Damos las gracias a S. Burkhart, C. Hofmann y Simone Gräßle por su excelente asistencia técnica y estamos agradecidos a M. Ferg para ayudar con el análisis de datos. También queremos agradecer a S. Rastegar de comentarios críticos sobre el manuscrito. Reconocemos la financiación por el Studienstiftung des deutschen Volkes (a MW), la DFG (DI913/4-1) y los BioInterfaces Programa de Helmholtz en kit.

1. Preparar la dilución de trabajo de la Biblioteca Química Cavidad de predilución de los compuestos de la biblioteca de medicamentos para ser probado (por ejemplo, la FDA aprobó las drogas, Enzo Life Science) en E3 (NaCl 5 mM, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM CaCl 2) con una estación de manipulación de líquidos robótico (por ejemplo Multiprobe II, 8 agujas con adaptador de puntas disposición, PerkinElmer). Las concentraciones adecuadas son, por ejemplo 40 g / ml en 3% de DMSO, pero esto dependerá del tipo de biblioteca usado. Los ajustes Multiprobe II correspondientes a los pasos descritos a continuación se indican en la Tabla 1. El protocolo descrito en la tabla permite la preparación de cuatro placas alícuotas en paralelo. <ol><li> Pipeta 10 ml de alícuotas de la biblioteca de papeles (2 mg / ml en DMSO) en placas de pocillos profundos (por ejemplo, placas de 96 pocillos de almacenamiento, Round Bueno, 0,8 ml, ABgene). Las columnas 1 y 12 deben dejarse vacíos - éstos recibirán los controles positivos y negativos dentro de la placa. </li><l<html> i&gt; Se dispensan 490 l de E3 con DMSO al 1% en las alícuotas preparadas de la biblioteca con el Multiprobe II. La dilución se realiza con agujas fijas sin la punta de eliminación. </li><li> Añadir 10 l de DMSO en la columna 1 y 10 l de una solución de dexametasona 5 mM (en DMSO) a la columna 12 como controles dentro de la placa. La concentración de DMSO en todos los pocillos es ahora 3%, la concentración de dexametasona en los pocillos de control positivo es 100 mM en E3 / 3% de DMSO. </li><li> Sellar la placa con adhesivo resistente DMSO láminas de sellado. Almacenar las placas a -80 º C hasta su uso. </li></ol> 2. Cría de Periodista Fish Recoger los embriones de desove natural de los apareamientos de grupo entre GRE: Luc pescado transgénico. Levante embriones (no más de 60) en 9 cm de platos Petri que contenían medio E3 suplementado con 1 mg / ml de azul de metileno fungicida hasta 4 días después de la fertilización (dpf) en una incubadora a 28 ° C. Cambio de medio E3 regularmente. título &quot;&gt; 3. Preparación de luciferasa Medio (E3L) Preparar una solución de luciferina madre acuosa de 50 mM añadiendo dH2O al vial que contiene el polvo luciferina. Esta solución madre se puede almacenar a -80 ° C durante varios meses. Diluir el Stock luciferina en un medio de E3 a una concentración final de 0,5 mM para obtener medio E3L. 4. Distribuir larvas en placas de 96 pocillos <ol><li> Prepare 1 ml puntas de pipeta con gran calibre cortando aproximadamente 5 mm de la punta y los bordes afilados en llamas brevemente. </li><li> Larvas piscina de varios cruces vertiendo cuidadosamente de las placas de Petri en un vaso de precipitados. Cosechar alrededor de 50 larvas en un momento mediante el vertido suavemente sobre un tamiz (tamaño de poro de 0,25 mm de diámetro) e inmediatamente colocar el tamiz en una pequeña placa de Petri (diámetro 5,5 cm) lleno de medio de E3L. </li><li> Con una punta de pipeta de orificio ancho, transferir 225 l de medio que contienen una larva cada uno de los pocillos de una blancoPlaca de 96 pocillos (OptiPlate, PerkinElmer). </li><li> Sellar las placas con láminas de sellado adhesivo (por ejemplo TopSeal-A, PerkinElmer) y se incuba ellos a 28 ° C durante la noche. Esto evita que la preincubación de grabación de cambios transitorios en la bioluminiscencia inmediatamente después de la adición de luciferina, un fenómeno que se produce también en las células cultivadas 19. </li></ol> 5. Tratamiento de Drogas <ol><li> Retire la placa que contiene la dilución de trabajo de la biblioteca desde el -80 ° C congelador aproximadamente 4 horas antes de su uso. Vórtice suavemente la placa y brevemente girar en una centrífuga para recoger el líquido en la parte inferior de la placa. </li><li> Retire las hojas de sellado adhesivas de las placas de larvas. </li><li> Con un 96-canal de dispositivo de pipeta de accionamiento manual (por ejemplo, Liquidator, Steinbrenner) pipeta la solución de fármaco hacia arriba y abajo 3 veces. Entonces alícuota de 25 l de la dilución de trabajo de la biblioteca química en los pocillos que contienen las larvas (con el ejemplo anterior, esteresultados en una concentración final de 4 g / ml en E3 con 0,3% de DMSO). Preparar 10 (mínimo: 5) placas de réplica con larvas por placa biblioteca. </li><li> Sellar las placas con las láminas de sellado adhesivo y la etiqueta de cada plato con una etiqueta de código de barras. </li></ol> 6. Grabación de luminiscencia <ol><li> Coloque las placas que contienen las larvas en las unidades de apilamiento de un lector de bioluminiscencia EnVision como la creciente sensibilización de luminiscencia (Perkin Elmer). Alternativamente, utilizar un sistema robotizado incubadora tales como las empleadas para los sistemas de detección de cultivo de células de mamífero en combinación con el lector. </li><li> Bioluminiscencia Registro durante dos días utilizando ajustes del lector análogos a los descritos en la Tabla 2 para el lector Envision. Adaptar el número de repeticiones del ensayo con el número de placas en la carrera para que coincida con el tiempo de ejecución requerido. </li><li> Después del final de la carrera, comprobar las placas para determinar la presencia de larvas muertas para evaluar la toxicidad general del borradorHeridas. </li></ol> 7. Análisis de Datos Todo el análisis de los datos se realiza en el entorno de programación estadística R utilizando scripts personalizados. <ol><li> Cálculo AUC Con el fin de identificar compuestos que activan GC de señalización independientemente de sus propiedades cinéticas, determinar el área bajo la curva (AUC) de las trazas grabadas de luminiscencia (de bioluminiscencia recuentos en función del tiempo primas) como el parámetro de cribado. Las AUC son aproximados con la regla trapezoidal (ver figuras 2a y a &#39;). </li><li> Normalización Log transformada de los valores de AUC con el fin de garantizar un mayor normalidad de los datos (Figuras 2b y B &#39;). Entonces normalizar el log transformado los valores de AUC para cada placa de la biblioteca con el método de puntuación Z robusta (ver 20). Esta normalización se traduce en valores que representan el número de desviaciones estándar de la mediana de todos los puntos de datos. De esta manera,errores sistemáticos, como la variabilidad inter-run, se eliminan de los datos. Los datos ahora pueden ser visualizados por el trazado de la robusta Z-score promedio de las réplicas para cada pozo (Figuras 2c y c &#39;). </li><li> Las métricas de calidad <ol><li> Mapa de calor Con el fin de visualizar la placa efectos relacionados, graficar los datos de cada plato como un mapa de calor utilizando por ejemplo la función heatmap.2 del paquete gplot 21. De esta manera, los efectos de borde o compuesto de arrastre se pueden detectar fácilmente (por ejemplo, comparar Figura 3A con 3B). Excluir placas sub-óptimos de los nuevos análisis. </li><li> Curva ROC Para determinar la sensibilidad y especificidad de la prueba, calcular un receptor de funcionamiento característico (ROC) por ejemplo con la ayuda del paquete bioconductor ROC 22 utilizando los valores de Z-score determinados de 7,2 (Figura 3c). Posteriormente, determinar el AUC de este curve. Un valor de AUC de cerca de 1 indica una alta sensibilidad y especificidad del ensayo. </li></ol></li><li> Hit de identificación Para optimizar el valor de corte para la identificación de compuestos activos, determinar el índice de Youden. Para el cálculo del índice, se resta la verdadera tasa positiva estimada (TPR) de la tasa de falsos positivos (FPR) de la curva ROC para el aumento de los valores de corte Z-score robustos. Tome la robusta Z-score con el índice más alto de Youden (TPR menos FPR) como el punto de corte. El TPR / FPR se puede estimar mediante la detección de pocillos de control positivo o de los compuestos activos conocidos dentro de la biblioteca. Al utilizar el control positivo pozos asegurarse de que coinciden con la fuerza éxito esperado. </li></ol> 8. Reevaluación <ol><li> Vuelva a evaluar los compuestos de ataque positivos mediante el tratamiento de las larvas con diluciones en serie de los compuestos obtenidos a partir de un proveedor diferente, utilizando la misma grabación de la configuración descrita anteriormente. Los verdaderos éxitos deben inducir una luminiscencialso en este ensayo, idealmente en una manera dependiente de la dosis. </li></ol>

