Este protocolo proporciona información detallada sobre cómo planificar, llevar a cabo y analizar las respuestas de tronco cerebral evocado de clics y ráfagas de tono en ratones. La principal ventaja de esta técnica es que permite un perfil auditivo complejo y rápido de modelos farmacológicos y de ratón mutante. Los nuevos conocimientos sobre la app temprana alt-er-ed y el cambio asociado en el procesamiento auditivo en ratones y ratas se pueden traducir a los seres humanos.
Por lo tanto, este método es de importancia central en la caracterización y el fenotipado de enfermedades auditivas, neurológicas y. Este método es más importante para la identificación de disacusis, hipoacusis y anacusis. Por ejemplo, en la pérdida de audición metabólica, congénita y aspi-met-acury relacionada con la edad, así como en déficits auditivos debido a deformidades o malformaciones, lesiones y neoplasias.
Los usuarios nuevos en la técnica, deben prestar especial atención a la correcta electro-colocación y calibración pre-experimental del sistema. La demostración visual del método es fundamental para ilustrar la anestesia, la grabación ABR, los procesos de filtrado abr y los neur-o-lass-es automatizados abr. Comience encendiendo el preamplificador conectado al micrófono, al menos cinco minutos antes de la calibración, para permitir el equilibrio del sistema.
Encienda el osciloscopio. A continuación, coloque el micrófono, conectado a un preamplificador dentro del sonido atenuante cúbico, para imitar el oído murino experimental. A continuación, abra los softwares de procesamiento y adquisición disponibles comercialmente y programe los protocolos de estímulo para los clics y las ráfagas de tono.
Comience con la entidad de estímulo de clics para análisis y determinar umbrales de clics. Seguido por la simetría ABR de la oreja izquierda y derecha. Y las amplitudes y latencias de ABR más adelante.
A continuación, utilice el mismo software para verificar el protocolo de estimulación de ráfagas de tono utilizando el software de diseño de estímulo Sig-Gen RZ. Y comprueba la configuración de estímulo, bajo el software de adquisición Bio-Sig RZ. Programe el rango de frecuencia adecuado que se va a probar, dependiendo de la cuestión científica, y asegúrese de que los rangos de frecuencia a aplicar cumplen con las capacidades técnicas del altavoz.
Para promediar, establezca el número de estímulos acústicos secuenciales, ya sea clics o ráfagas de tono, por ejemplo, a 300 veces, con una tasa de 20 por segundo; una duración media de 25 milisegundos y el factor de amplificación del preamplificador, 20 veces. A continuación, verifique la velocidad de muestreo adecuada para la adquisición de datos ABR y, a continuación, pase el filtro mediante un filtro de valor de mantequilla de seis sondeos. Active el filtro de muesca si es necesario.
Inicie la calibración de la ráfaga de tono seleccionando el archivo calibration:CAL200K;dentro del software, para activar el modo de configuración de calibración. Y elegir perímetros de acuerdo a las condiciones experimentales. Utilice el sistema de procesador para ejecutar el procedimiento de calibración.
Asegúrese de que las especificaciones técnicas del micrófono y el altavoz, en términos de nivel de presión sonora o límites SPL, rango de frecuencia y distribución armonizan. A continuación, seleccione e inicie el protocolo de estimulación de clics predefinido. Ejecute un SPL de un solo clic para verificar que el espectro de estímulos de sonido es analizado por la transformación rápida en línea de cuatro ay del osciloscopio, coincide con los requisitos.
Seleccione e inicie el protocolo de estimulación de ráfagas de tono predefinido, dentro del rango de uno a 42 kilohercios. Confirme el espectro de frecuencia de los estímulos de prueba acústica registrados, utilizando un osciloscopio y FFT en línea. Finalmente, complete la calibración de la ráfaga de tono cargando el archivo de calibración creado en el protocolo de estímulo de ráfaga de tono.
Comience colocando el ratón anestesiado dentro de un cubículo atenuante del sonido, forrado con espuma acústica. Para el registro del tronco cerebral monaural evocó potenciales auditivos, inserte electrodos de acero inoxidable subdérmico en el vértice, axial del ojo de alfiler y lateral ventral del pinna derecho o izquierdo dependiendo de la oreja a medir. En el otro extremo, para grabaciones binaurales, coloque los electrodos negativos tanto en el pinna derecho como en el izquierdo.
Coloque el electrodo de tierra en la cadera del animal. Antes de la inserción, se garantiza la forma de gancho en la punta del electrodo de acero inoxidable que es la fijación subdérmica de los electrodos. Y una vez insertado, coloque correctamente la tribuna del ratón 10 centímetros frente al altavoz.
Conecte todos los electrodos a la etapa principal y compruebe su impedancia. A continuación, realice mediciones de impedancia de todos los electrodos, antes de cada grabación, para verificar el posicionamiento y la conductividad de los electrodos adecuados. Grabe ABRs en condiciones de campo libre con un solo altavoz.
Por último, realice el análisis de ABR a través de la detección automatizada de umbrales y el análisis de latencia de ondas para determinar picos positivos y ondas negativas. Como primer paso en el análisis del rendimiento auditivo general, se investigaron los ABR evocados por clics para diferentes SPL, entre cero y 90, utilizando el sistema automatizado de detección de umbrales ABR. Se analizaron posibles alteraciones en los niveles de umbral ABR evocados por diferentes frecuencias de ráfaga de tono.
En las líneas ejemplares del ratón, Cav3.2 más, menos y Cav3.2 menos, menos exhibió mayores umbrales auditivos relacionados con el clic y la ráfaga de tono en comparación con los controles. Por último, la función de crecimiento de amplitud ABR evocada por clics y el análisis de latencia de forma de onda ABR se llevaron a cabo a través de un enfoque basado en ondas. Este último permite conocer la posible influencia spacio-temporal del gen de interés en el procesamiento de la información auditiva dentro del oído interno y el tronco encefálica.
La colocación adecuada del electrodo ABR en la medición de Pinna y la calibración del sistema son esenciales para realizar esta técnica. El enfoque auditivo presentado aquí, también se puede utilizar en combinación con un sistema de telemetría para analizar potenciales complejos, de latencia media y evocados por el último auditorio. Esto ayuda en la caracterización y en el fenotipado de enfermedades auditivas, neurológicas y neurológicas.
