Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association Predoctoral Fellowship 788808-41910, el NIH NINDS-NS-066 001 y NS-055 832, y el Centro de Investigación de Audiencia NIH beca de formación 1T32DC010775-01.

1. Primeros pasos: Instrumentos quirúrgicos requeridos Vea la Figura 4 <ol><li> Taladro dental (Kavo Dental Equipment, modelo: UMXL-TM), taladro de 2 bits, y un taladro de 3 bits </li><li> Dos agujas hipodérmicas de calibre 30 ~ </li><li> Serrated pinzas, punta curvada opcional (puede ser útil, pero no esencial) </li><li> Dos pinzas de punta fina </li><li> cortador de alambre </li><li> Hilo de sutura </li><li> Micro tijeras </li></ol> 2. Creación de la ventana quirúrgica <ol><li> Anestesia: Los procedimientos están en conformidad con las directrices del NIH y han sido aprobados por la UC Irvine Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Los sujetos experimentales son 295 a 400 g de ratas macho Sprague Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, EE.UU.) y el siguiente procedimiento de anestesia se debe utilizar: <ol><li> Se inyecta por vía intraperitoneal rata con un bolo de pentobarbital sódico (55 mg / kg de peso corporal) seguido por una inyección intramuscular de atropina (0,05 mg / kg, de peso corporal) en el hind pierna, y se administró 3,0 cc de 5% de dextrosa en agua por vía subcutánea. </li><li> Suplemento pentobarbital de sodio (27,5 mg / kg, de peso corporal) inyecciones como sea necesario. Administrar una pomada antibiótica oftálmica para los ojos para proteger las córneas durante los procedimientos siguientes. Administrar dextrosa al 5% (3 ml) y atropina (0,05 mg / kg, de peso corporal) cada seis horas disminuyen las secreciones respiratorias durante la anestesia. Medida de la temperatura del cuerpo a través de una sonda rectal, y mantener la temperatura corporal a 37 º C mediante una manta térmica auto-regulación. </li></ol></li><li> Busque la MCA ya sea por: <ol class="lalpha"><li> Adelgazamiento de 2 x 2 mm de imagen / visualización de la ventana sobre la corteza somatosensorial con un tamaño de 3 HP broca hasta que el cráneo es casi transparente y adelgazamiento de la plena transparencia con un tamaño de 2 HP broca. Ubicación de la MCA a continuación, puede verse a través de esta ventana y su trayectoria proximal se utiliza para aproximar la ubicación del segmento inicial. MCA funcionarán generalmente en diagonal a través de esteventana en una rostral a caudal / ventral a la dirección dorsal (por ejemplo, a la izquierda a la inferior derecha / arriba cuando vea hemisferio izquierdo desde el punto de vista del cirujano). La ventana quirúrgica a continuación, se puede crear por encima de donde el observador estima el segmento M1 (proximal a cortical ramificación) que se encuentra sobre la base de las ramas distales visibles a través de la primera ventana. Con el fin de reducir al mínimo la cantidad de cráneo que se retira con el fin de obtener acceso a MCA, la ventana de proyección de imagen / visualización debe colocarse cerca de, pero separada de la ventana quirúrgica. O </li><li> Una pequeña ventana quirúrgica debe colocarse aproximadamente 3 mm por delante y 1 mm lateral a la foramen oval o el nervio mandibular, cerca de la tribuna arco 30,33,34. Con el fin de acceder efectivamente el vástago de la MCA (también conocida como el segmento M1), el músculo temporal se refleja temporalmente lejos de la superficie del cráneo. (Nota: En el caso de las cirugías de supervivencia a largo plazo, la experiencia de nuestro laboratorio ha sido that al permitir que el músculo temporal para permanecer unido en su ancla, el músculo se vuelva a hibridar con la superficie del cráneo, lo que permite para el comportamiento de alimentación saludable y el mantenimiento eficaz de peso