<ol>
	<li>Norris, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vertebrate Endocrinology. , (2007).</li><li>Kassel, O., Herrlich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+glucocorticoid+receptor+and+other+transcription+factors:+molecular+aspects.">Crosstalk between the glucocorticoid receptor and other transcription factors: molecular aspects.</a> Mol Cell Endocrinol. 275, 13-29 (2007).</li><li>Baschant, U., Tuckermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+glucocorticoid+receptor+in+inflammation+and+immunity.">The role of the glucocorticoid receptor in inflammation and immunity.</a> J Steroid Biochem Mol Biol. 120, 69-75 (2010).</li><li>Schacke, H., Docke, W. D., Asadullah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+involved+in+the+side+effects+of+glucocorticoids.">Mechanisms involved in the side effects of glucocorticoids.</a> Pharmacol Ther. 96, 23-43 (2002).</li><li>De Bosscher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Glucocorticoid+Receptor+modulators.">Selective Glucocorticoid Receptor modulators.</a> J Steroid Biochem Mol Biol. 120, 96-104 (2010).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo.">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nat Protoc. 4, 1422-1432 (2009).</li><li>Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+screening+in+zebrafish.">Small molecule screening in zebrafish.</a> J Cardiovasc Transl Res. 3, 454-460 (2010).</li><li>Casals-Casas, C., Desvergne, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+disruptors:+from+endocrine+to+metabolic+disruption.">Endocrine disruptors: from endocrine to metabolic disruption.</a> Annu Rev Physiol. 73, 135-162 (2011).</li><li>Grun, F., Blumberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+the+case+for+obesogens.">Minireview: the case for obesogens.</a> Mol Endocrinol. 23, 1127-1134 (2009).</li><li>Odermatt, A., Gumy, C., Atanasov, A. G., Dzyakanchuk, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+glucocorticoid+action+by+environmental+chemicals:+potential+mechanisms+and+relevance.">Disruption of glucocorticoid action by environmental chemicals: potential mechanisms and relevance.</a> J Steroid Biochem Mol Biol. 102, 222-231 (2006).</li><li>Odermatt, A., Gumy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+and+mineralocorticoid+action:+why+should+we+consider+influences+by+environmental+chemicals.">Glucocorticoid and mineralocorticoid action: why should we consider influences by environmental chemicals.</a> Biochem Pharmacol. 76, 1184-1193 (2008).</li><li>Lohr, H., Hammerschmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+endocrine+systems:+recent+advances+and+implications+for+human+disease.">Zebrafish in endocrine systems: recent advances and implications for human disease.</a> Annu Rev Physiol. 73, 183-211 (2011).</li><li>Schaaf, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+functional+glucocorticoid+receptor+beta-isoform+in+zebrafish.">Discovery of a functional glucocorticoid receptor beta-isoform in zebrafish.</a> Endocrinology. 149, 1591-1599 (2008).</li><li>Schaaf, M. J., Chatzopoulou, A., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+system+for+glucocorticoid+receptor+research.">The zebrafish as a model system for glucocorticoid receptor research.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 153, 75-82 (2009).</li><li>Alsop, D., Vijayan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+stress+axis:+molecular+fallout+from+the+teleost-specific+genome+duplication+event.">The zebrafish stress axis: molecular fallout from the teleost-specific genome duplication event.</a> Gen Comp Endocrinol. 161, 62-66 (2009).</li><li>Alsop, D., Vijayan, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+programming+of+the+corticosteroid+stress+axis+during+zebrafish+development.">Molecular programming of the corticosteroid stress axis during zebrafish development.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 153, 49-54 (2009).</li><li>Schoonheim, P. J., Chatzopoulou, A., Schaaf, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+an+in+vivo+model+system+for+glucocorticoid+resistance.">The zebrafish as an in vivo model system for glucocorticoid resistance.</a> Steroids. 75, 918-925 (2010).</li><li>Weger, B. D., Weger, M., Nusser, M., Brenner-Weiss, G., Dickmeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Chemical+Screening+System+for+Glucocorticoid+Stress+Hormone+Signaling+in+an+Intact+Vertebrate.">A Chemical Screening System for Glucocorticoid Stress Hormone Signaling in an Intact Vertebrate.</a> ACS Chem Biol. 7, (2012).</li><li>Hirota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+biology+approach+reveals+period+shortening+of+the+mammalian+circadian+clock+by+specific+inhibition+of+GSK-3beta.">A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20746-20751 (2008).</li><li>Birmingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+methods+for+analysis+of+high-throughput+RNA+interference+screens.">Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens.</a> Nat Methods. 6, 569-575 (2009).</li><li>Warnes, G. R., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Liaw, W. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> gplots: Various R programming tools for plotting data. 2.11.0, (2012).</li><li>Carey, V., Redestig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ROC: utilities for ROC, with uarray focus. , (2013).</li><li>Fan, F., Wood, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+assays+for+high-throughput+screening.">Bioluminescent assays for high-throughput screening.</a> Assay Drug Dev Technol. 