Damos las gracias a la Sra. Angela Freund por la excelente asistencia técnica en seccionar los stents plásticos incrustados. Agradecemos también la señora Roya Soltan y la Sra. Angela Freund para la ayuda profesional con la tinción inmunohistoquímica.

1. Preparación de stent y de implantación <ol><li> El stent struts (Fort Wayne Metals, Castlebar, Irlanda) fueron trenzados y luego se corta a la medida deseada en el Instituto de Tecnología Textil e Ingeniería Mecánica, Universidad RWTH Aachen en Alemania (fig. 1A). </li><li> Antes de la implantación, los stents deben ser transferidos a un tubo de 2 cm de silicio, usando fórceps, y se colocaron 2 mm en un extremo terminal, denominado extremo delantero (Figura 1A). </li><li> La parte delantera debe ser cortada oblicuamente, para garantizar una punta afilada para la implantación. </li><li> Antes de la implantación, el stent debe ser abundantemente regado, para asegurar el deslizamiento. </li></ol> 2. Implantación de stent <ol><li> 10-12 semanas de edad ratones de tipo salvaje C57BL / 6 macho, 25-27 g se anestesian mediante inyección intraperitoneal de 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina. Anestesia adecuada se confirmó antes de la cirugía por la falta de reflejos ymovimiento barba. Para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia, los ojos del ratón están cubiertos por una película de crema de Bepanthene. </li><li> Después del afeitado y desinfección de la zona ventral del cuello, una pequeña incisión mediana de 1 cm se realiza bajo un microscopio estereoscópico, con unas tijeras. Después de separar los cuerpos grasos con 2 pinzas curvas estériles, la arteria carótida común izquierda se puede ver pulsante, junto con la tráquea. </li><li> 1 cm de la arteria carótida común izquierda y la bifurcación deben estar libres preparados. 1 nudo con una rosca de 5/0 seda será atado alrededor de la arteria carótida común izquierda, 2 nudos con 7/0 hilos de seda se unirán alrededor de la arteria carótida externa izquierda y 1 nudo con un hilo 7/0 seda estarán obligados alrededor de la arteria carótida interna (Figura 1B). </li><li> El flujo de sangre se interrumpe a continuación, mediante la unión de los nudos en la arteria carótida interna y la arteria carótida externa proximal con firmeza, así como tirando de la envolvente nudoción de la arteria carótida común. El recipiente debe fijarse de manera que la arteria carótida común y externos están en una línea recta. </li><li> Se realiza una pequeña incisión en la arteria carótida externa, cerca del nudo proximal, utilizando una tijera Vannas. El tubo de silicona que contiene el stent se introduce en la arteria carótida externa, con el extremo afilado en frente, usando una guía-alambre. Después de que el stent alcanza la posición deseada, el tubo de silicona se tira hacia atrás sobre la guía-alambre y permite la expansión de memoria de forma del stent (Figura 1B). </li><li> El nudo distal de la arteria carótida externa se une fuertemente a cerrar el sitio de la incisión y los nudos en la arteria carótida interna y comunes se eliminan, restableciendo así el flujo sanguíneo. </li><li> La incisión se cierra con suturas 3-4 clips Michel y Michel fórceps. El ratón se coloca bajo la luz roja hasta la recuperación completa. Un tratamiento analgésico no es necesario. </li><li> Lala placa puede ser analizado después de 1-3 semanas. Estudiar la reendotelización, un punto de los últimos tiempos antes es necesario (3-4 días). Hemos observado en nuestro modelo de implante de stent que 4 semanas después de esta intervención quirúrgica, especialmente por el uso de revestimientos específicos para biofunctionalize los stents miniaturizados, neoangiogénesis se produce en aproximadamente el 30% de la muestra. Esta es una cierva en los procesos de remodelación y regeneración, con diferentes mecanismos y que representan otro problema patológico. Para concentrarse en la formación de neoíntima, estenosis en el stent y / o análisis de los mecanismos subyacentes a estos efectos secundarios después de la implantación del stent de un punto de 3 semanas de tiempo final sería beneficioso no mezclar con los efectos regeneradores inducidos por la aparición de la neoangiogénesis. </li></ol> 3. Análisis de la formación de placa <ol><li> En el punto de tiempo final, los animales se anestesian usando inyección intraperitoneal de 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina.Anestesia adecuada se confirmó antes de la cirugía por la falta de los reflejos y el movimiento barba. </li><li> Los animales son sacrificados por desangrado intracardiaca. La sangre se recoge el suero para el análisis adicional. </li><li> Después de abrir la cavidad torácica y PBS de lavado a través de punción intracardiaca, un cuerpo-perfusión con solución de paraformaldehído al 4% (PFA) se lleva a cabo durante 5 min. La arteria carótida izquierda que contiene el stent se disecciona, se coloca directamente en una solución de PFA 4% y al menos 16 horas más tarde embbeded en plástico. </li><li> 50 micras de espesor secciones se realizan a partir de plástico incrustados muestras usando una banda de sierra de diamante. </li><li> Para medir el tamaño de la placa, se realizó una tinción de Giemsa. </li><li> Para analizar la tasa de re-endotelización del stent dentro de la zona de la embarcación, se lleva a cabo la inmunohistoquímica para el factor de von Willebrand (vWF). </li></ol>