corporal. </li></ol></li><li> Siga MCA a la esquina ventral rostral de la ventana de la imagen (si se utiliza como una referencia) con el fin de estimar dónde está su rama cortical inicial. </li><li> Crear una nueva región cráneo-delgada (nos referimos a esto como la ventana quirúrgica) ligeramente rostral y ventral a la ventana de la imagen (si se utiliza como una referencia) en el segmento M1 (pre-cortical ramificación) de MCA debe ser. NOTA IMPORTANTE: Deje aproximadamente un hueco de 2 mm entre la ventana de la imagen (si se utiliza como una referencia) y la ventana quirúrgica. </li><li> Localizar el tallo de la MCA (también conocida como el segmento M1) justo antes de ramificación cortical de la arteria como se muestra en las Figuras 1A y 1B. </li><li> Con un tamaño de HP-3 broca delgada del cráneo por encima de la ubicación del segmento M1 estimado. Cuando elcráneo se convierte en algo transparente, cambie el tamaño más delicado bits HP-2 taladro y delgada del cráneo hasta que sea completamente transparente. Confirmar visualmente como área de la ventana quirúrgica se vuelve lo suficientemente delgada para ver la vasculatura, y evaluar la ubicación de M1 en este punto y completar la ventana de tal manera que no es de 2-3 mm a cada lado de la longitud del segmento M1 (esto permite espacio para la inserción y salida de la aguja de sutura a cada lado de la MCA). </li></ol> NOTA IMPORTANTE: detener el adelgazamiento cuando el espesor del cráneo es similar a la de una envoltura de plástico. El recipiente se romperá si el taladro se rompe a través del cráneo y la duramadre. Si el cráneo no es lo suficientemente delgada como en el otro lado, para la eliminación de la oclusión será difícil y puede provocar daños a la corteza o arteria. <ol start="7"><li> Tome una de calibre 30 (30 G) aguja hipodérmica y doblar la punta de la aguja, usando unas pinzas dentadas. </li><li> Utilice la aguja de 30 G para perforar el cráneo cuidadoplenamente en una zona no directamente encima de una arteria. Utilice este orificio de punción para permitir pinzas para sujetar el cráneo y retirar con cuidado la zona adelgazada de la ventana quirúrgica. </li><li> Tome una nueva 30 G necesidad, doble la punta como en el paso 6, y retirar con cuidado la duramadre. </li></ol> NOTA: Cortar la duramadre hará que se desprenda y MCA se hará más prominente, como resultado de la presión reducida. 3. Oclusión de la MCA <ol><li> Use cortadores de alambre para cortar un corte de aguja de sutura (ronda 3/8, 16 mm aguja de sutura) hacia abajo hasta aproximadamente 3-5 mm inversa medio de la curva. </li><li> Enrosque la aguja de sutura recortada, como se muestra en la imagen de la figura 4E. NOTA IMPORTANTE: Es importante que la aguja se enhebra por lo que ambos extremos del hilo de sutura son de longitud equivalente. Esto permite que el hilo tirando de ambos extremos bajo M1, al mismo tiempo, la aguja se puede cortar entonces libre de salir de dos longitudes de hilo para atar los dos nudos alrededor de la MCA. </li><li> Utilice la sierra de las pinzas deslice la aguja de sutura bajo M1. Inserte con aproximadamente 0,5-1 mm de distancia de la CRM, quedando como poco profunda como sea posible a fin de minimizar el daño a la corteza, pero evitando demasiada tensión en MCA así. </li><li> Cuando la aguja de sutura sale por el otro lado de tal manera que se encuentra bajo la MCA, utilizar una pinza de punta fina (como se muestra a continuación) para tirar de la punta de la aguja de sutura desde el lado opuesto, mientras que la alimentación continua o empujar el otro extremo de la sutura aguja con la punta dentada pinzas. </li><li> Una vez que la aguja de sutura está completamente pasa por debajo de MCA y se ha extraído, continuar a tirar de la aguja de sutura o hilo hasta que la longitud