5, 127-136 (2007).</li><li>Graf, S. F., Hotzel, S., Liebel, U., Stemmer, A., Knapp, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+fluidic+sorting+system+for+automated+Zebrafish+egg+sorting+into+multiwell+plates.">Image-based fluidic sorting system for automated Zebrafish egg sorting into multiwell plates.</a> J Lab Autom. 16, 105-111 (2011).</li><li>Letamendia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+an+automated+high-throughput+system+for+zebrafish+in+vivo+screenings.">Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings.</a> PLoS ONE. 7, e36690 (2012).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Presentamos aquí el flujo de trabajo y el análisis de datos para una pantalla de medición de la actividad química GC in vivo utilizando el ensayo DE GRIZLY 18. El ensayo tiene características de control de calidad y medidas de desempeño que son comparables con las pantallas convencionales basados ​​en células, una ventaja importante para su uso en entornos de alto rendimiento. Además, sin embargo, el ensayo in vivo que detecta también compuestos que no son accesibles a las pantallas in vitro. Esto se ejemplifica por la presencia de la pregnenolona prohormona entre los accesos. Por lo tanto, el ensayo DE GRIZLY amplía el ámbito de las pantallas destinadas a la actividad de señalización GC. La importancia de la detección de efectos in vivo con nuestro ensayo también se ilustra por los resultados que obtuvimos con el DBT contaminantes orgánicos del estaño y OTC 18. DBT, pero no OTC, se ha demostrado que inhibe la señalización de GC en el cultivo de células de mamífero, y se observó la misma en cultivos de células de pez cebra expresarción del GRE: Luc reportero. Es importante destacar sin embargo, en el ensayo de DE GRIZLY, OTC mostró actividad inhibidora sobre la vía GC, ya que se puede convertir a la TDC por el metabolismo de las larvas. Esta inhibición se observó ya en concentraciones de relevancia ambiental de OTC. Estos resultados ilustran adicionalmente el potencial del ensayo DE GRIZLY en la detección de los efectos del compuesto sobre la base de entre órganos de diafonía y metabólicas modificaciones de los compuestos en la animal vivo. También destacan el potencial de aplicación de la prueba DE GRIZLY para el monitoreo ambiental. Por lo tanto, los efectos disruptores endocrinos pueden ser estudiados a nivel de la señalización del receptor, donde el disruptor interfiere con la actividad de señalización de GC inducida por un agonista de GR, tales como dexametasona. Otra posibilidad es estudiar los efectos del compuesto sobre la síntesis de pregnenolona GC-estimulado. La alta calidad de rendimiento del ensayo deberá permitir la detección rápida de librerías de muestras del medio ambiente. El uso de luciferasa como ARgen iverwood permite un alto rango dinámico de detección de la actividad de señalización 23. De hecho, la sensibilidad del ensayo hace posible la detección de la producción osmótica GC inducida por el estrés de larvas única 18. La alta resolución temporal logrado con el indicador de luciferasa nos permite seguir las actividades de señalización a través del tiempo, lo que hace posible analizar también la cinética de los datos. Un posible inconveniente para algunas aplicaciones es la idoneidad limitada para la vigilancia espacial de este sistema reportero. Los sistemas indicadores fluorescentes pueden ser más adecuados para ensayos que requieren vigilancia de determinadas áreas de las larvas. Sin embargo, tales ensayos pueden sufrir de sensibilidades inferiores debido a los efectos de fondo causado por la luz de excitación, que también plantea límites a la detección de compuestos fluorescentes. Además, se pueden proporcionar menos resolución cinética debido a la generalmente mayor estabilidad de las proteínas fluorescentes 23.Además, presentan desafíos en términos de equipos de imagen, análisis de datos y de almacenamiento de datos que podrían limitar su uso para los laboratorios de investigación más pequeños. La puesta a punto del ensayo DE GRIZLY como un ensayo basado en la placa de microtitulación permite una fácil integración en los flujos de trabajo de detección típicos. El ensayo es fácilmente aplicable también en los laboratorios de investigación más pequeños debido a su sencillo manejo y análisis de datos. Al mismo tiempo, permite un grado sustancial de automatización, por ejemplo, automatizado aplicación del fármaco pipeteando los robots o distribución automatizada de embriones por la clasificación de embrión de dispositivos de 24,25. El simple lectura no requiere microscopios automatizados de prueba o un sofisticado software de análisis de imágenes, sin embargo, proporciona un rico conjunto de datos sobre los aspectos temporales y cuantitativos de la vía de señalización estudiadas. En resumen, se presenta un protocolo paso a paso para un ensayo relativamente barato, robusto y fácil de manejar detección química para GCseñalización actividad in vivo y en tiempo real. El ensayo permite la determinación de los efectos in vivo de los compuestos sobre GC señalización no detectable en el cultivo de células basadas en ensayos. Entre las muchas aplicaciones para el ensayo se encuentran por ejemplo, la determinación de los efectos genéticos sobre la señalización de glucocorticoides, la vigilancia del medio ambiente de los efectos disruptores endocrinos sobre la síntesis de glucocorticoides y la actividad de señalización, y el cribado de compuestos para los efectos no deseados sobre la señalización de GC o de novela en moduladores vivo de este vía de señalización importante.

Los glucocorticoides (GCS) son hormonas esteroides producidas por la glándula suprarrenal, que desempeñan un papel importante durante la respuesta al estrés y en la regulación del metabolismo de la 1. GC se unen a receptores de glucocorticoides citoplasmáticos (GRS) de la superfamilia de receptores nucleares que, tras la unión, translocan al núcleo 2. Aquí, se puede por ejemplo reprimir la transcripción al interferir con otros factores de transcripción (transrepresión) o activar la transcripción de genes a través de elementos de glucocorticoides de respuesta (Gres, transactivación.) Debido a sus propiedades anti-inflamatorias, GC, tanto naturales y artificiales se utilizan ampliamente fármacos en el tratamiento de un número de enfermedades, tales como asma o artritis 3. Sin embargo, sobre todo el uso a largo plazo de la GC puede dar lugar a efectos secundarios graves, como la diabetes y el glaucoma 4. Por lo tanto, los nuevos compuestos dirigidos GC señalización con la eficiencia del tratamiento potencialmente más beneficiosa y la tolerancia son muy buscados en popaer. Es importante destacar que los efectos de ligandos observados en las células cultivadas pueden diferir de los que se observan in vivo 5. Tales efectos pueden sesgar los resultados obtenidos con el cultivo celular convencional basada ensayos de cribado farmacéuticas. Química screening in vivo como habilitado por el modelo de pez cebra ha entrado recientemente en el foco, ya que permite la determinación de los efectos no detectables en el cultivo celular 6,7. Vías de señalización hormonales también pueden verse afectadas por contaminantes ambientales. Los llamados productos químicos disruptores endocrinos (EDC) afectan a diversas hormonas reguladas procesos 8. Por lo tanto, la reproducción y la diferenciación sexual de los organismos acuáticos pueden ser moduladas por las sustancias con actividades similares al estrógeno. Recientemente, han surgido preocupaciones de que los trastornos metabólicos podrían estar vinculados a las SAE en el medio ambiente 9. Una vía de los objetivos de tales &quot;interrupción metabólica&quot; es la vía de glucocorticoides, que también ha sido implicado en Xenoefectos bióticos sobre el desarrollo y la función inmune 10,11. Sin embargo, en comparación con la gran cantidad de información disponible sobre los compuestos que interfieren con la acción de la hormona esteroide sexual, se sabe relativamente poco acerca de los efectos endocrinos interrupción mediadas a través de la GR. Por lo tanto, se necesitan herramientas que permitan el seguimiento de los efectos contaminantes de la señalización de GC in vivo. El pez cebra ha sido durante mucho tiempo un modelo popular en la biología del desarrollo y también ha atraído más recientemente los investigadores de otros campos, incluyendo la endocrinología 12. En comparación con otros teleósteos, el sistema de señalización de GC de pez cebra es más similar a la de los mamíferos, ya que el pez cebra genoma contiene sólo un gen GR en oposición a los receptores de la duplicación en muchas otras especies de peces 13-15. Además, el eje hipotálamo-pituitaria-adrenal ya es funcional en 5 días de edad larvas de pez cebra, que aumentan la producción de GC endógena en respuesta a factores de estrés 14,16-18. Hemos generado recientemente una línea transgénica de pez cebra, GRE: Luc, que permite la monitorización de la actividad de señalización de GC in vivo y en tiempo real 18. La línea lleva un constructo reportero gen de la luciferasa bajo el control de un promotor mínimo caja TATA y cuatro GRE concatemerized (Figura 1A). GC bioluminiscencia inducida puede medirse a partir de un solo GRE: larvas de Luc en 96 placas de microtitulación bien in vivo durante períodos prolongados de tiempo. Este ensayo DE GRIZLY (para &quot;glucocorticoides de respuesta en vivo Pez Cebra Luciferase actividad&quot;) se puede utilizar en un número de diferentes campos de investigación, como la investigación del estrés, control del medio ambiente, y las pantallas farmacológicas 18. Hemos sido capaces de detectar el aumento en el cortisol endógeno después de estrés osmótico a partir de larvas individuales y podríamos seguir la maduración de la respuesta durante el desarrollo. Por otra parte, podríamos monitorizar los efectos sobre la GC señalización de organoestaños que requieren la metabolización por la larva. Es importante destacar que la línea fue capaz de detectar estos efectos a concentraciones ambientales relevantes. Por último, en una pantalla de piloto el ensayo de sensibilidad y detecta específicamente compuestos con actividad de GC a partir de una biblioteca química, incluyendo un compuesto que estimula la producción de cortisol endógeno en las larvas. Aquí se describe un protocolo detallado para pantallas químicas utilizando el ensayo DE GRIZLY.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buffer composition + reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDA approved drug library</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-2841-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiprobe II</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>8 channel, equipped with disposable tip adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquidator 96</td>
			<td>Steinbrenner Laborsysteme</td>
 <td></td>
			<td>hand-operated 96-channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision XCite Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with stacker automation, temperature control, barcode reader and enhanced luminescence detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasticware + consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Storage Plate</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-0765</td>
			<td>round well, 0.8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover films,</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>6018412</td>
			<td>self adhesive, DMSO resistent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Steinbrenner Laborsysteme</td>
			<td>LRF-200L</td>
			<td>for liquidator 96, 200 &#956;l, low retention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TopSeal-A</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPlate-96</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005299</td>
			<td>white opaque 96-well microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode Labels</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1608182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered polypropylene IsoTip pipette tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>S058.4809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRE:Luc fish</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ZDB-TGCONSTRCT-120920-1</td>
			<td>available at the European Zebrafish Resource Centre EZRC, Karlsruhe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chemical screening procedure for glucocorticoid signaling with a zebrafish larva luciferase reporter system

Hormonas del estrés de glucocorticoides y sus derivados artificiales se utilizan ampliamente las drogas para tratar la inflamación, pero el tratamiento a largo plazo con glucocorticoides pueden dar lugar a efectos secundarios graves. Se necesitan sistemas de ensayo para buscar nuevos compuestos que influyen en la señalización de glucocorticoides in vivo o para determinar los efectos no deseados de los compuestos sobre la vía de señalización de glucocorticoides. Hemos establecido un ensayo de pez cebra transgénico que permite la medición de la actividad de señalización de glucocorticoides in vivo y en tiempo real, el ensayo de DE GRIZLY (glucocorticoides reactivas in vivo la actividad de luciferasa de pez cebra). El ensayo basado en la luciferasa detecta efectos en la señalización de glucocorticoides con alta sensibilidad y especificidad, incluyendo los efectos de compuestos que requieren metabolización o afectan la producción de glucocorticoides endógena. Presentamos aquí un protocolo detallado para la realización de pantallas químicas con este ensayo. Se describe la adquisición de datos, la normalización yanálisis, poniendo énfasis en el control de calidad y la visualización de datos. El ensayo proporciona una lectura sencilla, resuelta en el tiempo, y cuantitativo. Puede funcionar como una plataforma independiente, pero también se puede integrar fácilmente en flujos de trabajo de selección de alto rendimiento. Es, además, permite muchas aplicaciones más allá de la detección química, como la vigilancia del medio ambiente de los perturbadores endocrinos o los estudios sobre el estrés.

En una publicación anterior 18, que exhibió una biblioteca de 640 fármacos aprobados por la FDA en una pantalla de piloto para evaluar el rendimiento del ensayo de DE GRIZLY. Esta biblioteca contiene 12 bona fide GC, lo que nos permite determinar las medidas de calidad para la sensibilidad y especificidad de la prueba. La figura 2 muestra ejemplos típicos de los análisis de los datos en bruto y la normalización tomado de esta pantalla. Un resultado típico de un control de dexametasona así se representa en la figura 2a, que ilustra la información temporal dada por los datos. Un pico en la bioluminiscencia que se produce en alrededor de 12 horas después del tratamiento disminuye lentamente durante el siguiente 36 horas de medición. Figura 2a &#39;pone de relieve la aproximación del valor AUC utilizando el método trapezoidal. Este cálculo se lleva a cabo para todos los pocillos y cada repetición técnica. El resultado de la transformación de registro se muestra en las Figuras 2b &lt;/ Strong&gt; y b &#39;. Aquí, la media de los controles positivos se trazan en un gráfico normal de QQ. Transformación logarítmica conduce a una mayor aproximación de los puntos de datos a los valores teóricos distribuidos normalmente indicados por las diagonales rojas. Una transformación para lograr la normalidad de los datos aumenta la potencia estadística de los análisis posteriores. Por último, las figuras 2c y 2c &#39;muestran el efecto de la normalización robusta Z-score en la variabilidad de placa a placa: Los diferentes valores de referencia obtenidos con diferentes placas (Figura 2c) se normalizan en el robusto parcela Z-score en la figura 2c. Los valores de puntuación z robustos se pueden utilizar para identificar errores sistemáticos en los datos mediante la visualización de la distribución de los accesos a través de las placas. Figura 3a muestra un ejemplo de un mapa de calor de una placa de biblioteca, en la que el robusta puntuación Z Values se representan codificados por colores en las posiciones de los pocillos. Uno se identifica con facilidad la columna 12 con los controles positivos en forma de placa. Compuestos de la biblioteca de puntuación positivos se ven en F8 bien y, aunque más débil,. E2 Figura 3b muestra una placa en la que un error sistemático está presente. Se observa una serie de compuestos con la disminución de los valores de Z-score en las filas A y E a través de varias columnas. Ninguno de los compuestos en estos pozos se dio positivo en la repetición de la prueba. Dado que los pozos con esta disminución de la actividad de prueba DE GRIZLY se colocan a lo largo de la trayectoria del robot de pipeteo toma cuando alícuotas de las placas de la biblioteca, este patrón es indicativo de arrastre de un compuesto positivo durante el proceso de pipeteo automatizado. La robusta normalización Z-score junto con la presencia de GC conocidos en la biblioteca también nos permitió calcular un receptor de funcionamiento característico (ROC) para la pantalla 18. Figura 3c muestra un gráfico de la estimaciónacoplado verdadera tasa positiva frente a la tasa de falsos positivos estimada para diferentes valores de corte Z-score robustos. La verdadera tasa positiva estimada se define como el porcentaje de verdaderos positivos hits (en este caso, los glucocorticoides conocidos presentes en la biblioteca) que se encuentran en un punto de corte Z-score robusta dado. La tasa de falsos positivos estimada correspondiente indica el porcentaje de compuestos no positivos golpeó en este valor de corte. El AUC de esta curva es 0,95, lo que indica una alta sensibilidad y especificidad de la pantalla y excelente rendimiento del ensayo. La curva AUC también se utilizó para estimar el valor óptimo de corte para la identificación de golpe en el cálculo del índice de Youden para diferentes valores Z robustos. Identificamos la robusta Z-score de 1.49 por tener el más alto índice de Youden. Este valor de corte se indica en la figura 2c &#39;como una línea de negro que separa los éxitos de la mayor parte de los compuestos. En nuestra pantalla18, que fueron capaces de identificar los GC casi todas conocidas, presentes en la biblioteca. Sólo tres de los 12 GCs de buena fe, no se detectaron. En el caso del acetato de melengestrol, este fue un hallazgo negativo falso, ya que este compuesto dio positivo en la repetición de la prueba a una concentración más alta que la utilizada en la biblioteca. Los otros dos GCs fueron negativos también en la repetición de la prueba. La corticosterona es el principal GC en roedores, pero no en el pescado o los seres humanos 1, mientras que la prednisona profármaco puede no ser metabolizado así por el sistema de larvas. Curiosamente, también dos medicamentos no anotado como los GC fueron identificados en la pantalla, de las cuales una no se pudo confirmar en el re-test (espironolactona, un antagonista de los receptores de mineralocorticoides). El otro compuesto, pregnenolona, ​​es un precursor en la biosíntesis de esteroides, que se convierte en cortisol por la glándula suprarrenal. De hecho, el tratamiento con pregnenolona estimuló la producción de cortisol en las larvas 18. Todos estos resultados confirman la alta performance del ensayo: sólo un falso negativo y un compuesto de falsos positivos fueron algunos de los resultados de la pantalla principal, y 10 de los 11 compuestos confirmados con actividad estimulante de la señalización de GC ya se identificaron en la pantalla principal. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50439/50439fig1.jpg" /> Figura 1. Principio general del ensayo y el flujo de trabajo del procedimiento de selección. A) Esquema de la construcción reportera DE GRIZLY ensayo. Luciferasa (amarillo) expresión está controlada por un promotor mínimo (P min, naranja) y cuatro elementos concatemerized GRE ((GRE) 4, blanco), que están obligados por homodímeros GR activados por ligando (GR, azul). Red de cajas indican los sitios de transposasa Tol2 que facilitan la integración de la construcción en el genoma. La caja de color rosa representa un sitio de poliadenilación (pA). Larvas transgénicas portadoras este contextostruct se colocan en placas de 96 pocillos de microtitulación opacos para las mediciones de bioluminiscencia. b) Esquema de la reacción de la luciferasa. La luciferasa cataliza la oxidación de luciferina a oxiluciferina, lo que conduce a la emisión de luz (hv). La reacción requiere también de ATP y Mg 2 +, que es proporcionada por la larva. I PP, pirofosfato. C) Flujo de trabajo de la pantalla. Trabajar diluciones se preparan a partir de acciones aprobado por la FDA biblioteca de fármacos en placas de 96 pocillos, una columna que contiene una negativa dentro de la placa de control (sólo DMSO, verde) y una columna que contiene un control positivo (dexametasona, rojo) (diseño de la biblioteca). GRE: Luc larvas se distribuyen en placas de 96 pocillos (5-11 repeticiones) y se trató con los compuestos de la biblioteca (aplicación de la droga). Rastros de bioluminiscencia se registran con un lector de bioluminiscencia durante dos días (recolección de datos). Rastros de bioluminiscencia se integran (los cálculos de las AUC), log transformados y robusto Z-score normalizaron (normalización). Los datos normalizados se utilizan para determinar las métricas de calidad y para la identificación de golpe (análisis de datos). Éxitos elegidos son reexaminados para la actividad dependiente de la dosis en el ensayo (retest). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50439/50439fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50439/50439fig2.jpg" /> Figura 2. El análisis de datos se ilustra con los datos de una pantalla de un FDA aprobó biblioteca de medicamentos. a) traza Representante de un pocillo de control positivo. a &#39;) El área bajo la curva (AUC) se aproxima con la regla del trapecio. Los trapecios utilizados para el cálculo se muestran en distintos tonos de rojo b) normal QQ plot de los valores brutos de las AUC de los pocillos de control positivo (eje y) frente a una población (eje x normal estándar) antes de la transformación logarítmica. B &#39;. )<html> Normal QQ plot de los valores de AUC después de la transformación logarítmica. Una distribución normal se indica mediante la linealidad de los puntos de datos transformados logarítmicamente. C) representación gráfica de log transforma los datos en bruto para todos los compuestos ensayados en la pantalla. Azul, de buena fe los glucocorticoides;. Gris, todos los demás compuestos c &#39;) Parcela de datos de la pantalla después de robusta normalización Z-score. Los errores sistemáticos, tales como las variaciones entre las placas se han eliminado de los datos. Las líneas rojas indican la media ± sem de los controles positivos dentro de la placa. Línea de Negro: valor de corte de identificación golpear según lo determinado por Youden-Índice de optimización (Figura 3). Reproducido con permiso de 14, 2012 de ACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50439/50439fig2large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . 0439fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Resultados de pantalla. a) Mapa de calor de los resultados de la pantalla. Valores de Z-score robustos de compuestos de la biblioteca se trazan en las posiciones respectivas así. Los controles positivos en la columna 12, así como dos compuestos de ataque positivos en pozos F8 y E2 son visibles. B) Mapa de calor de una placa con el traspaso de un compuesto positivo durante la preparación de la biblioteca con un robot de pipeteo. Un gradiente de actividad es visible a lo largo de la trayectoria de pipeteado tomada por el robot. C) características operativas del receptor ROC) curva (para la pantalla. Los verdaderos índices estimados positivos (eje-y de la mano izquierda) y tasas de falsos positivos (eje x) se trazan para aumentar los valores de corte robustos Z-Score (un código de color, la mano derecha del eje Y). El valor de AUC de la curva resultante está cerca de 1, lo que indica un buen rendimiento de ensayo. Reproducido con permiso de 14, 2012 de ACS. D) Tabla que muestra los compuestos activos (yellow) o inactiva (azul) en la pantalla principal (prim.) o en el retest. glucocorticoides Bona fide no siempre fueron reexaminados (blanco). Reproducido con permiso del 14 de 2012 ACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50439/50439fig3large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4"> Configuración general: </td></tr><tr><td colspan="4"> Paso 1.1 </td></tr><tr><td> Procedimiento </td><td> tipo: </td><td colspan="2"> líquido sola </td></tr><tr><td></td><td> modo: </td><td colspan="2"> apagar </td></tr><tr><td></td><td> dispensa por aspirado: </td><td colspan="2"> 1 </td></tr><tr><td></td><td> para optimizar la velocidad: </td><td colspan="2"> Sí </td></tr><tr><td></td><td> sistema de bolsas de aire: </td><td colspan="2"> 10 l </td></tr><tr><td></td><td> transporte: </td><td colspan="2"> 0 </td></tr><tr><td> Flush / Wash </td><td colspan="3" width="426"> No </td></tr><tr><td> Aspirado </td><td> Tipo de establecimiento </td><td> Valor </td><td> Observaciones </td></tr><tr><td></td><td> Posición </td><td> B7, B10, B13, B16 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Aspirar vol. </td><td> 10 l </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Velocidad </td><td> 200 l / seg </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Seguimiento Liquid </td><td> 60% </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Aspirar Altura </td><td> Labware defecto </td><td> 22.28 </td></tr><tr><td> Dispensar </td><td> Tipo de establecimiento </td><td> Valor </td><td> Observaciones </td></tr><tr><td></td><td> Posiciones </td><td> D7, D10, D13, D16 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dispense vol. </td><td> 10 l </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Velocidad </td><td> 200 l / seg </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Seguimiento Liquid </td><td> 100 l </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dispense Altura </td><td> Labware defecto </td><td> 17.01 </td></tr><tr><td colspan="4"> Paso 1.2 </td></tr><tr><td> Procedimiento </td><td> tipo: </td><td colspan="2"> reactivo </td></tr><tr><td></td><td> modo: </td><td colspan="2"> residuos </td></tr><tr><td></td><td> dispensa por aspirado: </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td></td><td> para optimizar la velocidad: </td><td colspan="2"> Sí </td></tr><tr><td></td><td> sistema de bolsas de aire: </td><td colspan= &quot;2&quot;&gt; 15 l </td></tr><tr><td></td><td> transporte: </td><td colspan="2"> 0 </td></tr><tr><td colspan="2"> Flush / Wash </td><td colspan="2"> No </td></tr><tr><td> Aspirado </td><td> Tipo de establecimiento </td><td> Valor </td><td> Observaciones </td></tr><tr><td></td><td> Posición </td><td> A4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Aspirar vol. </td><td> 3 x 490 l </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Los espacios de aire </td><td> 15 y 0 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Velocidad </td><td> 200 l / seg </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Seguimiento Liquid </td><td> 400% </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Aspirar Altura </td><td> Superficie del líquido </td><td></td></tr><tr><td> Dispensar </td><td> Tipo de s<html> rocedimien </td><td> Valor </td><td> Observaciones </td></tr><tr><td></td><td> Posición </td><td> D7, D10, D13, D16 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dispense vol. </td><td> 490 l </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Los espacios de aire </td><td> 15 y 0 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Velocidad </td><td> 200 l / seg </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Seguimiento Liquid </td><td> 100% </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dispense Altura </td><td> Labware defecto </td><td> 17.01 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Ajustes para Multiprobe II. El protocolo en la Tabla 1 describe la preparación de 4 platos (cada 96 pozos). Las placas están situadas en adaptadores de placas en el área de trabajo en posiciones especificadas por el robot (por ejemplo, B7, B10, B13, B16). <html> 1 &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="4"> Configuración general: </td></tr><tr><td colspan="2"> Número de repeticiones de ensayo </td><td colspan="2"> depende de la longitud de la carrera </td></tr><tr><td colspan="2"> Número de placas </td><td colspan="2"> ilimitado </td></tr><tr><td colspan="2"> Control de la temperatura </td><td colspan="2"> 28 ° C </td></tr><tr><td colspan="2"> Protocolo </td><td colspan="2"> Cálculos </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> EE.UU. Lum 96 (cps) leer </td></tr><tr><td></td><td> Tiempo de medición </td><td> 2.5 seg </td><td rowspan="3"> Corrección Crosstalk </td></tr><tr><td></td><td> Distancia entre la placa y el detector </td><td> 0 mm </td></tr><tr><td></td><td> Glow (CT2) factor de corrección </td><td> 0% </td></tr></tbody></table>contenido &quot;&gt; Tabla 2. configuración EnVision utilizados para la pantalla.