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+in-stent+stenosis+in+ApoE+knockout+mice:+insights+from+a+novel+mouse+model+of+balloon+angioplasty+and+stenting.">Increased in-stent stenosis in ApoE knockout mice: insights from a novel mouse model of balloon angioplasty and stenting.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27, 833-840 (2007).</li><li>Chamberlain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+in+situ+stenting.">A novel mouse model of in situ stenting.</a> Cardiovasc. 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No hay conflictos de interés declarado.

Para reducir el riesgo de trombosis en el stent y la reestenosis y sostener el desarrollo de nuevos recubrimientos para stents liberadores de fármacos, un método fácil, sencillo y accesible de la implantación del stent en un modelo animal es necesario. Ratones ofrecer el sistema ideal para estudiar los complejos mecanismos de la remodelación arterial después de la implantación del stent y la eficacia de estos fármacos. Los modelos existentes de la reestenosis intra-stent en el ratón son difíciles, requieren habilidades quirúrgicas altos e implican un alto riesgo de complicaciones como sangrado o parálisis 17-19. Por ejemplo, en el modelo de la endoprótesis de la implantación en la aorta torácica de un ratón donante después de globo de dilatación del vaso y después del trasplante del segmento con stent en la arteria carótida de un ratón receptor 17, el estudio de los mecanismos pato-no es influido sólo por reacción destinatario para material donante, sino también por la masiva perjudicial de vasa vasorum y adventicia. Implantación de un acero steel stent directamente en la aorta abdominal después de globo de dilatación 19 es seguida por una alta tasa de mortalidad (35%) a causa de patas parálisis después de una trombosis o sangrado de la aorta abdominal en el sitio de la arteriotomía. Implantación de una espiral en forma de autoexpandible de nitinol-stent en la aorta abdominal a través de la arteria femoral 18 necesita las habilidades quirúrgicas de alta, debido principalmente a ciegas dirigir el stent a lo largo de la ramificación de la arteria femoral a la aorta para colocar el stent en la posición correcta. Este procedimiento es seguido por un alto riesgo de dañar el nervio femoral, por lo tanto, la parálisis de la pata trasera. En comparación con estos procedimientos, el modelo de implantación de stent en el ratón no necesita habilidades quirúrgicas de alto. Nuestro modelo ofrece un método simple, fácil y eficaz para analizar los efectos de las diferentes drogas revestimientos en remodelación arterial, la colocación del stent se realiza bajo la vista, y no hay riesgo de dañar los nervios u otras estructuras. La commecanismos moleculares complejas pueden ser investigados más fácil en nuestro modelo de ratón stent de la arteria carótida, no sólo por la accesibilidad directa de la embarcación, sino también debido a la existencia de diferentes cepas de ratones knock-out. Como una limitación, en comparación con el procedimiento clínico, el modelo utiliza ratones / arterias sanas y no lleva a cabo la colocación de stents en placas pre-existentes (no reestenosis intra-stent, pero estenosis intra-stent). Tampoco realizamos con balón de dilatación antes de la implantación del stent. Sin embargo, debido al daño masivo de la pared del vaso en ambos modelos, los procesos reparadores son similares. Desafortunadamente, debido a los artefactos de metal-derivados, una monitorización in vivo del crecimiento de la neoíntima no es posible por métodos de imagen existentes como ultrasonido o tomografía por ordenador. Otro factor limitante es el seccionamiento fino de stents basados ​​en metal, lo que requiere un poco de experiencia en el procesamiento de metales. Usando este método, hemos sidocapaz de demostrar, que los neutrófilos instruir biofuncionalizadas nitinol stents recubiertos con LL-37 reducir reestenosis intra-stent, proporcionando un nuevo concepto para promover la cicatrización vascular después de la terapia intervencionista 21 miniaturizados. A pesar de estas limitaciones, este modelo parece ser, hasta ahora, el sistema más adecuado, con lo que el dinero y el ahorro de tiempo, para investigar nuevos recubrimientos para stents de drogas y sus efectos sobre los eventos moleculares durante la remodelación arterial. Por otra parte, este modelo se puede adaptar fácilmente para el hámster, que es más similar a la humana, por lo que cada hipótesis terapéutica puede ser verificada antes de aplicar a animales más grandes o humanos para evitar efectos desagradables e inesperados.