de la rosca es igual a cada lado de la MCA. Presionar hacia abajo el hilo, ya que se alimenta a través de minimizar la tensión en MCA puede ser útil para evitar la ruptura como el hilo pasa por debajo de la arteria. </li><li> Corte el hilo cerca de la aguja de sutura. </li><li> Use las dos pinzas de punta fina para desenredar los dos hilos de sutura resultantes por lo que hay dos temas independientes encadenados bajo MCA que no se tocan. Lo ideal sería que los hilos serán de aproximadamente 1 mm entre sí en los que pasan por debajo de la MCA. </li><li> Use las dos pinzas de punta fina para atar dos nudos separados (dos ligaduras) con los hilos alrededor MCA tratan de mantener ese ~ 1 mm de espacio entre los nudos para dejar espacio para la transección. </li></ol> NOTA: Si se desea un control interno simulado, preparar la oclusión dejando los nudos de oclusión sueltos para que no se contraen MCA en absoluto y recoger los datos antes de apretar los nudos y cortar el vaso. Corte el hilo para evitar que se enganche en cualquier cosa antes de la oclusión, pero dejan suficiente hilo para permitir el endurecimiento de los nudos más tarde. De esta manera, cualquier formación de imágenes de referencia o la recogida de datos se puede realizar con todos de la misma invasión quirúrgica como la oclusión y los nudos apretados en el punto de tiempo apropiado con poco retardo. <ol start="9"><li> Una vez que los nudos han seres tensada, use las tijeras micro para seccionar M1 entre los dos nudos. </li><li> En el caso de los estudios, la supervivencia a largo plazo: <ol class="lalpha"><li> Sutura incisión colgajo del cuero cabelludo en su lugar con hilo quirúrgico estéril o fijar el tejido con grapas para heridas estériles. </li><li> Administrar antibióticos localmente en el área de la herida (tales como bacitracina pomada) y sistémicamente por inyección profiláctica de ampicilina (150 mg / kg IM). </li><li> Mientras que el tema sigue siendo anestesiado administrar una pomada oftálmica antibiótica en los ojos. </li><li> Administrar suplementario atropina (0,05 mg / kg IM) para reducir las secreciones respiratorias durante la anestesia. </li><li> Inyectar flunixina meglumina (1,1 mg / kg) por vía subcutánea en la conclusión de la cirugía y de nuevo a la mañana siguiente (~ 12 horas más tarde) para el control del dolor. </li><li> Coloque el animal sobre una superficie seca, caliente, inclinada de manera que la nariz de los animales está por encima de la cola en la pendiente (esto facilita la respiración hasta que el animal está despierto). &lt;/ Li&gt; <li> Monitorear el animal hasta que esté despierto y en movimiento de forma segura en su propia. </li><li> Una vez que el animal está de vuelta en el vivero, la actividad del animal, la apariencia, la vocalización, y la alimentación y la bebida comportamiento debe ser revisado diariamente. </li></ol></li></ol> 4. Eutanasia <ol><li> A la conclusión de cada experimento, las ratas deben ser sacrificados con pentobarbital de sodio (2-3 ml, por vía intraperitoneal). </li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats.+Which+method+works+best?.">Middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Which method works best?.</a> Stroke. 24, 294-297 (1993).</li><li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats.">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20, 84-91 (1989).</li><li>Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+reevaluation+of+the+intraluminal+thread+model+of+focal+cerebral+ischemia:+evidence+of+inadvertent+premature+reperfusion+and+subarachnoid+hemorrhage+in+rats+by+laser-Doppler+flowmetry.">A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry.</a> Stroke. 29, 2162-2170 (1998).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar en este momento.