Watch this Scientific Journal Video about A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System at JoVE.com

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System | Biology  | Video

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Se describe el procedimiento y el análisis de datos de un sistema de detección química para la señalización de glucocorticoides hormona del estrés usando larvas de pez cebra: la de respuesta en vivo Pez Cebra actividad luciferasa (DE GRIZLY) ensayo de glucocorticoides. El ensayo sensible y específicamente detecta efectos en la señalización de glucocorticoides por compuestos que requieren metabolización o afectan la producción de glucocorticoides endógena.

Un procedimiento de detección química de glucocorticoides Señalización con un sistema indicador de pez cebra Larva luciferasa

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

a-chemical-screening-procedure-for-glucocorticoid-signaling-with

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Human Biology

Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

11.8K vistas.  Karlsruhe Institute of Technology - Campus North.  Se describe el procedimiento y el análisis de datos de un sistema de detección química para la señalización de glucocorticoides hormona del estrés usando larvas de pez cebra: la de respuesta en vivo Pez Cebra actividad luciferasa (DE GRIZLY) ensayo de glucocorticoides. El ensayo sensible y específicamente detecta efectos en la señalización de glucocorticoides por compuestos que requieren metabolización o afectan la producción de glucocorticoi...

Video: A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

El estudio de biogénesis de la membrana con un ensayo de luciferasa basado en genes

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Investigación

Biología

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

Desarrollo de la imagen y el análisis automatizado de pantallas de química de pez cebra.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Etiquetado linaje de células de pez cebra con láser Uncagable fluoresceína Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

Objetivos la identificación de los microARN humanos con el sistema de ensayo con luciferasa LightSwitch reportero 3&#39;UTR-Construye y microRNA un imitador de las células adherentes

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa Homemade

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

RNA catalizador como reportero para rastrear fármacos contra ARN de edición en tripanosomas

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Transfectar células RAW264.7 con un gen informador de luciferasa

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Multienzimático de detección sistemática mediante un sistema de cribado genético de la enzima de alto rendimiento

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...