Las enfermedades cardiovasculares causadas por la progresión de la aterosclerosis son la principal causa de muerte en los países industrializados. La aterosclerosis es un centro de coordinación de respuesta inflamatoria, fibro-proliferativa de la pared vascular a la lesión endotelial 1, dando como resultado la formación de una placa extendida en el lumen del vaso, que afecta el flujo sanguíneo a través de las arterias coronarias. Más del 75% de los infartos de miocardio resultado de la ruptura de la capa fibrosa fina de la placa inflamada 2. Dado que esta complicación puede ser fatal, un transluminal percutánea (coronaria) percutánea (ACTP) con stent se convirtió en el tratamiento de primera elección en la práctica médica actual. El método permite la dilatación de la arteria coronaria estrechada y por lo tanto la restauración del flujo sanguíneo. Al mismo tiempo, se produce una lesión medida en el endotelio y la pared del vaso 3. Sin embargo, el efecto a largo plazo de esta terapia está limitada por un remodelado arterial excesivaling y restenosis 4. Por el empleo de stents, la ACTP se hizo más eficaz en el tratamiento de lesiones complicadas, lo que permite la revascularización después de una oclusión aguda de vasos 5. Este método disminuye la incidencia de reestenosis intra-stent a menos del 10% 6. Además de estos beneficios, esta terapia de primera elección para la revascularización coronaria lleva también los riesgos que amenazan la vida de la trombosis en el stent y la reestenosis. En la trombosis del stent es causada por un de-endotelización del recipiente, seguido por una adhesión masiva de plaquetas y fibrina en el sitio lesionado. 26% de los pacientes sufren de trombosis en el stent y el 63% muere de infarto de miocardio 7. La restenosis se refiere al proceso de cicatrización de la herida después de la lesión mecánica a la pared del vaso, que implica la hiperplasia neointimal (migración y proliferación de células del músculo liso vascular (CMLV), deposición de la matriz extracelular (ECM), y la remodelacióndel buque. A menudo, una re-intervención invasiva hace necesario dilatate vasos ateroscleróticos severamente estrechadas debido a una trombosis en el stent y la reestenosis. Para prevenir la trombosis en el stent, un tratamiento a largo plazo con fármacos anti-trombóticos es necesario 8. Para evitar la restenosis, la nueva generación de stents liberadores de fármacos eluir agentes antiproliferativos tales como medicamentos inmunosupresores (por ejemplo, sirolimus, everolimus, zotarolimus) y medicamentos contra el cáncer (por ejemplo, paclitaxel) de un recubrimiento de polímero durante varios meses 9,10. A pesar de que estos fármacos disminuyen la formación de la neoíntima y la reestenosis, que mantienen un alto riesgo de trombosis en el stent mediante la inhibición de la re-endotelización. Después de una lesión arterial, el mantenimiento de el compartimiento endotelial es esencial para prevenir las complicaciones trombóticas. En condiciones fisiológicas, el endotelio humano tiene un índice de rotación de 11. En patologíaogical condiciones, sin embargo, la integridad endotelial se deteriora, por lo