Este protocolo fue desarrollado con el fin de inducir isquemia dentro de la corteza de roedores, y hacerlo con un mínimo impacto periférico a los sujetos experimentales. El doble oclusión y transección método permite la confirmación visual de que el buque ha sido ocluida de forma permanente, y se pueden realizar sin invasión excesiva o daños en los tejidos, y con una alta tasa de supervivencia. Este protocolo de oclusión puede ser aplicada a cualquier recipiente de cortical que se puede acceder a través de cra...

Con el fin de inducir estados isquémicos que imitan efectivamente accidente cerebrovascular isquémico humano, varios modelos animales de accidente cerebrovascular se emplean ampliamente, con diferentes volúmenes de infarto resultantes. En el modelo de photothrombotic, el cerebro se irradia a través del cráneo intacto utilizando iluminación láser después de la inyección intravenosa de una sustancia fotosensible (por ejemplo, rosa de bengala-), lo que resulta en la coagulación fotoquímica, obstrucción de los vasos irradiados, y la isquemia en el tejido circundante 6, 7. Photothrombosis puede resultar en regiones muy pequeñas, aisladas de infarto y se utiliza típicamente como un medio de modelado &quot;mini derrames cerebrales&quot;, o &quot;micro-accidentes cerebrovasculares&quot;. La técnica más ampliamente adoptado para la inducción de accidente cerebrovascular isquémico, particularmente en la arteria cerebral media (ACM), es el modelo de monofilamento intraluminal 8, en el que un filamento se introduce quirúrgicamente en la arteria carótida externa y se hace avanzar hasta que la punta ocluye la base de la MCA. A primary desafío de la oclusión filamento intraluminal es la alta tasa de mortalidad (70% cuando MCA está ocluida durante 3 horas, un punto de tiempo relevante para la investigación de accidentes cerebrovasculares) 9. Otros problemas con el método incluyeron posible hemorragia subaracnoidea, la oclusión incompleta, y el volumen del infarto variable de 10,11. Este modelo da como resultado un amplio grado de infarto tanto en la corteza y subcorticalmente 12, y los modelos de un accidente cerebrovascular humana masiva. Aunque tanto las micro y masiva modelos ictus son importantes, movimientos humanos son por lo general en algún punto intermedio. En grandes estudios clínicos, los rangos de tiempos de infarto de tamaño 28 a 80 cm 3, que se traduce en 4,5 a 14% de la IPSI ishemic hemisferio 9. En comparación, nuestros rata pMCAO el tamaño del infarto oscila entre aproximadamente 9-35 mm 3, que constituye de 3 a 12% del hemisferio ipsilateral ishemic. Nuestro modelo pMCAO, por lo tanto, se asemeja mucho a los volúmenes de infarto con accidente cerebrovascular isquémico humanos por porcentaje de cerebrovolumen. Además de modelar el daño estructural de accidente cerebrovascular, los resultados pMCAO en déficits funcionales y de comportamiento similares a la condición humana. Como mínimo, un modelo eficaz de los resultados de accidente cerebrovascular en trastornos del movimiento contralateral a daño por apoplejía 13-15, pérdida o alteración de la función motora y sensorial 16,17, pérdida o alteración de la actividad neuronal evocada 16,18, reducciones en el flujo sanguíneo cerebral 19, 20, e infarto 21,22. Por consiguiente, nuestros modelos pMCAO una oclusión de la MCA grave resulta en una discapacidad física, pérdida de la función dentro de la corteza sensorial (y cortezas vecinos), la interrupción de la actividad neuronal, una severa reducción en el flujo sanguíneo MCA, y los atributos del infarto-sello de accidente cerebrovascular isquémico 23 -25, por lo tanto, servir como un modelo efectivo de apoplejía humana. Procedimiento, pMCAO implica una pequeña craneotomía en la que nos retiramos con cuidado el cráneo y la duramadreun x mm &quot;ventana quirúrgica&quot; 2 2 sobre el segmento inicial (M1) de la MCA, justo antes de la bifurcación primaria de la MCA en las ramas corticales anteriores y posteriores (Figuras 1A y 1B). Pasamos la mitad de la curva inversa de corte aguja e hilo de sutura (seda 6-0) a través de la capa pial de las meninges, por debajo de MCA y sobre la superficie cortical (véase la tabla de reactivos y equipos específicos para los suministros quirúrgicos necesarios para llevar a cabo pMCAO ). Luego atamos una doble ligadura, apriete los dos nudos alrededor de MCA, y seccionar el vaso entre los dos nudos. El doble ligadura y corte transversal a través de M1 se produce justo distal a la bifurcación lenticuloestriadas, de tal manera que sólo las ramas corticales de MCA son afectados-por lo tanto sólo de infarto cortical (sin daño subcortical) se produce 26,27 (Figura 2). Aunque derrame cerebral humana a menudo implica infarto subcortical, modelar esto en roedores requiere aumento de la invasividad (ocluir los vasos cerebrales antes de la cortical Branching arterias requiere el acceso a través de la arteria carótida en