Este modelo de ratón de oclusión de dos vasos de isquemia-reperfusión cerebral puede investigar la fisiopatología del accidente cerebrovascular. Este modelo inducirá un volumen estable de infarto de la mayor parte de las células inmunitarias infiltrantes cerebrales en el cerebro isquémico y el déficit conductual después de la isquemia-reperfusión cerebral. En este modelo, se produce un infarto en las zonas corticales y la tasa de mortalidad es baja.
Debido a que el modelo de reperfusión MCAO de ligadura requiere craneotomía para exponer el tamaño de la MCA distal, el tamaño se puede confirmar fácilmente, y el examen si el flujo sanguíneo en el MCAO distal se interrumpe durante el procedimiento es sencillo. Proporcione a los ratones acceso gratuito al agua y a los alimentos hasta la cirugía. Autoclave las herramientas quirúrgicas, y utilizar 70%etanol para desinfectar la mesa de cirugía y el equipo.
Después de anestesiar un ratón de ocho a 12 semanas de edad, asegúrese de que no tiene un reflejo de pedal cuando se prueba con un pellizco firme del dedo del pie. Use ung ón veterinario para evitar la sequedad ocular mientras el ratón está bajo anestesia. Para controlar la presión arterial, primero retire el cabello, y luego utilice un sistema de presión arterial no invasivo y un sistema de monitoreo fisiológico para monitorear la temperatura rectal y los gases sanguíneos arteriales.
Inyecte el ratón por vía subcutánea con un antibiótico profiláctico. A continuación, coloque el ratón en la posición supina en la almohadilla de calentamiento. Para exponer la piel, utilice pinzas eléctricas para afeitar el pelaje en la región del cuello ventral y en la región entre el ojo derecho y el oído derecho.
Limpie el pelaje del cuerpo del animal con crema depilantes y desinfecte el sitio quirúrgico con 70% de etanol. Luego corta una incisión de línea media de un centímetro de largo en el cuello usando tijeras de iris. Con los fórceps del iris, disecciona cuidadosamente la arteria carótida común libre de los nervios vagos sin causar lesiones físicas, y usa suturas de seda 5-0 para aislar la arteria.
A continuación, usa tijeras de iris para hacer una incisión de 0,3 centímetros en el cuero cabelludo en el punto medio entre el ojo derecho y el oído derecho. Usando micro tijeras, corte el músculo temporalis para exponer el hueso cigomático y escamoso. Coloque el ratón debajo de un microscopio de disección estéreo y utilice un micro taladro para crear un agujero de dos mililitros directamente sobre la arteria cerebral media distal del lado derecho.
Usa una sutura 10-0 para ligar el tronco del MCA distal del lado derecho, y usa un clip de aneurisma no traumático para ocluir la CCA del lado derecho. Después de la duración deseada de la isquemia, retire la sutura y el clip de aneurisma para restaurar el flujo sanguíneo al MCA y CCA. Utilice un clip de sutura para sellar la incisión de la piel en la cabeza y sellar las incisiones de la piel cervical con pegamento quirúrgico.
Inyecte buprenorfina por vía subcutánea para aliviar el dolor. Mantener la temperatura corporal del animal en 36,5 más o menos 0,5 grados Centígrados en la almohadilla de calentamiento, y no dejar desatendido ni devolverlo a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado de la anestesia. Por último, coloque el ratón en la jaula del autoclave para que pueda acceder libremente al agua y a los alimentos después de que se haya recuperado por completo.
Usa tijeras de iris para hacer una incisión en la piel de la cabeza del ratón anestesiado y decapitado para exponer el cráneo. Luego usa tijeras de operación para cortar lo anterior del hueso frontal, y con tijeras de iris, corta el cráneo a lo largo de la sutura sagital. Con un rongeur óseo, empuja a un lado el hueso frontal y parietal, y expone el cerebro.
Retire el cerebro y colóquelo en una matriz cerebral de ratón. Utilice cuchillas de afeitar para obtener rodajas coronales de dos mililitros y colóquelas en tubos de 50 mililitros llenos de cinco mililitros de 2%TTC. Cuando se utiliza la matriz cerebral del ratón para obtener rodajas coronales, el tamaño de corte debe ser el mismo en diferentes cerebros.
El tamaño de corte afecta el tamaño de las rebanadas cerebrales, que también afectan el cálculo del tamaño del infarto. Mancha las rebanadas cerebrales con 2%TTC y 1X PBS durante 10 minutos a 37 grados Celsius, y luego enjuaga dos veces con 10%formalina. Fijar las rebanadas cerebrales en 10%formalina a temperatura ambiente durante 24 horas.
Después de secar las rebanadas cerebrales en el papel tisú para absorber el exceso de formalina, acoplándolas en un portaobjetos de plástico limpio, orientandolas de rostral a caudal, y cúbralas con otro portaobjetos de plástico limpio. Escanee la diapositiva con un escáner. Dé la vuelta a la diapositiva y escanee el reverso.
Utilice el software ImageJ para calcular el área de infarto de cada sección, primero abriendo el archivo de imagen y configurando la escala de la imagen. A continuación, utilice la selección a mano alzada para seleccionar el área de infarto y utilice el administrador de ROI de regiones de interés para medir el área de interés. Por último, sume las áreas de infarto para cada sección y multiplique el resultado por el grosor de la sección para estimar el volumen total de infarto y, a continuación, complete el análisis estadístico como se describe en el manuscrito.
El aumento de la duración de la isquemia durante este procedimiento de reperfusión de MCAO produjo diferentes grados de volumen de infarto inducido por isquemia y pérdida neuronal en la corteza cerebral del área correcta de MCA. Además, la isquemia disminuyó la actividad locomotora del animal a las 48 horas después de la reperfusión MCAO. Después de la reperfusión de isquemia cerebral, una mayor parte de las células inmunitarias periféricas se infiltraron en el hemisferio ipsilateral del cerebro isquémico.
Además, cuando se comparó este modelo de oclusión de dos buques con el modelo MCAO, sus volúmenes de infarto no eran significativamente diferentes. El micro taladro debe utilizarse cuidadosamente al crear un agujero en el cráneo. Con una acción inapropiada, fácil causar sangrado de la MCA.
El MCA no debe dañarse, y el sangrado debe evitarse antes y después del procedimiento de ligadura. La oclusión MCA y el estado de la reperfusión pueden ser comprobados por el doppler láser. Este método puede confirmar la condición del flujo sanguíneo de MCA.
