Fosfato de inositol y fosfoinositides son metabolitos que tienen varias funciones reguladoras en eucariotas, incluyendo el control de la expresión génica, tráfico de proteínas, transducción de señales, y el desarrollo celular. Realizan estas funciones reguladoras mediante la unión a proteínas, cambiando así la conformación proteica, la actividad catalítica o las interacciones proteicas. La identificación de proteínas que se unen a fosfato de inositol o fosfoinositides es esencial para entender cómo esos metabolitos realizan su función reguladora.
Este protocolo tiene un flujo de trabajo simple que es sensible, no radioactivo, libre de lisos y utiliza reactivos que están disponibles comercialmente. En este método, una cromatografía terminada con fosfato de inositol biotinilado o fosfoinositides, se utiliza para aislar las proteínas que interactúan, a continuación, se identifican por mancha occidental, o espectrometría de masas. Para las formas de flujo sanguíneo, hacer crecer las células T.brucei a la fase de registro medio en medios HMI-9, complementados con 10%FBS, a 37 grados Celsius, con 5% dióxido de carbono.
Mantenga la densidad celular entre 800.000 y 1,6 millones de células por mililitro. Cuando esté listo, centrifugar las células a 1600 veces G, y a temperatura ambiente durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender suavemente el pellet en 10 mililitros de PBS-G precalentado a 37 grados centígrados para lavar las células.
Centrifugar las células a 1600 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos para completar el lavado. Repita este procedimiento de lavado dos veces más. A continuación, resuspender el pellet en un mililitro de PBS-G.
Transfiera esta suspensión a un tubo de un punto y cinco mililitros, luego centrifugar a 1600 veces G durante cinco minutos. Desechar el sobrenadante, y resuspender el pellet en cero punto cinco mililitros de tampón de lysis, complementado con un cóctel inhibidor de la proteasa de cinco puntos, y un cóctel inhibidor de la fosfatasa X que se ha enfriado previamente en hielo para alcear las células. Centrifugar el lysate a 1400 veces G y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Después de esto recoger el sobrenadante, que contiene las proteínas del parásito extraído, en un nuevo tubo de un punto cinco mililitros para los ensayos de unión. Reserva el 5% del total de lysate para el análisis de manchas occidentales. Recoger 50 microlitros de fosfatos de inositol o fosfoinositides conjugados a cuentas de agarosa, y añadirlos 500 mililitros de tampón de unión.
Centrifugar a 1000 veces G durante un minuto. Deseche el sobrenadante y resusppend en 50 microlitros de tampón de unión para equilibrar las perlas. Utilice perlas no conjugadas como control y utilice perlas con diferentes configuraciones de fosfato, incluidas las formas no fosforiladas, para controlar las interacciones inespecíficas.
A continuación, agregue 50 microlitros de perlas IP o PI al licato celular o a las proteínas purificadas. Mantenga el volumen de cuentas dentro del 10% del total de lysate. Si es necesario, utilice el búfer de enlace para ajustar el volumen de la reacción de enlace.
Incubar la reacción durante una hora o durante la noche a cuatro grados centígrados, mientras gira a las 50 rpm. Después de esto, centrifugar la mezcla a 1000 veces G, y a cuatro grados Celsius durante un minuto. Retire el sobrenadante, y mantenga el pellet, asegurándose de mantener el 5% del sobrenadante para el análisis de manchas occidentales.
A continuación, agregue un mililitro de tampón de lavado y toque o gire el tubo para resuspender la resina. Centrifugar la reacción a 1000 veces G, y a cuatro grados Celsius durante un minuto, y desechar el sobrenadante. Repita este proceso para un total de cinco lavados.
Después de esto, añadir 50 microlitros de 2X Laemmli tampón complementado con 710 milimolar 2-mercaptoetanol a las cuentas. Toque o vórtice para mezclar y diluir las proteínas. A continuación, calienta a 95 grados centígrados durante cinco minutos, y centrifuga a 10.000 veces G durante un minuto.
Recoger el sobrenadante, y congelar el eluido en menos 80 grados Celsius, o proceder al análisis de manchas occidentales. El método presentado aquí se utiliza para analizar la unión de losP mediante la proteína represor-activador 1 del lysate T.brucei, o por proteína recombinante T.brucei repressor-activator protein 1. Como RAP1 carece de dominios de enlace PI canónicos, los ensayos vinculantes se realizan con PI que no son fosforilados, o que se fosforilan en diferentes posiciones del anillo de inositol, y con cuentas de agarosa no conjugadas.
El análisis occidental muestra que rap1 se une preferentemente a las cuentas PI(3, 4, 5)P3, pero que también se une en menor medida a las perlas PI(4, 5)P2. Sin embargo, no se une a ningún otroP o perlas de agarosa. Para comprobar si RAP1 se une directamente a los rendimientos, se expresa y purifica una proteína RAP1 recombinante 6XHis etiquetada terminalmente con etiqueta C y purificada a la homogeneidad de E. coli.
La hinchazón occidental muestra que el aumento de la concentración de PI(3, 4, 5)P3, pero no PI(4, 5)P2, inhibe la interacción de RAP1 recombinante con cuentas PI(3, 4, 5)P3. La adición de la enzima PIP5Pase purificada de T.brucei a la reacción restaurada PI(3, 4, 5)P3 unión por RAP recombinante1. Esto se debe a la desfosforilación PIP5Pase de PI libre(3, 4, 5)P3, y por lo tanto indica que el patrón de fosforilación de este metabolito es esencial para nuestra unión RAP1.
Las proteínas T.brucei que se unen a Ins(1, 4, 5)P3 se identifican entonces mediante cromatografía de afinidad seguida de espectrometría de masas. El análisis SDS-PAGE muestra el enriquecimiento en proteínas eluidas de las perlas Ins(1, 4, 5)P3, en comparación con las proteínas eluidas de las cuentas de agarosa de control. El análisis de espectrometría de masas de las proteínas eluidas identificó más de 250 proteínas de las cuales 84 se enriquecieron con perlas Ins(1, 4, 5)P3, en comparación con las perlas de control.
El enriquecimiento de proteínas unidas a Ins(1, 4, 5)P3, en comparación con las perlas de control, se correlaciona con la señal proteica detectada por SDS-PAGE. Un paso crítico en este protocolo es el uso de controles adecuados, para discriminar específicamente de interacciones no específicas. Recomendamos el uso de cuentas de agarosa no conjugadas, y cuentas conjugadas con fosfato de inositol o fosfoinositides, utilizando varias configuraciones de fosfato, incluyendo formas no fosforiladas.
Este método se puede aplicar a otros parásitos protozoarios unicelulares, como Trypanosoma cruzi, leishmania o plasmodium. También se puede adaptar fácilmente a otros organismos, incluyendo levaduras o células de mamíferos. Este método se puede acoplar a espectrometría de masas cuantitativa, como SILAC, para identificar interacciones dinámicas de proteínas con fosfato de inositol o fosfoinostidos.
In también se puede combinar con fraccionamiento subcelular, para identificar proteínas específicas de organelo que se unen a estos metabolitos. Este enfoque ha ayudado a identificar las proteínas que se unen a fosfato de inositol y fosfoinositides en T.brucei, células de mamíferos, y levadura. Ha ayudado a identificar nuevos dominios proteicos que se unen a los fosfoinositides.
Ha allanado el camino para entender la función reguladora de estos metabolitos, su papel en la expresión génica, el desarrollo celular y la transducción de señales en eucariotas. Algunos de los reactivos de este protocolo son tóxicos o inflamables. Utilice equipo de protección personal y, cuando sea necesario, trabaje en una campana de humos.