el cuello y requiere oclusiones adicionales) y en la técnica de aumento de la variabilidad en el tamaño del infarto. El modelo descrito aquí no se puede realizar más proximalmente como el acceso a las ramas anteriores de la MCA no es posible a través de una simple craneotomía. Si bien puede ser posible inducir quirúrgicamente un infarto subcortical a través de pMCAO, oclusión implicaría un procedimiento muy invasivo y por lo tanto no es lo ideal. Eficacia de la oclusión puede ser confirmado a través de láser Doppler, o láser speckle imágenes 12,24,25 (Figura 3), o histológicamente post mortem (Figura 2). Cabe señalar que la investigación anterior ha demostrado que la estimulación sensorial puede desempeñar un papel importante en la evolución y el resultado de infarto; conferir protección contra el daño cuando se administra dentro de 2 h de pMCAO y causando un aumento en el daño por apoplejía cuando se administra a las 3 horas después de la pMCAO 24,25,28. Hemos confirmado que a las 5 horas después de la pMCAO, la estimulación ya no tiene un efecto sobre el resultado (datos no publicados). Por lo tanto, la estimulación sensorial de los sujetos debe minimizarse durante 5 horas tras pMCAO obtener volúmenes de infarto con una variabilidad mínima. En consecuencia, nuestro grupo se ejecuta &quot;controles no tratados&quot; de este tipo, manteniendo las ratas anestesiadas durante 5 horas después de la pMCAO, en la oscuridad, con la estimulación sensorial mínimo, y expresamente sin estimulación bigote. Cabe señalar además que la variación ocasional en la estructura de la MCA, incluyendo excesiva ramificación, múltiples segmentos primarios, o la ausencia de arterias comunicantes puede ocurrir a una frecuencia de 10 a 30% en adultos varones de ratas Sprague Dawley 29,30. Si se observan anomalías en el MCA, se aconseja no utilizar este tema en particular como la adición de los animales con tales anomalías vasculares aumentará la variabilidad del infarto. Además, hay varios aspectos prácticos de la oprocedimiento de ur que hacen que este método de oclusión ventajosa para la investigación apoplejía. En primer lugar, las suturas pueden ser colocados alrededor de la arteria, pero no apretados con el fin de recoger una evaluación de línea base, seguido de evaluación post-isquémica después de la ligadura y corte transversal. De esta manera, la preparación quirúrgica necesaria para la oclusión se controla eficazmente para, dentro de los sujetos. Debido a que los sujetos pueden permanecen estacionarios o dentro de un marco estereotáxico lo largo de la oclusión, es posible llevar a cabo la evaluación experimental de cada sujeto antes de, durante, y después de la oclusión sin mover el objeto o molestar a cualquier equipo experimental en uso 25,28. Además, este procedimiento da como resultado una tasa de mortalidad muy baja, incluso dentro de los sujetos de roedores envejecidos 21-24 meses de edad (equivalente a un ser humano de edad avanzada) 31, y por lo tanto pueden ser utilizados para evaluar los tratamientos con accidente cerebrovascular en ratas que más de cerca modelar los más comunes grupo de edad de los enfermos de ictus 25,28. Vessel transection También sirve para varios propósitos prácticos. La ausencia de sangrado después de la transección confirma que el vaso se ocluye completamente en ambos sitios de ligadura. Además, la transección asegura una interrupción permanente de flujo sanguíneo. Por último, la transección asegura que cualquier flujo de sangre detectado en las porciones distales del vaso ocluido debe provenir de una fuente alternativa. Por último, aunque se describe específicamente esta técnica de oclusión de la MCA en este manuscrito y de vídeo, la misma técnica transección doble ligadura se puede aplicar a cualquier vaso cerebral que se puede acceder a través de craneotomía. Nuestro laboratorio, por ejemplo, utiliza pMCAO en conjunción con varias oclusiones permanentes adicionales de MCA ramas distales con el fin de bloquear tanto primaria, y el flujo sanguíneo secundario 24 de una manera similar a la de técnicas diseñadas para inducir selectivamente la isquemia dentro de la corteza somatosensorial primaria 32. En conclusión, tsu método para la oclusión permanente tal como se aplica a MCA modela estrechamente tres facetas principales de accidente cerebrovascular isquémico en humanos: la ubicación más común (MCA), tipo (isquemia), y el grado de daño (infarto) asociado con la literatura clínica humana de accidente cerebrovascular. Además, este método de oclusión se puede aplicar a uno o varios sitios de oclusión en todo el cerebro, y puede llevarse a cabo en sujetos de edad con una alta tasa de supervivencia. Dado el carácter dinámico y permanente, y relativamente no invasivo de esta oclusión, esta técnica representa una herramienta adicional a los investigadores preclínicos evalúan nuevos enfoques para la protección y tratamiento del ictus.

