Esta obra fue financiada en parte con fondos del Institut Pasteur y por subvenciones de la Ligue nationale contre le Cancer (subvenciones R05/75-129 y RS07/75-75), la Association pour la Recherche sur le Cancer (becas ARC A09 / 1/5031 y 4867) y la Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 y 026 01 ANR09 MIEN). MM fue un beneficiario de una beca MENRT.

1. Levadura de dos híbridos Screenings <ol><li> Haga las siguientes soluciones requeridas: <ol><li> Fuera de la gota sintético completo (SD): se disuelven 26,7 g de base mínima SD con glucosa en 1 L de agua. Añadir 2 g de mezcla de aminoácidos preparada como sigue: 2 g de hemisulfato de adenina, 2 g Arginina HCl, HCl 2 g Histidina, Isoleucina 2 g, 4 g Leucina, Lisina HCl 2 g, 2 g Metionina, Fenilalanina 3 g, 2 g de L -serina, 2 g de L-Treonina, Triptófano 3 g, 2 g de tirosina, 1,2 g de uracilo, 9 g Valina. </li><li> Gota selectivo Salida SD-L/-W/-H: SD que contiene cada aminoácidos esenciales, excepto los especificados (-L-leucina,-W:-triptófano;-H:-histidina). </li><li> YPGLU: Por 1 L, peso 10 g de extracto de levadura, 10 g de Bacto peptona y 20 g de glucosa. Completo con 25 g Bacto agar de medio sólido. </li><li> YCM: Igual que YPGLU, pero el pH se ajustó a 4,5. </li></ol></li><li> El apareamiento y la difusión <ol><li> Use alícuotas congeladas de pre-transformed cepa de levadura Y187 (tipo de apareamiento α) que contiene una biblioteca de ADNc clonado en pACT2. Comprobar la viabilidad celular en placas diluciones seriadas en placas SD-L. </li><li> Clonar la ORF patógeno en pGBKT7 vector, y transformar el plásmido recombinante utilizando un procedimiento estándar en la cepa de levadura AH109 (un tipo de apareamiento). </li><li> Spread pGBKT7-transformó AH109 levaduras en placas SD-W. Incubar al menos dos días 30 ° C en un incubador humidificado. Las placas pueden ser almacenadas a 4 ° C hasta que el cribado de dos híbridos. </li><li> Use 3-aminotriazol (3-AT), un inhibidor competitivo de la enzima HIS3, para contrarrestar el potencial de auto-transactivación del gen informador HIS3 por las proteínas de los agentes patógenos. Realizar una prueba de la activación automática mediante la determinación de la concentración de 3-AT, lo que impide el crecimiento de la levadura pGBKT7-transformado en placas SD-W/-H. </li><li> Seed 30 ml de SD-W con pocas colonias de pGBKT7 transformada AH109. Incubar 30 horas a 30 ° C con rotación. </li><li> Seed 200 ml de SD-W con el 30 mlAH109 de las culturas. Incubar con rotación alrededor de 20 horas a 30 ° C. </li><li> Incubar descongelado biblioteca de ADNc-Y187 transformada en 20 ml YPGLU, incubar 10 min a 30 ° C con rotación. </li><li> Centrifugar un volumen de pGBKT7-transformado AH109 cultura correspondiente a una cantidad equivalente de células viables de levadura Y187 durante 5 min a 3500 rpm a 20 ° C. Retirar con cuidado el sobrenadante y se resuspende el precipitado en 10 ml YPGLU. </li><li> Mezclar la levadura AH109 resuspendido con Y187 biblioteca que contiene. La transferencia en un tubo de 50 ml. Se centrifuga durante 5 min a 3500 rpm a 20 ° C, retirar cuidadosamente el sobrenadante (frágil sedimento). </li><li> Resuspender el pellet en YPGLU conseguir un total de 1,5 ml. </li><li> Levadura Spread a 3 YCM-agar placas de 150 mm, 0,5 ml / placa. Incubar 4,5 horas a 30 ° C. </li><li> Recoger levadura acoplado de placas YCM por raspado con un vaso en el rastrillo de 10 ml de SD-L/-W/-H. Lavar las placas dos veces con 5 ml de medio de SD-L/-W/-H y piscina. </li><li> Centrifugar 5 min a 3500 rpm, 20° C. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento de levadura en 5 ml de medio SD-L/-W/-H. </li><li> Extienda la levadura acoplado a 10 placas (0,5 ml / placa) de Agar SD-L/-W/-H complementado con la concentración adecuada de 3-aminotriazol (3-AT) obtenido en la prueba de activación automática. Incubar a 30 ° C en un ambiente humidificado durante 6-10 días. </li><li> Determinar la tasa de diploide (2n) con el fin de evaluar la eficiencia de acoplamiento mediante la difusión de 250 l de diluciones en serie (10 -4 a 10 -6) de la suspensión de levadura se aparearon en placas SD-L/-W. Incubar las placas a 30 ° C durante dos días. Recuento de las colonias cultivadas en SD-L/-W, y deducir el número total diploide presente en el volumen inicial de la levadura acoplado. Señalar este número diploide de levadura número biblioteca que contiene viable para calcular la tasa de diploide. Se debe oscilar alrededor de 10-25%. </li><li> 6-10 días después de la incubación a 30 ° C, recoger las colonias de levadura se aparearon en SD-L/-W/-H fresca + 3-AT placas. [Sugerencia: Para la levadura en un esquema de 8carriles de 12 pozos que reproducen una placa de 96 pocillos de manera que será más fácil después para la secuenciación]. Deje colonias de levaduras crecen durante 4-5 días a 30 ° C en un ambiente humidificado. </li></ol></li><li> La detección de his3 clones positivos por PCR y secuenciación El objetivo es para amplificar por PCR la ORF contenida en los pACT2 vectores de colonias de levaduras cultivadas en placas de SD-L/-H/-W selectivos. <ol><li> Coloque una placa de PCR 96 en el hielo. </li><li> Para lisar las células de levadura, añadir 50 l por pocillo de una solución 20T zimolasa (2,5 mg / ml en 10 mM de tampón HEPES de pH 7,7). </li><li> Resuspender una colonia por pocillo. </li><li> Incubar 15 min a 37 ° C y 15 min a 95 ° C. </li><li> Ponga la placa posterior en el hielo. Añadir 50 l de agua destilada por pocillo. Mezclar bien con la pipeta hacia arriba y hacia abajo. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 3500 rpm y 4 ° C. </li><li> 10 l amplificar por PCR para detectar un inserto usando cebadores de recocido ambos lados de la ORF derivados de cDNA en vectores pACT2. El protocolo es gado para la amplificación de 96 colonias de levadura lisadas con el ExTaq polimerasa. Preparar la siguiente mezcla: 525 l 10X tampón ExTaq, 420 l de la mezcla dNTP (2,5 mM), 10,5 l Cebador directo (1 g / l), 10,5 cebador inverso l (1 g / l), 31,5 l ExTaq (5 U / l ) y 3202,5 ​​l H 2 0. Distribuir 40 l de la mezcla por pocillo en una placa de PCR de 96. Añadir 10 l de levadura lisada por pocillo. Realizar la amplificación de la siguiente manera: 94 ° C durante 3 min, luego 35 ciclos a 94 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 4 min, y al final con 72 ° C durante 7 min. Ejecutar 3 l de los productos de PCR en un gel de agarosa al 1,2% para detectar los clones positivos por PCR. Tenga en cuenta que el uso de pre-molde 96 también se recomienda geles de agarosa. [Sugerencia: placa puede ser almacenado a -20 ° C durante unos meses y volver a utilizar para el nuevo PCR] </li><li> Secuencia de los fragmentos de PCR amplificados a partir de aislados HIS3 clones positivos. Realizar un análisis BLAST para identificar celular ORF. Alineaciones de baja confianza (E valor ygt; 10 -10, la identidad &lt;80%, longitud de péptido &lt;20 aminoácidos) se descartan, así como frameshifted y prematuro codón de parada que contiene secuencias. </li></ol></li></ol> 2. Edificio Matriz para HT-GPCA HT-GPCA es un ensayo basado en células de mamífero que ambas proteínas de patógenos y de acogida se expresan transitoriamente fusionado con fragmentos complementarios de la división Gaussia princeps luciferasa. Tras la interacción de los socios, esta enzima se reconstituye lo que permite la medida de su actividad enzimática. La intensidad de la interacción es por lo tanto deducir de una Relación de Luminiscencia normalizado (véase más adelante y la Figura 1) <ol start="4"><li> Selección de los socios de células huésped <ol><li> Seleccione las proteínas que se identifican más de tres veces en los exámenes Y2H para una validación adicional de las células de mamíferos para aumentar la confianza de conjunto de datos 9. </li><li> Agregar socios que interactúan conocidas de las proteínas de patógenos como positiVE controles. </li></ol></li><li> Traslado en vectores compatibles HT-GPCA <ol><li> Clonar cada patógeno proteína ORF en un vector pSPICA-N2 para generar proteínas de patógenos con los aminoácidos 110-185 de la princeps Gaussia humanizados luciferasa fusionado en su extremo N-terminal (GL2-patógeno fusiones de proteínas). </li><li> Amplificar por PCR proteína celular ORF directamente a partir de los clones positivos Y2H o desde otros recursos de ORF (ORFeome humano <a href="http://horfdb.dfci.harvard.edu/" target="_blank">http://horfdb.dfci.harvard.edu/</a> ) y transferir en vectores pSPICA-N1 para generar proteínas fusionadas en el extremo N-terminal con los 18 aminoácidos a 109 de humanizado Gaussia princeps luciferasa (fusiones de proteínas GL1-huésped). [Sugerencia: Para la clonación a gran escala, se recomienda el sistema de clonación Gateway. En ese caso, para la amplificación por PCR, utilizar cebadores diseñados para contener sitios compatibles de puerta de enlace]. </li><li> Secuencia de todos los vectores de expresión. Las secuencias de la pSPICA-N1 y N2-pSPICAse pueden encontrar en la referencia 8. </li></ol></li></ol> Tenga en cuenta que construcciones de plásmidos pueden ser invertidas, es decir, las proteínas de patógenos en pSPICA-N1 y proteínas del huésped en pSPICA-N2. 3. High-Throughput Gaussia princeps luciferasa basado en ensayo de complementación de proteínas (HT-GPCA) <ol start="6"><li> Transfección celular <ol><li> Seed células 293T en 350.000 células / ml de DMEM con 10% de suero bovino fetal (FBS) sin antibióticos. Distribuir 100 l / pocillo en placas de cultivo blancos estériles. No exceder de 10 placas en un solo experimento. Deje que las células crezcan durante 24 horas a 37 ° C con 5% de CO 2. [Consejo:. Dado que los plásmidos pSPICA contienen un origen de SV40, el uso de las células 293T permite su replicación en las células transfectadas y por lo tanto conduce a la sobreexpresión de los dos fragmentos de luciferasa] </li><li> El día siguiente, las células transfectar utilizando cualquier protocolo de transfección adecuado. Tenga en cuenta que para ciertos reactivos de transfección, la number de células sembradas puede tener que ser adaptada. Use 100 ng por pocillo de tanto el patógeno y anfitrión ORF construcciones de plásmidos. Co-transfectar 10 ng por pocillo de una de CMV-Firefly plásmido para normalizar la eficiencia de transfección de luciferasa. Cada punto se analizó por triplicado. [Consejo:. Mezclas de ADN se pueden realizar el día antes de la transfección y se almacenaron a -20 ° C con juntas adhesivas] </li><li> Transferir la mezcla de transfección a las placas de las células 293T cultivadas. Tenga cuidado para depositar suavemente la mezcla de ADN en las células, como 293T no son fuertemente adherente y se desprenden fácilmente de la parte inferior del pozo. Incubar en una incubadora de cultivo celular durante 24-30 horas a 37 ° C con 5% de CO 2. </li></ol></li></ol><ol start="7"><li> La lisis celular y la dosis luciferasa Gaussia <ol><li> Lavar las células con PBS (100 l / pocillo). Añadir 40 l de tampón de lisis 1X de Renilla. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente con agitación. </li><li> Ahorra 10 l de lisados ​​celulares en otra plataforma blancade correo para su posterior dosificación de la actividad luciferasa de luciérnaga. Almacenar a 4 ° C o, alternativamente, a -20 ° C con sellado. </li><li> Medir la actividad Gaussia en los restantes 30μl de lisados ​​de células mediante la adición de 100 l de reactivo de ensayo de luciferasa de Renilla y contando luminiscencia durante 10 s con un luminómetro. Dosis de una placa de 96 tarda aproximadamente media hora. Realizar la medición con extractos de células frescas ya que el almacenamiento de congelación o largo plazo puede afectar la actividad Gaussia interacción mediada. </li></ol></li></ol><ol start="8"><li> Medición de la actividad Firefly <ol><li> Medir la actividad de luciérnaga en el salvado 10 l de lisados ​​de células mediante la adición de 50 l de reactivo de ensayo de luciferasa de luciérnaga y el recuento de luminiscencia durante 10 s. Dosis de una placa de 96 tarda aproximadamente media hora. [Consejo: La dosis de luciferasa de luciérnaga se puede realizar al día siguiente en lisados ​​congelados.] </li></ol></li></ol><ol start="9"><li> Cálculos NLR <ol><li&gt; Para cada interacción, calcular la relación entre la actividad luciferasa Gaussia y la actividad de luciferasa de luciérnaga para obtener un valor de luminiscencia Gaussia normalizado teniendo en cuenta la eficiencia de transfección y la viabilidad celular. Calcular la media de los triplicados. </li><li> Para supervisar la interacción, estimar un Ratio Normalizada luminiscencia (NLR) para cada par patógeno-huésped. Para ello, se divide la actividad de luminiscencia Gaussia normalizada detectada en presencia de ambos patógenos y proteínas del huésped por la suma de las actividades medidas en los pocillos de control (Figura 1 adaptada de la referencia 8). El NLR valor de corte para las interacciones positivas ha sido estimada en alrededor de 3,5 8. </li></ol></li></ol><ol start="10"><li> Análisis de los datos <ol><li> Realizar agrupación jerárquica utilizando el paquete estadístico R. En primer lugar, agrupar los datos NLR en categorías, y luego calcular un dendrograma interacción utilizando el método de ligamiento completo. Visualice estedendrograma con JavaTreeView 10. Calcular la distancia entre la interacción dendrograma y el árbol filogenético utilizando un coeficiente de correlación de Pearson. </li><li> Para generar redes de interacción, seleccione las interacciones positivas del conjunto de datos HT-GPCA y utilizar el software Cytoscape 1. Extraer los grados de las proteínas del huésped y trazar su distribución para acceder a la dinámica local de la red. Redes Huésped-patógeno se pueden superponer a la interactome anfitrión para proporcionar una evaluación del impacto global de las proteínas de patógenos en la red celular del huésped. </li><li> Extraiga el GO (Gene Ontología) términos relacionados con los factores celulares específicos con la base de datos de bioinformática DAVID 12 para evaluar el enriquecimiento funcional del conjunto de datos. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Protoc. 4, 44-57 (2009).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genotype+comparison+of+human+papillomavirus+E2-host+interaction+networks+provides+new+insights+for+e2+molecular+functions.">Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions.</a> PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).</li><li>Neveu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+virus-host+interactomes+with+a+mammalian+high-throughput+protein+complementation+assay+based+on+Gaussia+princeps+luciferase.">Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase.</a> Methods. , (2012).</li><li>Braun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimentally+derived+confidence+score+for+binary+protein-protein+interactions.">An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions.</a> Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Independientemente, la levadura y dos ensayos de interacción de híbridos y de mamíferos, tales como GST pull-down, o LUMIER Mappit, han demostrado ser instrumentos eficaces para la detección de interacciones proteína-proteína, pero se ven limitados por la alta tasa de falsos positivos y falsos negativos interacciones asociadas con estas técnicas 15. Por otra parte, crece la evidencia de que la combinación de métodos ortogonales aumenta la fiabilidad de la interacción obtenido conjunto de datos ...