que se requiere una rápida recuperación por rodea a las células endoteliales maduras y células progenitoras endoteliales (CPE) que circulan 12,13. El estudio de estos complejos mecanismos moleculares en los animales más grandes 14-16 o en la arteria aorta del ratón es un procedimiento muy difícil, que ofrece datos limitados 17-19. Para probar la eficacia del stent recubrimientos novedosos para reducir la trombosis en el stent y la reestenosis nuevos modelos son imprescindibles. Nitinol representa la plataforma ideal para stents debido a su &quot;alta elasticidad, efecto de memoria de forma y buena tolerancia en los pacientes, que se utiliza con éxito como los stents convencionales en uso clínico. Esta aleación hizo posible la creación de un stent en miniatura con un diámetro exterior de 500 micras, que se pueden revestir 20 y se implantan en la arteria carótida de los ratones. El desarrollo de un stent de nitinol en miniatura para el ratón carteria arotid, permite el estudio de los mecanismos moleculares precisos inducida por la implantación del stent y ofrece la posibilidad de comprobar de forma rápida y eficiente los efectos de los diferentes recubrimientos de medicamentos para prevenir la reestenosis. Por otra parte, la existencia de diferentes cepas de ratones knock-out representa una gran ventaja para aclarar el papel de las diferentes moléculas involucradas en el crecimiento de la neoíntima y trombosis en el stent.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitinol-stents (self-made from nitinol-struts)</td>
			<td>Fort Wayne Metals, Castlebar, Ireland NiTi#1, superelastic, straight annealed, light oxide, diameter 500 &mu;m</td>
			<td>custom-made product</td>
			<td>Institute for Textile Technology and Mechanical Engineering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicon tube</td>
			<td>IFK Isofluor, Germany</td>
			<td>custom-made product</td>
			<td>diameter 500 &mu;m, section thickness 100 &mu;m, polytetrafluorethylene catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ/X9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>standard tip curved 0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 10%</td>
			<td>CEVA, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Medistar, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthene</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Aesculap, Germany</td>
			<td>OC 498 R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/0 Silk</td>
			<td>Seraflex</td>
			<td>IC 108000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/0 Silk</td>
			<td>Seraflex</td>
			<td>IC 1005171Z</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guide-wire</td>
			<td>Abbott Vascular</td>
			<td>1001782-HC</td>
			<td>0.014-inch angioplastie guide-wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Michel suture clips</td>
			<td>Aesculap, Germany</td>
			<td>BN507R</td>
			<td>7.5 x 1.75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Michel Forcep</td>
			<td>Aesculap, Germany</td>
			<td>BN730R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine model of stent implantation in the carotid artery for the study of restenosis

A pesar de los considerables progresos realizados en el desarrollo del stent en las últimas décadas, las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la principal causa de muerte en los países occidentales. Además de los beneficios que ofrece el desarrollo de los diferentes stents liberadores de fármacos, la revascularización coronaria lleva también los riesgos que amenazan la vida de la trombosis en el stent y la reestenosis. La investigación sobre nuevas estrategias terapéuticas se ve afectada por la falta de métodos adecuados para el estudio de la implantación del stent y los procesos de reestenosis. Aquí se describe un procedimiento rápido y accesible de la implantación de un stent en la arteria carótida del ratón, que ofrece la posibilidad de estudiar de una forma sencilla los mecanismos moleculares de remodelado vascular y los efectos de las diferentes capas de la droga.

<ol><li> La implantación de un stent de nitinol en miniatura en la arteria carótida izquierda del ratón toma 25-30 minutos y muestra una tasa de mortalidad del 10% principalmente debido a los daños del buque durante la intervención. Una mejor tasa de supervivencia se observó en ratones que tienen un peso de más de 25 g en el momento de la implantación del stent (tasa de mortalidad de 5%). Por lo tanto, se optó por la implantación de los ratones con un peso de entre 25 a 27 g. Después de la cirugía, los ratones se recuperan de la anestesia en 2-5 minutos y sin impedimentos físicos, como por ejemplo, la parálisis, se observan. Micro-Computer Tomography (micro-TC) realizó una semana después de la implantación del stent mostró que los stents no están dislocados por el flujo sanguíneo (Figura 1C). Desafortunadamente, el análisis de la formación de neoíntima en estas imágenes no es posible debido a los artefactos de metal-derivados (Figura 1D, 1E). </li><li> No se observó ningún buque o daños endoteliales de superficie sin endoprótesis de la nave, inmediatamente debajo del stent, Como detectable por histológico (Figura 2A) y por tinción específica de endotelio (Figura 2B, anti-ratón CD31 de anticuerpos). Para una mejor visión de conjunto, la sección fue escaneada utilizando un microscopio de escaneo láser de dos fotones (Figura 2B, 2C). </li><li> En el recipiente de stent, se detecta una dilatación permanente de 15% (relación de stent: arteria, 1,15:1) por los ratones con un peso entre 25-27 g. Formación de la neoíntima y la formación de trombo-pueden ser analizados por tinciones histológicas clásicas (por ejemplo, hematoxilina-eosina, Giemsa, Movat, Azul Toluidina, Masson Trichrom-Goldner, la Figura 3A, 3B). Dado que la lámina externa e interna no son visibles más, tamaño de la placa se calculó como la diferencia entre el exterior y las áreas luminales (media área de la placa: 234.566 ± 3.315 m 2, la media de área luminal: 12.036 ± 2.662 m 2). También se midió la circunferencia externa (media: 1.799 ± 14 micras). Para el análisis de lacomposición celular, las secciones deben ser deplastified y se tiñeron con marcadores específicos. Para la re-endotelización, se utilizó un anticuerpo anti-CD31 conjugado con Cy3 y para la proliferación celular del músculo liso un anticuerpo anti-SMA conjugado con FITC (Figura 3C). Reendotelización se calculó como porcentaje del CD-31 positivas teñidas a la superficie luminal total (media: 23,07 ± 3,14%), una semana después de la implantación del stent. </li></ol> Por supuesto, un número ilimitado de tinción específica es posible, dependiendo de la experiencia de cada uno de los laboratorios. Análisis de la cadena pesada de la miosina, para una mejor caracterización de las SMC, sino también el análisis de las células infiltradas (monocitos, linfocitos), o tinciones para diferentes citoquinas inflamatorias también se puede realizar, dependiendo del objetivo del estudio. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50233/50233fig1highres.jpg" sr<html> c = &quot;/ files/ftp_upload/50233/50233fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Esquema general del procedimiento quirúrgico (A). El flujo de sangre se interrumpe por la unión de los nudos en la arteria carótida interna y la arteria carótida externa proximal con firmeza, así como tirando del nudo que rodea la arteria carótida común. El tubo de silicona que contiene el stent se introduce en la arteria carótida externa a través de una pequeña incisión en la arteria carótida externa. Después de que el stent alcanza la posición deseada, el tubo de silicona se tira hacia atrás sobre la guía-alambre y permite la expansión de memoria de forma del stent. Imágenes micro-CT, que indican la posición del stent una semana después de la implantación quirúrgica (B). Debido a los artefactos materiales derivados, un análisis de crecimiento de la neoíntima no es posible (C, D). 3fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50233/50233fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Área sin endoprótesis de la embarcación no se ve afectado por el procedimiento quirúrgico, tal como se muestra por Toluidina azul (A) y tinción con CD31 endotelial específico (B, C). <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50233/50233fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50233/50233fig3.jpg" /> Figura 3. Análisis de la placa puede ser realizada por tinciones histológicas clásicas (por ejemplo, Masson Trichrom-Goldner) (A). Los trombo organizado pueden ser detectados por deposiciones de fibrina teñido de negro dentro de la neoíntima, en algunos casos se observa una oclusión completa del vaso (B). Re-endotelización (Cy3, rojo) o la proliferación de células del músculo liso (FITC, verde) se detectó por tinción de inmunofluorescencia doble utilizando marcadores específicos.Contratinción se realizó con 4 &#39;,6-diamino-2-fenilindol (DAPI, azul) (C). Notamos un reendotelización completa de los puntales del stent (izquierda, flecha doble) en comparación con un reendotelización incompleted luminal (derecha, flecha simple).

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A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Se describe un modelo de implantación de un stent en la arteria carótida del ratón. En comparación con otros métodos similares, este procedimiento es muy rápido, simple y accesible, que ofrece la posibilidad de estudiar de una manera conveniente la reacción de la pared vascular a diferentes stents liberadores de fármacos y los mecanismos moleculares de la restenosis.

Un modelo murino de la implantación de un stent en la arteria carótida para el Estudio de la reestenosis

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

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Research

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Medicine

25.2K vistas.  RWTH Aachen University. Se describe un modelo de implantación de un stent en la arteria carótida del ratón. En comparación con otros métodos similares, este procedimiento es muy rápido, simple y accesible, que ofrece la posibilidad de estudiar de una manera conveniente la reacción de la pared vascular a diferentes stents liberadores de fármacos y los mecanismos moleculares de la restenosis.

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Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

Biomarcadores en un modelo animal para Revelar correlatos neurales, hematológicas y conductuales de estrés postraumático

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Investigación

Medicina

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel stenting are crucial for translational approaches1,2.
The commonly used animal models include mice, rats, rabbits, and pigs3-5. However, the translation of these models into clinical settings remains difficult, since those biological processes are already studied in animal vessels but never performed before in human research models6,7. In this video we demonstrate a new humanized model to overcome this translational gap. The shown procedure is reproducible, easy, and fast to perform and is suitable to study the development of intimal hyperplasia and the applicability of diverse stents.
This video shows how to perform the stent technique in human vessels followed by transplantation into immunodeficient rats, and identifies the origin of proliferating cells as human.

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

This video shows a model to study the development of intimal hyperplasia after stent deployment using a human vessel (IMA) in an immunodeficient rat model.

Humanos mamaria interna arteria (IMA) de Trasplantes y colocación de un stent: un modelo humano para estudiar el desarrollo de la reestenosis intra-stent

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in peripheral arterial bypass surgery as well as in arteriovenous fistulas.1-5 The experimental procedure of vein graft interposition in the common carotid artery by using the cuff-technique has been applied in several research projects to examine the aetiology of neointimal hyperplasia and therapeutic options to address it. 6-8 The cuff prevents vessel anastomotic remodeling and induces turbulence within the graft and thereby the development of neointimal hyperplasia.
Using the superior caval vein graft is an established small-animal model for venous arterialization experiment.9-11 This current protocol refers to an established jugular vein graft interposition technique first described by Zou et al., 9 as well as others.12-14 Nevertheless, these cited small animal protocols are complicated.
To simplify the procedure and to minimize the number of experimental animals needed, a detailed operation protocol by video training is presented. This video should help the novice surgeon to learn both the cuff-technique and the vein graft interposition. Hereby, the right external jugular vein was grafted in cuff-technique in the common carotid artery of 21 female Sprague Dawley rats categorized in three equal groups that were sacrificed on day 21, 42 and 84, respectively. Notably, no donor animals were needed, because auto-transplantations were performed. The survival rate was 100 % at the time point of sacrifice. In addition, the graft patency rate was 60 % for the first 10 operated animals and 82 % for the remaining 11 animals. The blood flow at the time of sacrifice was 8&plusmn;3 ml/min. In conclusion, this surgical protocol considerably simplifies, optimizes and standardizes this complicated procedure. It gives novice surgeons easy, step-by-step instruction, explaining possible pitfalls, thereby helping them to gain expertise fast and avoid useless sacrifice of experimental animals.

Neointimal hyperplasia is the primary cause of stenosis in arterialized veins. We propose a new protocol whereby the right external jugular vein is grafted using the cuff technique in the common carotid artery of Sprague Dawley rats. The survival rate was 100 % at the time point of sacrifice.

La formación de una sofisticada técnica de microcirugía: La interposición de injerto de la vena yugular externa en la arteria carótida común en ratas

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Un modelo murino de isquemia-reperfusión miocárdica lesión a través de la ligadura de la arteria descendente anterior

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Infusiones de la arteria carótida para farmacocinéticas y farmacodinámicas Análisis de taxanos en ratones

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. While these therapies lead to the rapid restoration of blood flow, these technologies remain limited by restenosis in the case of bare metal stents and angioplasty, or reduced healing and possibly enhanced risk of thrombosis in the case of drug eluting stents. A key pathophysiological mechanism in the formation of restenosis is intimal hyperplasia caused by the activation of vascular smooth muscle cells and inflammation due to arterial stretch and injury. Surgeries that induce arterial injury in genetically modified mice are useful for the mechanistic study of the vascular response to injury but are often technically challenging to perform in mouse models due to the their small size and lack of appropriate sized devices. We describe two approaches for a surgical technique that induces endothelial denudation and arterial stretch in the femoral artery of mice to produce robust neointimal hyperplasia. The first approach creates an arteriotomy in the muscular branch of the femoral artery to obtain vascular access. Following wire injury this arterial branch is ligated to close the arteriotomy. A second approach creates an arteriotomy in the main femoral artery that is later closed through localized cautery. This method allows for vascular access through a larger vessel and, consequently, provides a less technically demanding procedure that can be used in smaller mice. Following either method of arterial injury, a degradable drug delivery patch can be placed over or around the injured artery to deliver therapeutic agents.

We describe a surgical technique that produces wire injury in the femoral artery of mice to induce neointimal hyperplasia to serve as a model testing system for the perivascular delivery of therapeutic compounds for the inhibition of restenosis.

Modelo murino de la arteria femoral Lesiones Alambre con implantación de un perivascular Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

A Murine Model of Arterial Restenosis: Technical Aspects of Femoral Wire Injury

Cardiovascular disease caused by atherosclerosis is the leading cause of death in the developed world. Narrowing of the vessel lumen, due to atherosclerotic plaque development or the rupturing of established plaques, interrupts normal blood flow leading to various morbidities such as myocardial infarction and stroke. In the clinic endovascular procedures such as angioplasty are commonly performed to reopen the lumen. However, these treatments inevitably damage the vessel wall as well as the vascular endothelium, triggering an excessive healing response and the development of a neointimal plaque that extends into the lumen causing vessel restenosis (re-narrowing). Restenosis remains a major cause of failure of endovascular treatments for atherosclerosis. Thus, preclinical animal models of restenosis are vitally important for investigating the pathophysiological mechanisms as well as translational approaches to vascular interventions. Among several murine experimental models, femoral artery wire injury is widely accepted as the most suitable for studies of post-angioplasty restenosis because it closely resembles the angioplasty procedure that injures both endothelium and vessel wall. However, many researchers have difficulty utilizing this model due to its high degree of technical difficulty. This is primarily because a metal wire needs to be inserted into the femoral artery, which is approximately three times thinner than the wire, to generate sufficient injury to induce prominent neointima. Here, we describe the essential surgical details to effectively overcome the major technical difficulties of this model. By following the presented procedures, performing the mouse femoral artery wire injury becomes easier. Once familiarized, the whole procedure can be completed within 20 min.

The mouse femoral artery wire injury model of restenosis is technically challenging. In this protocol we show the key technical details essential for successfully performing wire injury to induce consistent&#160;neointima for studies of restenosis.

Un modelo murino de restenosis arterial: Aspectos Técnicos del femoral Lesiones alambre

Cardiovascular disease caused by atherosclerosis is the leading cause of death in the developed world. Narrowing of the vessel lumen, due to ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, obesity and diabetes. Accordingly, when evaluating therapies for stroke in animals, it is important to select a model with excellent face validity. Ischemic stroke accounts for 80% of all strokes, and the majority of these occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), often inducing infarcts that affect the sensorimotor cortex, causing persistent plegia or paresis on the contralateral side of the body. We demonstrate in this video a method for producing ischemic stroke in elderly rats, which causes sustained sensorimotor disability and substantial cortical infarcts. Specifically, we induce permanent distal middle cerebral artery occlusion (MCAO) in elderly female rats by using diathermy forceps to occlude a short segment of this artery. The carotid artery on the ipsilateral side to the lesion was then permanently occluded and the contralateral carotid artery was transiently occluded for 60 min. We measure the infarct size using structural T2-weighted magnetic resonance imaging (MRI) at 24 hr and 8 weeks after stroke. In this study, the mean infarct volume was 4.5% &#177; 2.0% (standard deviation) of the ipsilateral hemisphere at 24 hr (corrected for brain swelling using Gerriet&#8217;s equation, n = 5). This model is feasible and clinically relevant as it permits the induction of sustained sensorimotor deficits, which is important for the elucidation of pathophysiological mechanisms and novel treatments.

Here we present a protocol to produce permanent distal middle cerebral artery occlusion in elderly female rats with simultaneous occlusion of the carotid arteries to generate large cortical infarcts and sustained deficits. We show confirmation of the lesion size using structural MRI at 24 hr and 8 weeks after stroke.

Realización Permanente distal cerebral media carótida común con oclusión de la arteria en ratas de edad avanzada para el Estudio de la isquemia cortical con sostenida de la discapacidad

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves focal endothelial-selective transgenesis, thereby allowing an investigator to determine the biological roles of endothelial-expressed transgenes and to quantify the in vivo transcriptional activity of DNA sequences in large artery endothelial cells. The method uses surgical isolation of rabbit common carotid arteries and an arteriotomy to deliver a transgene-expressing viral vector into the arterial lumen. A short incubation period of the vector in the lumen, with subsequent aspiration of the lumen contents, is sufficient to achieve efficient and durable expression of the transgene in the endothelium, with no detectable transduction or expression outside of the isolated arterial segment. The method allows assessment of the biological activities of transgene products both in normal arteries and in models of human vascular disease, while avoiding systemic effects that could be caused either by targeting gene delivery to other sites (e.g. the liver) or by the alternative approach of delivering genetic constructs to the endothelium by germ line transgenesis. Application of the method is limited by the need for a skilled surgeon and anesthetist, a well-equipped operating room, the costs of purchasing and housing rabbits, and the need for expertise in gene-transfer vector construction and use. Results obtained with this method include: transgene-related alterations in arterial structure, cellularity, extracellular matrix, or vasomotor function; increases or reductions in arterial inflammation; alterations in vascular cell apoptosis; and progression, retardation, or regression of diseases such as intimal hyperplasia or atherosclerosis. The method also allows measurement of the ability of native and synthetic DNA regulatory sequences to alter transgene expression in endothelial cells, providing results that include: levels of transgene mRNA, levels of transgene protein, and levels of transgene enzymatic activity.

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

This method is to introduce a transgene into the endothelium of rabbit carotid arteries. Introduction of the transgene allows the assessment of the biological role of the transgene product either in normal arteries or disease models. The method is also useful for measuring activity of DNA regulatory sequences.

En Vivo Transferencia génica en el endotelio de la arteria carótida común conejo

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, intimal hyperplasia, and atherosclerosis. The goal of this article is to demonstrate a method for placing bilateral venous interposition grafts in a rabbit, then transducing the grafts with a gene transfer vector that achieves durable transgene expression. The method allows the investigation of the biological roles of genes and their protein products in normal vein graft homeostasis. It also allows the testing of transgenes for the activities that could prevent vein graft failure, e.g., whether the expression of a transgene prevents the neointimal growth, reduces the vascular inflammation, or reduces atherosclerosis in rabbits fed with a high-fat diet. During an initial survival surgery, the segments of right and left external jugular vein are excised and placed bilaterally as reversed end-to-side common carotid artery interposition grafts. During a second survival surgery, performed 28 days later, each of the grafts is isolated from the circulation with vascular clips and the lumens are filled (via an arteriotomy) with a solution containing a helper-dependent adenoviral (HDAd) vector. After a 20-min incubation, the vector solution is aspirated, the arteriotomy is repaired, and flow is restored. The veins are harvested at time points dictated by individual experimental protocols. The 28-day delay between the graft placement and the transduction is necessary to ensure the adaptation of the vein graft to the arterial circulation. This adaptation avoids rapid loss of transgene expression that occurs in vein grafts transduced before or immediately after grafting. The method is unique in its ability to achieve durable, stable transgene expression in grafted veins. Compared to other large animal vein graft models, rabbits have advantages of low cost and easy handling. Compared to rodent vein graft models, rabbits have larger and easier-to-manipulate blood vessels that provide abundant tissue for analysis.

This method describes the placement of interposition vein grafts in rabbits, the transduction of the grafts, and the achievement of durable transgene expression. This allows the investigation of physiological and pathological roles of transgenes and their protein products in grafted veins, and testing of gene therapies for vein graft disease.

Un modelo de conejo de expresión del transgen Durable en la vena yugular a los injertos de interposición de la arteria carótida común

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...