<table border="1">
 <tr>
 <td>Name of the equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Extra Fine Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Slight Curve (1)</td>
 <td>Fine Science Tools </td>
 <td>11151-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2)</td>
 <td>Fine Science Tools </td>
 <td>11252-50</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Extra Fine Bonn Scissors, straight (1)</td>
 <td>Fine Science Tools </td>
 <td>14084-08</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Round 3/8 (16 mm) Suture Needles</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>12050-02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-0 Braided Silk Suture</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>NC9071061 
 Harvard Apparatus 
 No.:510461</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30 gauge needle, &frac12;" length</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>NC9867376 
 
 No.:ZT-5-030-5-L/COL</td>
 <td></td>
 </tr>
</table>

permanent cerebral vessel occlusion via double ligature and transection

El accidente cerebrovascular es la principal causa de muerte, discapacidad y pérdidas socioeconómicas en todo el mundo. La mayoría de todos los accidentes cerebrovasculares resultado de una interrupción en el flujo sanguíneo (isquemia) 1. La arteria cerebral media (ACM) ofrece una gran mayoría de la sangre a la superficie lateral de la corteza 2, es el sitio más común de accidente cerebrovascular humano 3, y la isquemia dentro de su territorio puede resultar en la muerte o la disfunción extensa 1,4,5. Los sobrevivientes de un accidente cerebrovascular isquémico menudo sufren pérdida o alteración de las capacidades motoras, déficit sensorial, e infarto. En un esfuerzo para capturar estas características clave de accidente cerebrovascular, y de este modo desarrollar un tratamiento eficaz, una gran cantidad de énfasis se pone sobre modelos animales de isquemia en MCA. Aquí se presenta un método de oclusión permanente de un vaso sanguíneo superficie cortical. Vamos a presentar este método con un ejemplo de una oclusión de los vasos relevante que modela el tipo más común, la ubicación y outcome de la carrera humana, oclusión de la arteria cerebral media permanente (pMCAO). En este modelo, nos exponemos quirúrgicamente MCA en la rata adulta y, posteriormente, a través de ocluir doble ligadura y la sección transversal del recipiente. Este pMCAO bloquea la rama cortical proximal de la MCA, causando isquemia en todo el territorio de la MCA cortical, una gran porción de la corteza. Este método de oclusión también se puede utilizar para ocluir porciones más distales de los vasos corticales con el fin de lograr la isquemia focal más centradas en una región más pequeña de la corteza. Las desventajas principales de pMCAO son que el procedimiento quirúrgico es un poco invasivo ya que se requiere una pequeña craneotomía para acceder a MCA, aunque esto da como resultado un daño mínimo del tejido. Las principales ventajas de este modelo, sin embargo, son: el sitio de la oclusión está bien definido, el grado de reducción del flujo sanguíneo es coherente, funcional y deterioro neurológico se produce rápidamente, el tamaño del infarto es consistente, y la alta tasa de supervivencia permite a largo evaluación crónica plazo.

Oclusión exitosa de un buque puede confirmarse mediante láser speckle imágenes (LSI), entre otras técnicas de imagen de flujo sanguíneo. El flujo de sangre en las principales ramas corticales de MCA debe caer a ~ 25% de la línea de base o menos siguiente oclusión en función del nivel de ruido en el sistema de grabación y la sensibilidad de la técnica. Ver la Figura 3 para una imagen representativa LSI de un segmento de una rama cortical del MCA antes y después de oclusión de...

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Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Se describe un método altamente reproducible para la oclusión permanente de un vaso sanguíneo principal cerebral de roedor. Esta técnica se puede lograr con muy poco daño periférico, mínima pérdida de sangre, una alta tasa de supervivencia a largo plazo, y el volumen del infarto coherente acorde con la población clínica humana.