La creciente cantidad de datos recogidos para generar mapas de interacción proteína-proteína abre perspectivas para entender mejor las infecciones por patógenos. Como comprensión global de las infecciones de patógenos comienza a emerger, que proporciona acceso a la gama de las perturbaciones inducidas por las proteínas de patógenos cuando se conecta el proteoma humano 1. Es de este modo ofrece una manera de comprender cómo patógenos manipulan la maquinaria de la célula huésped. En particular, la asignación de varias redes de interacción virus-huésped reveló que las proteínas virales se dirigen preferentemente proteínas del huésped que son altamente conectados en la red celular (hubs), o que son fundamentales para muchos caminos en una red (proteínas cuellos de botella) 2-4. Estas interacciones permiten que los virus para manipular los procesos celulares importantes, que es fundamental para replicar y producir una progenie infecciosa. Mapeo de interacciones comparativo se llevó a cabo recientemente sobre los virus relacionados con el objetivo de extraer información relativa apatogénesis 4. Por otra parte, los estudios de la interacción huésped-patógeno paisaje se han extendido a muchos patógenos 5. La identificación de factores de células objetivo proporciona información detallada sobre las estrategias utilizadas por los patógenos de infectar las células y permite la detección de posibles marcadores patógenos. La levadura de dos sistema híbrido es el método más popular para identificar las interacciones binarias desde la detección genética es una herramienta eficaz y sensible para la cartografía de alto rendimiento de las interacciones proteína-proteína. El enfoque que aquí se propone mejora aún más proyecciones Y2H individuales mediante la evaluación de una proteína de múltiples variantes de cepas patógenos, proporcionando así acceso a una visión comparativa de patógeno-huésped interacciones proteína-proteína. Por otra parte, una limitación importante de la levadura de dos híbridos se encuentra en una alta tasa de falsos negativos, ya que se recupera aproximadamente el 20% de las interacciones totales 6. Esto implica que las interacciones detectadas con sólo un subconjunto de patogens variantes podrían haber escapado a la detección con los otros. Por lo tanto, los socios individuales emergentes de todas las pruebas de detección de dos híbridos se enfrentan al reto aún más para la interacción con la gama completa de cepas estudiadas, proporcionando interacción de datos comparativos. Desde que se demostró que la combinación de diferentes metodologías aumenta fuertemente la solidez de la interacción proteína-proteína conjuntos de datos 7, esta validación se lleva a cabo en células de mamífero por un ensayo de complementación de proteínas-fragmento recién desarrollada llamada HT-GPCA 8. Este sistema basado en células permite la detección de interacciones de proteínas mediante la complementación de la luciferasa Gaussia princeps dividida y ha sido diseñado para ser compatible con un formato de alto rendimiento. Gracias a su tecnología de luminiscencia con sede y su bajo nivel de ruido de fondo en comparación con otro ensayo basado en la fluorescencia, HT-GPCA muestra sorprendentemente alta sensibilidad. En general, este enfoque constituye un eficienteherramienta para generar un mapeo exhaustivo de interplays huésped-patógeno, lo que representa el primer paso hacia una comprensión global de los secuestros célula huésped.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strains</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal SD base</td>
			<td>US biological</td>
			<td>D9500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>264571000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase</td>
			<td>Seikagaku</td>
			<td>120491</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>31966</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>14190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>15140</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renilla luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2820</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655083</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-wellPCR plates</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4t-i0730/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (30 &deg;C)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &deg;C)</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>Centro XS-LB 960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comparative approach to characterize the landscape of host-pathogen protein-protein interactions

