Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la intervención terapéutica inmunosupresora para estudiar los efectos adversos de los fármacos en la regeneración tisular, en particular, en los huesos. La principal ventaja de esta técnica es que combina modelos anteriores de regeneración ósea de peces zebra con la exposición sistémica a fármacos por inmersión del pez cebra lesionado en agua de pescado suplementada con fármacos. Antes de comenzar el procedimiento, el autoclave de una lámina de aluminio cubrió un vaso de precipitados de 600 mililitros por pez cebra y un número adecuado de botellas de vidrio de agua de pescado para el experimento y preparar el fármaco inmunosupresor en soluciones de control experimental de interés.
Para una lesión de amputación, utilice fórceps contundentes para colocar cuidadosamente un pez cebra anestesiado en su lado lateral en la tapa inversa de una placa Petri de 100 milímetros y utilice un bisturí para resecar el 50% de la aleta. A continuación, coloque el pescado en un vaso de precipitados autoclavados que contenga 300 mililitros de agua de pescado complementado con un agente experimental adecuado y cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio para evitar la fuga de peces Zebra. Para inducir una lesión por fractura de aleta, coloque un pez cebra anestesiado en su lado lateral en una placa Petri recubierta de agarosa de 100 milímetros bajo un microscopio diseccionador y empuje una aguja de inyección ligeramente en un segmento de rayos de aleta ósea hasta que aparezca una grieta.
Es importante introducir no demasiadas fracturas en la aleta porque esto podría afectar en gran medida la estabilidad. A continuación, transfiera el pescado a un vaso de precipitados autoclavados que contenga 300 mililitros de agua de pescado complementado con el agente experimental adecuado. Para generar una lesión craneal calvarial, sostenga un pez cebra anestesiado en posición vertical para que los huesos calvariales se visualicen fácilmente bajo un microscopio de disección.
Coloque un micro taladro giratorio equipado con una broca de 500 micrómetros sobre el centro del hueso frontal y toque suavemente el hueso para producir un agujero del tamaño de la rebaba de micro taladro. Es fundamental no mover el taladro lateralmente mientras se produce la lesión y detenerse inmediatamente una vez que la resistencia del tejido cae. De lo contrario, el cerebro se dañará.
A continuación, coloque el pescado en un vaso de precipitados autoclavados que contenga 300 mililitros de agua de pescado complementado con el agente experimental adecuado. Cambie el agua de los vasos diarios transfiriendo el pez cebra y el agua de pescado a un recipiente temporal adecuado y rellenando el vaso de precipitados con agua de pescado suplementada con medicamentos frescos. A continuación, utilice una red de peces para devolver el pez cebra a su vaso de precipitados.
Para tratamientos que dure hasta dos días en total, no alimente el pez cebra. Durante experimentos más largos, alimente el pez cebra con 0,5 a un mililitro de SSP de Artemia incubada cada segundo día. Para el análisis de lesiones de aleta, cosecha la fina y usa fórceps finos para agarrar la aleta en un borde del muñón.
Utilice un segundo par de fórceps para agarrar el borde opuesto del muñón y presione ligeramente el tejido en la parte inferior de la placa que contiene frío 4%PFA durante 10 a 20 segundos. Repita el aplanamiento de la aleta según sea necesario. La aleta ahora debe estar plana sin rizar.
Para el almacenamiento de muestras a largo plazo después de la fijación, lave el tejido con tres lavados PBS de 20 minutos y una serie de metanol ascendente. Las muestras se pueden almacenar en 100% metanol a menos 20 grados Celsius. Para la tinción de Alizarin Red, rehidrate las muestras almacenadas de metanol en una serie descendente de metanol seguida de dos lavados de 20 minutos en PBS y un lavado de cinco minutos en agua desionizada.
Después del último lavado, añadir Alizarin Red solución al tejido de la muestra e incubar la muestra a temperatura ambiente con balanceo durante el período de tinción adecuado. Para eliminar las muestras, trate el tejido con la serie de 1%de glucógeno de hidróxido de potasio decreciente. A continuación, almacene las muestras en una solución de glucóxido de uno a uno a 0,1% de potasio a 80%y monte los tejidos con 80% de glicerol para imaginar.
Para la tinción de Calcein, incubar hasta tres peces Zebra simultáneamente en 100 milímetros de solución de Calcein durante 20 minutos en un vaso de precipitados de vidrio cubierto con papel de aluminio. Al final de la incubación, transfiera el pez cebra a un recipiente de agua de pescado y deje que los peces naden brevemente antes de transferirlos a un nuevo contenedor de agua de pescado. Después de 20 minutos en el segundo vaso de precipitados para adquirir imágenes en vivo de regeneraciones de aleta, coloque un pez cebra anestesiado en un plato de Petri recubierto de agarosa e imagine la aleta mediante microscopía estéreo.
Para adquirir imágenes de los huesos del cráneo regenerador, coloque el pez cebra en posición vertical en una esponja e imagine el cráneo por microscopía de fluorescencia. El tratamiento con Prednisolona, similar a otros glucocorticoides, conduce a una inhibición general de la regeneración de las aletas, incluida la formación ósea detectada por la tinción roja de Alizarin del tejido de aleta caudal fijo. Del mismo modo, la droga tiene efecto de retraso en el cierre de la lesión del cráneo calvarial.
Debido a la inmunosupresión, la inmunohistoquímica también puede detectarse reduciendo el número de macrofagos en secciones de tejido congelado, como lo demuestra el uso de tinción de anticuerpos anti-mCherry y anti-GFP y mpeg-1 mCherry transgénico cruzado con Osterix NGFP Zebrafish en muestras de tejido craneal de pez cebra de animales tratados con Prednisolona. Al intentar estos procedimientos es importante minimizar la variabilidad en la velocidad de regeneración ósea mediante la realización de los ensayos de lesiones de una manera altamente reproducible. También es crucial para una sola casa Zebrafish en vasos autoclaves que contienen agua de pescado autoclavado con el fin de evitar la infección microbiana.
Este protocolo ayudará a abordar aún más los mecanismos subyacentes de la acción glucocorticoides. Por ejemplo, en el contexto de la osteoporosis inducida por glucocorticoides y también puede adaptarse para el uso de otros fármacos y otros huesos de peces cebra.