Permanente oclusión vascular cerebral<em&gt; Vía</em&gt; Ligadura doble y transección

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

permanent-cerebral-vessel-occlusion-via-double-ligature

Research

JoVE Journal

Medicine

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

14.8K vistas.  University of California, Irvine. Se describe un método altamente reproducible para la oclusión permanente de un vaso sanguíneo principal cerebral de roedor. Esta técnica se puede lograr con muy poco daño periférico, mínima pérdida de sangre, una alta tasa de supervivencia a largo plazo, y el volumen del infarto coherente acorde con la población clínica humana.

Video: Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Modelo de ratón de la oclusión arteria cerebral media

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Investigación

Medicina

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

La aplicación de la Permanente Ligadura arteria cerebral media en el ratón

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be performed in many locations overlying the rat cerebrum, but is most easily carried out by creating a craniectomy over the readily accessible frontal or parietal bones. Most frequently, we have used this technique in combination with the endothelin-1 middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke to quantify the changes in middle cerebral artery vessel diameter that occur with injection of endothelin-1 into the brain parenchyma adjacent to the proximal MCA4, 5. In order to visualize the proximal portion of the MCA during endothelin -1 induced MCAO, we use a technique to create a cranial window through the temporal bone on the lateral aspect of the rat skull (Figure 1). Cerebral arteries can be visualized either with the dura intact or with the dura incised and retracted. Most commonly, we leave the dura intact during visualization since endothelin-1 induced MCAO involves delivery of the vasoconstricting peptide into the brain parenchyma. This bypasses the need to incise the dura directly over the visualized vessels for drug delivery. This protocol will describe how to create a cranial window to visualize cerebral arteries in a step-wise fashion, as well as how to avoid many of the potential pitfalls pertaining to this method.

This article describes a method for visualizing rat cerebral arteries through a cranial window using temporal craniectomy in order to view proximal portions of the middle cerebral artery (Figure 1). This versatile method can be combined with various techniques of drug delivery to measure cerebral artery reactivity in vivo.

Utilizando una ventana craneal para visualizar la arteria cerebral media Durante la endotelina-1 inducida por oclusión de la arteria cerebral media

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

2 vasos Oclusión / Hipotensión: un modelo de rata de isquemia cerebral global

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

Sistema optimizado para la monitorización de la perfusión cerebral en el modelo de rata de Carrera intraluminal oclusión arteria cerebral media

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Carrera Modelado en ratones: Coagulación permanente de la arteria cerebral media Distal

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after stroke. These myeloid cell subpopulations can display different phenotypes and functions and need to be distinguished and characterized to study their regulation and contribution to tissue damage. This protocol provides two different methodologies for brain immune cell characterization: a precise stereological approach and a flow cytometric analysis. The stereological approach is based on the optical fractionator method, which calculates the total number of cells in an area of interest (infarcted brain) estimated by a systematic random sampling. The second characterization approach provides a simple way to isolate brain leukocyte suspensions and to characterize them by flow cytometry, allowing for the characterization of microglia, infiltrated monocytes and neutrophils of the ischemic tissue. In addition, it also details a cerebral ischemia model in mice that exclusively affects brain cortex, generating highly reproducible infarcts with a low rate of mortality, and the procedure for histological brain processing to characterize infarct volume by the Cavalieri method.

Brain myeloid cells characterization following stroke can be performed by stereology using the optical fractionator method, or by a flow cytometric analysis of brain leukocytes suspensions. Both are useful techniques to perform an accurate phenotypical distinction of the main myeloid cell subsets found in the ischemic brain.