Esfuerzos importantes se reunieron para generar mapas de la red de interacción proteína-proteína a gran escala completa. Esto es fundamental para entender las relaciones patógeno-huésped y se realizó esencialmente mediante cribados genéticos en sistemas de levadura de dos híbridos. La reciente mejora de la detección de la interacción proteína-proteína mediante un ensayo de complementación de fragmento de luciferasa basado en Gaussia ahora ofrece la oportunidad de desarrollar enfoques integradores interactomic comparativos necesarios para comparar rigurosamente perfiles de interacción de proteínas a partir de diferentes variantes de cepas de patógenos contra un conjunto común de factores celulares. Este documento se centra específicamente en la utilidad de la combinación de dos métodos ortogonales para generar proteína-proteína interacción bases de datos: la levadura de dos híbridos (Y2H) y un nuevo ensayo, de alto rendimiento ensayo de complementación proteica princeps Gaussia (HT-GPCA) realizado en células de mamífero. nt &quot;&gt; Una identificación a gran escala de socios celulares de una proteína de patógeno se realiza en el apareamiento basado en proyecciones levadura de dos híbridos de bibliotecas de ADNc utilizando múltiples variantes de cepas de patógenos. Un subconjunto de socios que interactúan seleccionados en una puntuación alta confianza estadística es aún más validado en células de mamíferos para interacciones por pares con todo el conjunto de variantes de proteínas de patógenos utilizando HT-GPCA. Esta combinación de dos métodos complementarios mejora la robustez del conjunto de datos de interacción, y permite la realización de un análisis de la interacción comparativa estrictas. Tales interactómica comparativos constituye una estrategia fiable y potente para descifrar cualquier interplays patógeno-hospedador.

Una de las principales de HT-GPCA radica en su alta sensibilidad, como lo demuestra la evaluación de las tasas de falsos positivos y falsos negativos para la proteína E2 del VPH en la Figura 2 (adaptado de la referencia 13). Para determinar la tasa de falsos negativos, interacciones conocidas de E2 de HPV16 fueron evaluados por HT-GPCA (Figura 2A). Cuatro de cada 18 interacciones no fueron recuperados (que corresponde a una tasa de falsos negativos del 22%). Las interacciones positiva...

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A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Este artículo se centra en la identificación de la interacción de datos de alta confianza entre anfitrión y proteínas de patógenos utilizando una combinación de los dos métodos ortogonales: levadura de dos híbridos seguido de un ensayo de interacción de alto rendimiento en células de mamífero llamado HT-GPCA.

Un enfoque comparativo para caracterizar el paisaje del Huésped-Patógeno interacciones proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.1K vistas.  Institut Pasteur. Este artículo se centra en la identificación de la interacción de datos de alta confianza entre anfitrión y proteínas de patógenos utilizando una combinación de los dos métodos ortogonales: levadura de dos híbridos seguido de un ensayo de interacción de alto rendimiento en células de mamífero llamado HT-GPCA.

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Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to facilitate cross-presentation of chaperoned antigens and elicit innate and adaptive T cell responses. Xenopus skin graft rejection provides an excellent platform to study the ability of gp96 to elicit classical MHC class Ia (class Ia) restricted T cell responses. Additionally, the Xenopus model system also provides an attractive alternative to mice for exploring the ability of gp96 to generate responses against tumors that have down-regulated their class Ia molecules thereby escaping immune surveillance. Recently, we have developed an adoptive cell transfer assay in Xenopus clones using peritoneal leukocytes as antigen presenting cells (APCs), and shown that gp96 can prime CD8 T cell responses in vivo against minor histocompatibility skin antigens as well as against the Xenopus thymic tumor 15/0 that does not express class Ia molecules. We describe here the methodology involved to perform these assays including the elicitation, pulsing and adoptive transfer of peritoneal leukocytes, as well as the skin graft and tumor transplantation assays. Additionally we are also describing the harvesting and separation of peripheral blood leukocytes used for flow cytometry and proliferation assays which allow for further characterization of the effector populations involved in skin rejection and anti-tumor responses.

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

The frog Xenopus laevis provides an attractive alternative non-mammalian model for exploring the ability of heat shock protein such as gp96 to promote antigen-specific CD8 T cell responses. We present methods to study in vivo facilitation of cross-presentation of skin and tumor antigens by gp96.

Comparativo In vivo Estudio de la gp96 adyuvante de la rana Xenopus laevis</em

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to ...

Investigación

Inmunología e Infección

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

El uso de una trampa óptica para el estudio de interacciones huésped-patógeno de imágenes dinámicas de células vivas

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Utilización del modelo de EpiAirway para la caracterización de largo plazo Interacciones Huésped-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Fenómica fagos: enfoques fisiológicos para caracterizar Novela Virales Proteínas

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Retroviral transducción de células T colaboradoras como un enfoque genético para estudiar mecanismos que controlan su diferenciación y función

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Protocolo para Caracterizar los Cambios Morfológicos de<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En respuesta al tratamiento antibiótico

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infección De Larvas De Pez Cebra Con Esporas De Aspergillus Para El Análisis De Las Interacciones Huésped-Patógeno

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin etiquetas para interacciones host-patógenos impulsadas por el descubrimiento

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...