ° C. Por el contrario, Or67d ORNs responden a una feromona masculina, acetato de cis- vinceno ( c VA) 5 , 6 , cuya presión de vapor es de 43 mmHg a 20 ° C. El estudio de la respuesta olfativa a los odorantes de baja volatilidad es particularmente difícil con los métodos convencionales de suministro de olores, en los que los odorizantes se suministran a través de una corriente de aire portadora a una distancia relativamente larga ( es decir, varios centímetros) A un determinado odorante de baja volatilidad puede variar en gran medida, dependiendo del diseño del sistema de suministro de olor.Por ejemplo, la respuesta informada de Or67d ORNs a una dosis alta de c VA oscila entre ~ 40 7 -&gt; 200 picos / s 6 . Además, la entrega ineficaz de c VA con métodos convencionales de entrega es probablemente atribuida a falsos resultados negativos, lo que lleva a la interpretación de que c VA por sí mismo no es suficiente para activar Or67d ORNs 8. Esta interpretación fue más tarde impugnada por otro estudio utilizando un Método de distribución de olores a corta distancia.Desarrollar un robusto sistema de suministro de olores para la presentación eficaz de olorantes de baja volatilidad. Recientemente, identificamos varios ácidos grasos cuticulares de cadena larga como ligandos para los ORN de Or47b. Se alojan en el tipo 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Entre los odorantes de ácidos grasos de cadena larga, encontramos que el ácido palmitoleico funciona como una feromona afrodisíaca que promueve el cortejo masculino mediante la activación de Or47b ORNs 1 . Sin embargo, en otro estudio utilizando un método de suministro de olor convencional, se demostró que el laurato de metilo induce respuestas de los ORN de Or47b, mientras que el ácido palmitoleico no evoca respuesta cuando se presenta a partir de la misma distancia 10 . En comparación con c VA, los ácidos grasos de cadena larga son aún menos volátiles, con presiones de vapor inferiores a 0,001 mmHg a 25 ° C 11 . La volatilidad inherentemente baja de los odorantes de ácidos grasos de cadena larga, que impide la presentación eficiente a la antena víaConvencional de los sistemas de suministro de olores, probablemente representaron los resultados falsos negativos [ 10] . Esta incoherencia pone de manifiesto la insuficiencia de los sistemas convencionales de suministro de olores al presentar olorantes de baja volatilidad. Anteriormente se demostró que el suministro efectivo de olores cuticulares de mosca requiere una estrecha proximidad entre la fuente de olor y el tejido diana 6 . Por lo tanto, para caracterizar completamente los efectos de las feromonas biológicamente activas mientras mimetiza la distancia desde la cual son probablemente encontrados por las moscas de la fruta en la naturaleza 12 , 13 , acordamos que la distancia mínima debe ser de alta prioridad en nuestro procedimiento. Nuestro método tiene otras ventajas, incluyendo la compatibilidad con equipos y técnicas de electrofisiología estándar. Las configuraciones de equipos preexistentes requieren una modificación mínima para acomodar este protocolo, y la mayoría de los pasos de SSR requieren solo ajustes menores. EstaHace que nuestra técnica sea fácilmente accesible a los investigadores con experiencia en SSR. Además, nuestra técnica permite la presentación de odorantes de baja volatilidad con inicio y desplazamiento agudos, correlacionando el estímulo con la respuesta neuronal. Finalmente, la disposición del hardware facilita los intercambios rápidos entre los cartuchos de olor, acelerando la recopilación de datos sobre un rango de dosificación deseado. Empezaremos por revisar la preparación de los electrodos de referencia y de registro, la solución de hemolinfa tipo adulto (AHL), los cartuchos de suministro de odorantes y el olfatómetro correspondiente. A continuación se discute la preparación de las soluciones odorantes de ácido palmitoleico, seguido por la preparación de la mosca para su registro. Se procede a considerar los criterios para seleccionar un tricloide sensillum para registrar y examinar más de cerca el posicionamiento del cartucho odorante antes de presentar datos representativos adquiridos usando este método. Finalmente, concluimos explorando aplicaciones útiles de esta técnicaUe, algunos problemas encontrados y sus soluciones.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Prep Setup &amp;amp; Miscellaneous Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Puller Instrument&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>P97</td><td>Pipette Puller</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments&lt;br/&gt; Sarasota FL USA</td><td>1B100F-4</td><td>to make holding rods</td></tr><tr><td>Aluminosilicate Glass Capillaries&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>AF100-64-10</td><td>to make electrodes</td></tr><tr><td>Superfrost Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; Pittsburgh PA USA</td><td>12-550-143</td><td>for fly-prep station</td></tr><tr><td>Permanent Double Sided Tape</td><td>Scotch&lt;br/&gt; St. Paul MN USA</td><td>NA</td><td>for fly-prep station</td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>Olympus&lt;br/&gt; Shinjuku Tokyo Japan</td><td>BX51</td><td>for recording rig</td></tr><tr><td>Plastalina modeling clay</td><td>Van Aken&lt;br/&gt; North Charleston SC USA</td><td>B0019QZMQQ</td><td>for prep station and to stablize the holding rod</td></tr><tr><td>Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm</td><td>Nalgene&lt;br/&gt; Rochester NY USA</td><td>#156-4045</td><td>to sterilize AHL solution</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cartridge Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L pipette tip&amp;nbsp;</td><td>VWR&lt;br/&gt; Radnor PA USA</td><td>53508-810</td><td>to make odor cartridges and fly prep</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman&lt;br/&gt; Maidstone Kent UK</td><td>740-E</td><td>to make odor cartridges&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vacuum Desiccator&amp;nbsp;</td><td>Cole-Parmer&lt;br/&gt; Vernon Hills IL USA</td><td>VX-06514-30</td><td>to vaporize ethanol solvent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Odorant Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cis-palmitoleic acid</td><td>Cayman Chemical&lt;br/&gt; Ann Arbor MI USA</td><td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td><td>Or47b odorant</td></tr><tr><td>trans-palmitoleic acid</td><td>Cayman Chemical&lt;br/&gt; Ann Arbor MI USA</td><td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td><td>Or47b odorant</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Spectrum Chemical MFG.&amp;nbsp;&lt;br/&gt; New Brunswick NJ USA</td><td>E1028-500MLGL</td><td>to dilute palmitoleic acid&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Rig Setup Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odorant Cartridge Micromanipulator</td><td>Siskiyou&lt;br/&gt; Grants Pass OR USA</td><td>MX130R</td><td>to position the olfactometer</td></tr><tr><td>Flow Vision software&amp;nbsp;</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>FLOWVISIONSC</td><td>software to control flow rate</td></tr><tr><td>Mass Controller</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>MC-2SLPM-D</td><td>to control the flow rate for humidified air</td></tr><tr><td>Mass Controller</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>MC-500SCCM-D</td><td>to control the flow rate for odor stimulation</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices&lt;br/&gt; Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>Data acquisition software</td></tr><tr><td>Air delivery tube</td><td>Ace Glass&lt;br/&gt; Vineland NJ USA</td><td>8802-936&amp;nbsp;</td><td>to deliver humidified air</td></tr><tr><td>50X objective lens&amp;nbsp;</td><td>Olympus&lt;br/&gt; Shinjuku Tokyo Japan</td><td>LMPLFL50X</td><td>recording rig</td></tr><tr><td>Clampfit 10</td><td>Molecular Devices&lt;br/&gt; Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>software for spike analysis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>WaveMetrics&lt;br/&gt; Lake Oswego OR USA</td><td>Ver. 6.37</td><td>software for data analysis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Audio Monitor</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXB-AUDIS-08B</td><td>Aurally reports individual spikes</td></tr><tr><td>Extracellular Amplifier</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXT-02F</td><td>to increase the amplitude of electrical signals</td></tr><tr><td>Valve Controller</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VC-8</td><td>to control the opening of the valve for odor stimulation</td></tr><tr><td>Recording Electrode Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>MP-285</td><td>to position recording electrode</td></tr><tr><td>Headstage Amplifier</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>EQ-16.0008</td><td>to increase the amplitude of electrical signals</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix&lt;br/&gt; Beaverton OR USA</td><td>TDS2000C</td><td>Visual report of individual spikes</td></tr></tbody></table>

electrophysiological recording from drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility

Los insectos dependen de su sentido del olfato para guiar una amplia gama de comportamientos que son críticos para su supervivencia, tales como la búsqueda de alimentos, la evitación de depredadores, la oviposición y el apareamiento. Se han identificado innumerables sustancias químicas de diferentes volatilidades como olores naturales que activan las Neuronas de Receptor Olfativas de Insectos (ORN). Sin embargo, el estudio de las respuestas olfativas a los odorizantes de baja volatilidad se ha visto obstaculizado por la incapacidad de presentar eficazmente tales estímulos usando métodos convencionales de suministro de olor. En este sentido, describimos un procedimiento que permite la presentación eficaz de los odorantes de baja volatilidad para la grabación de Sensillum único (SSR) in vivo . Al minimizar la distancia entre la fuente de olor y el tejido diana, este método permite la aplicación de los odorantes biológicamente sobresalientes pero hasta ahora inaccesibles, incluyendo el ácido palmitoleico, una feromona de estimulación con un efecto demostrado sobre ORNs implicados en cortejo y apareamiento comportamiento 1.Nuestro procedimiento proporciona así una nueva vía para analizar una serie de odorantes de baja volatilidad para el estudio de olfato de insectos y la comunicación de feromonas.

Nuestra técnica se aplicó con éxito para determinar la eficacia relativa de los isómeros trans ( Figura 5A ) versus isómeros cis ( Figura 5B ) del ácido palmitoleico. Nuestros datos representativos demuestra que el ácido trans- palmitoléico es un ligando más eficaz para Or47b ORNs en comparación con la cis isoforma ( Figura 5C ]. Se registró una única ...

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Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

El objetivo general de este protocolo es demostrar cómo presentar olorosos de baja volatilidad para el registro de un solo sensor de Drosophila neuronas receptoras olfativas que responden a la cadena larga de feromonas cuticulares.

Registro electrofisiológico de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tricoide Sensilla en Respuesta a Odorantes de Baja Volatilidad

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

electrophysiological-recording-from-drosophila-trichoid-sensilla

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

8.8K vistas.  University of California San Diego.  El objetivo general de este protocolo es demostrar cómo presentar olorosos de baja volatilidad para el registro de un solo sensor de Drosophila neuronas receptoras olfativas que responden a la cadena larga de feromonas cuticulares. 

Video: Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Grabaciones solo Sensillum en los insectos Drosophila melanogaster Y Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Investigación

Neurociencias

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

De alta resolución de medición del comportamiento de olor-Driven en larvas de Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Biología

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

Electrofisiológico Grabación desde<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

La medición de las respuestas fisiológicas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas sensoriales a los lípidos feromonas Uso de Imagen de calcio en Vivo

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Inmunología e Infección

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

De alta resolución de cuantificación del comportamiento guiado Olor en<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uso de la<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigma

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Comportamientos olfativas ensayó mediante seguimiento informático de<em&gt; Drosophila</em&gt; En un olfatómetro de cuatro cuadrantes

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Single Sensillum Recordings for Locust Palp Sensilla Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially for the detection of non-volatile chemical cues through sensilla chaetica (previously named terminal sensilla or crested sensilla). There is now increasing evidence that these palps also have an olfactory function. An odorant receptor (LmigOR2) and an odorant-binding protein (LmigOBP1) have been localized in the neurons and accessory cells, respectively, in the sensilla basiconica of the palps. Single sensillum recording (SSR) is used for recording the responses of odorant receptor neurons, which is an effective method for screening active ligands on specific odorant receptors. SSR is used in functional studies of odorant receptors in palp sensilla. The structure of the sensilla basiconica located on the dome of the palps differs somewhat from the structure of those on the antennae. Therefore, when performing an SSR elicited by odorants, some specific advice may be helpful for obtaining optimum results. In this paper, a detailed and highly effective protocol for an SSR from insect palp sensilla basiconica is introduced.

This paper describes a detailed and highly effective protocol for single sensillum recordings from the sensilla basiconica on the palps of insect mouthparts.

Grabaciones de Sensillum solo para langosta palpo Sensilla Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially ...

Un método novedoso para mejorar el análisis de la actividad de las neuronas gustativas de los insectos

Base Recording: A Technique for Analyzing Responses of Taste Neurons in Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential food source, compounds from the food source enter through the pore and activate neurons within. For over 50 years, these responses have been recorded using a technique called tip recording. However, this method has major limitations, including the inability to measure neural activity before or after stimulus contact and the requirement for tastants to be soluble in aqueous solutions. We describe here a technique that we call base recording, which overcomes these limitations. Base recording allows the measurement of taste neuron activity before, during, and after the stimulus. Thus, it allows extensive analysis of OFF responses that occur after a taste stimulus. It can be used to study hydrophobic compounds such as long-chain pheromones that have very low solubility in water. In summary, base recording offers the advantages of single-sensillum electrophysiology as a means of measuring neuronal activity - high spatial and temporal resolution, without the need for genetic tools - and overcomes key limitations of the traditional tip recording technique.

Autor destacado: Avances en quimiorrecepción: de los receptores de olor de insectos a los ARN no codificantes

A rarely used method of electrophysiological recording, base recording, allows analysis of features of taste coding that cannot be examined by conventional recording methods. Base recording also allows the analysis of taste responses to hydrophobic stimuli that cannot be studied using traditional electrophysiological methods.

Registro de bases: una técnica para analizar las respuestas de las neuronas gustativas en Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential ...

Registro electrofisiológico de

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Grabaciones solo Sensillum en los insectos Drosophila melanogaster Y Anopheles gambiae

De alta resolución de medición del comportamiento de olor-Driven en larvas de Drosophila

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

Electrofisiológico Grabación desde

La medición de las respuestas fisiológicas de

De alta resolución de cuantificación del comportamiento guiado Olor en

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular

Comportamientos olfativas ensayó mediante seguimiento informático de

Grabaciones de Sensillum solo para langosta palpo Sensilla Basiconica

Registro de bases: una técnica para analizar las respuestas de las neuronas gustativas en Drosophila