Estereológico y Citometría de Flujo Caracterización de leucocitos subpoblaciones en Modelos de transitorios o isquemia cerebral permanente

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, obesity and diabetes. Accordingly, when evaluating therapies for stroke in animals, it is important to select a model with excellent face validity. Ischemic stroke accounts for 80% of all strokes, and the majority of these occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), often inducing infarcts that affect the sensorimotor cortex, causing persistent plegia or paresis on the contralateral side of the body. We demonstrate in this video a method for producing ischemic stroke in elderly rats, which causes sustained sensorimotor disability and substantial cortical infarcts. Specifically, we induce permanent distal middle cerebral artery occlusion (MCAO) in elderly female rats by using diathermy forceps to occlude a short segment of this artery. The carotid artery on the ipsilateral side to the lesion was then permanently occluded and the contralateral carotid artery was transiently occluded for 60 min. We measure the infarct size using structural T2-weighted magnetic resonance imaging (MRI) at 24 hr and 8 weeks after stroke. In this study, the mean infarct volume was 4.5% &#177; 2.0% (standard deviation) of the ipsilateral hemisphere at 24 hr (corrected for brain swelling using Gerriet&#8217;s equation, n = 5). This model is feasible and clinically relevant as it permits the induction of sustained sensorimotor deficits, which is important for the elucidation of pathophysiological mechanisms and novel treatments.

Here we present a protocol to produce permanent distal middle cerebral artery occlusion in elderly female rats with simultaneous occlusion of the carotid arteries to generate large cortical infarcts and sustained deficits. We show confirmation of the lesion size using structural MRI at 24 hr and 8 weeks after stroke.

Realización Permanente distal cerebral media carótida común con oclusión de la arteria en ratas de edad avanzada para el Estudio de la isquemia cortical con sostenida de la discapacidad

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...

Middle Cerebral Artery Occlusion Allowing Reperfusion via Common Carotid Artery Repair in Mice

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue plasminogen activator (tPA) as an approved drug treatment to target ischemic strokes. Current research in the field of ischemic stroke focuses on better understanding the pathophysiology of stroke, to develop and investigate novel pharmaceutical targets. Reliable experimental stroke models are crucial for the progression of potential treatments. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is clinically relevant and the most frequently used surgical model of ischemic stroke in rodents. However, the outcomes of this model, such as lesion volume, are associated with high levels of variability, particularly in mice. The alternative MCAO model described here allows the reperfusion of the common carotid artery (CCA) and the increased perfusion of the middle cerebral artery (MCA) territory, using a tissue pad with fibrinogen-based sealant to repair the vessel, and the improved welfare of the mice by avoiding external carotid artery (ECA) ligation. This reduces the reliance on the Circle of Willis, which is known to be highly anatomically variable in mice. Representative data show that using this alternative surgical approach decreases the variability in lesion volumes between the traditional MCAO approach and the alternative approach described here.

Intraluminal filament occlusion of the middle cerebral artery is the most frequently used in vivo model of experimental stroke in rodents. An alternative surgical approach to allow common carotid artery repair is performed here, which allows the reperfusion of the common carotid artery and a full reperfusion to the middle cerebral artery territory.

Oclusión de la arteria Cerebral Media permitiendo la reperfusión mediante la reparación de la arteria carótida común en ratones

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue ...

Two-vessel Occlusion Mouse Model of Cerebral Ischemia-reperfusion

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse model is useful for investigating the pathophysiology of cerebral ischemia-reperfusion and determining potential therapeutic strategies for patients with stroke. Variations in the anatomy of the circle of Willis of C57BL/6 mice affects their infarct volume after cerebral-ischemia-induced injury. Studies have indicated that distal MCA occlusion (MCAO) can overcome this problem and result in a stable infarct size. In this study, we establish a two-vessel occlusion mouse model of cerebral ischemia-reperfusion through the interruption of the blood flow to the right MCA. We distally ligate the right MCA and right common carotid artery (CCA) and restore blood flow after a certain period of ischemia. This ischemia-reperfusion injury induces an infarct of stable size and a behavioral deficit. Peripheral immune cells infiltrate the ischemic brain within the 24 h infiltration period. Additionally, the neuronal loss in the cortical area is less for a longer reperfusion duration. Therefore, this two-vessel occlusion model is suitable for investigating the immune response and neuronal recovery during the reperfusion period after cerebral ischemia.

A mouse model of cerebral ischemia-reperfusion is established to investigate the pathophysiology of stroke. We distally ligate the right middle cerebral artery and right common carotid artery and restore blood flow after 10 or 40 min of ischemia.

Oclusión de los vasos dos ratón modelo de isquemia-reperfusión Cerebral

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse ...