<p class="jove_content"&gt; Damos las gracias a Nadeshda Wolf, Eschen Nadine y Delong Susanne para la ganadería excelente. CW fue apoyado por una beca de doctorado en el programa &quot;Helmholtz<em&gt; BioInterfaces</em&gt; International Graduate School (BIFIGS). El apoyo adicional fue proporcionada por una donación de KIT-RISC y por una Marie Curie Internacional Reintegración de subvención dentro del 7 º Programa Marco de la Comunidad Europea (PIRG07-GA-2010-267,552) al GC. AHS fue apoyada por BOLD (Biología del hígado y el páncreas y el Desarrollo de Enfermedades) - Marie Curie Initial Training Network (238.821). UL fue apoyada por Dopaminet 7PM (Séptimo Programa Marco) (223.744).</p&gt;

1. Manejo de animales Para el ensayo de Chin uso 3 fdd larvas resultantes de los apareamientos de grupo entre homocigotos cldnB doble transgénico :: GFP / lysC :: DsRed2 AB y el pescado (de tipo salvaje). Recoger embriones por desove natural y criarlos a 29 ° C en medio de E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4 y 0,1% de azul de metileno, se equilibró a pH 7,0) en placas de Petri. Es esencial para mantener una densidad de embriones que no excedan de 50-70 por placa. 2. Larva Clasificación Compruebe que todas las larvas en un estereoscopio de fluorescencia para la expresión del fluorescente, la inflamación espontánea y desarrollo relacionadas con la edad apropiada. 3. Preparación Examen Medio (Siempre prepare fresco) Preparar medio E3 sin azul de metileno suplementado con DMSO (1% final) y MS222 (0,05 g / l). 4. CuSO4Preparación (Siempre prepare fresco) En primer lugar, pesar CuSO 4 (M r = 159,6 g / mol) y preparar una solución madre 20 mM en dH 2 O. Preparar 120 mM CuSO 4 solución de trabajo (de 20 mM de solución de reserva) en E3/DMSO (1%) / 222-MS. Proteger CuSO 4 solución de la luz. 5. 384 y placa de preparación (Greiner 384 pocillos de microplacas) Pre-añaden 20 l de E3/DMSO (1%) / MS 222-a cada pocillo con una pipeta inversa. Un aumento de punta de la pipeta diámetro es necesario para controlar los embriones con cuidado sin causar ningún herido, esto se hace cortando la punta de un orificio de 2 mm. Transferir sola larva en 74 l de medio a cada pocillo (84 l para el control sin tratar). Si es necesario, las larvas de orientarse en una posición lateral en el bien con un sistema flexible de puntas de pipeta Eppendorf Microloader (Eppendorf, 5242 956.003). Llevar a cabo todos los pasos siguientes para manejo de líquidos con un líquido robotel manejo de estación de trabajo para asegurar el tratamiento simultáneo de todas las larvas. 6. Tratamiento de Drogas Mezcle los compuestos de la placa de drogas de valores 5 veces pipeteando arriba y hacia abajo. Añadir 16 l de la placa de 7.5X existencias de medicamentos a cada pocillo y mezclar 5 veces. Ajuste la posición de la punta dentro de los pozos para evitar lesiones de las larvas y dispensar el medio a 10 l / s. Mezclar medio en pocillos 4 veces para asegurar una distribución homogénea del fármaco dentro del pozo. 7. Incubación Incubar la placa de detección de 1 hora a 29 ° C cubierto con papel de aluminio para proteger los compuestos así como CuSO 4 de la luz. 8. Química hiriente Añadir 10 l de 120 mM CuSO 4 solución de trabajo a cada pocillo, excepto con los controles negativos, mezcla de 4 veces y se incuba de nuevo durante 1 hora a 29 ° C. 9. Lavado Retire y el intercambio de 80 l de mí<html> mediano de cada pocillo dos veces (en 20 pasos l) para eliminar los compuestos y CuSO 4. 10. Adquisición de imágenes Iniciar la adquisición de imágenes en un microscopio invertido automatizado (es decir: Olympus exploración ^ R) 90 minutos después del tratamiento inicial de cobre. Ajuste inicial z nivel de manera que neuromastos de derecha e izquierda de la línea lateral posterior son visibles. Imagen de cada pozo una vez por hora en el campo claro los canales, Cy3 y las buenas prácticas agrarias en 4 planos focales (50 m distancia) con un objetivo de 4x (NA = 0,13). Información adicional sobre la imagen y procesamiento de datos están disponibles bajo petición. 11. Procesamiento de Imágenes 1. Los datos de clasificación Las imágenes RAW se procesan con nuestro script personalizado el software LabVIEW. La primera operación en la canalización de procesamiento de imagen es la clasificación de imágenes en bruto del microscopio carpeta de datos generados por el canal, así y la información de punto de tiempo. ove_step &quot;&gt; 2. foco extendido Posteriormente, el software crea extendidos imágenes de enfoque de 4 planos focales para cada uno de los canales. 3. RGB de superposición En un último paso de las imágenes enfoque ampliado de los 3 canales se combinan para dar lugar a un final de RGB-superposición de imágenes. 4. La detección automática neuromast Una herramienta de reconocimiento de patrones (LabView rápida herramienta de prototipado IA) identifica neuromastos dentro de las superposiciones de imágenes RGB y crea un área de interés definida empíricamente en torno a los neuromastos. 5. Cuantificación Dentro del área de interés definida empíricamente que rodea neuromastos heridos rojos leucocitos fluorescentes refleja en forma de píxeles de color rojo) se obtuvo como resultado de una lectura primaria de p orcentaje una razón o por ccupied eukocytes l (Paol). En promedio 95,27 ± 2,11% (FDA1) y 95,12 ±1,56% (FDA2) de pozos (larvas) se han detectado correctamente y posteriormente se han sometido a procesamiento de datos adicional. La salida de datos en bruto (Paol para cada neuromast detectado) se almacena en un archivo txt y sirve como la entrada de datos para las secuencias de comandos de MATLAB que procesan los datos en bruto más. 12. Procesamiento de Datos 1. Imaps Evaluar el éxito de los experimentos individuales mediante la visualización gráfica de la Paol salida de datos en bruto en un código de color puede ser realizado con los mapas de la inflamación llamados (IMAPS) (Figura 2). Verde brillante refleja un alto índice inflamatoria inicial, el negro indica que no hay inflamación. Esta rápida visión general permite la rápida identificación de los experimentos fallidos, que luego pueden ser excluidos de los análisis de datos adicionales. 2. Un promedio de los controles Cada placa contiene 320 compuestos experimentales que refleja unalos datos de un solo punto por compuesto y el tiempo de punto, así como 32 controles positivos y negativos, respectivamente. El control de 32 repeticiones son en promedio y desviación estándar se calcula. Para los controles sólo puntos de datos dentro de 2 desviaciones estándar están incluidos. 3. Normalización La normalización se lleva a cabo mediante el análisis de hoja de cálculo. El valor promedio de DMSO, siendo el control negativo, se pone a 0 y la más alta Paol promediada para el control de cobre se pone a 1, de modo que la diferencia máxima entre el control positivo y negativo se pone a 1. Paol Cada compuesto se interpolados o extrapolados linealmente a los controles respectivos en la placa experimental. 4. Final de lectura: el índice inflamatorio Después de suficientes experimentos replicados (es decir, 15) han llevado a cabo, normalizó los datos brutos de replicar los experimentos se hacen un promedio, lo que resulta en un final de lectura - la respuesta inflamatoriaíndice. El índice inicial inflamatoria del control de cobre comienza a 100% para el tiempo cero punto y se correlaciona a la hora de inicio de adquisición de imagen (90 minutos después del tratamiento inicial de cobre). 5. Ajuste monotónico regresión exponencial Debido a la resolución de la inflamación a través del tiempo se realiza un ajuste monotónico exponencial de regresión no lineal hacia la inflamación inicial mediante el uso de <img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="Ecuación 1" /> - Un 0 es una medida de la respuesta inicial en t = 0, un 1 está relacionada con la pendiente de la magnitud en el tiempo. 6. 2-D función de espacio de parcela (Figura 4) Para generar el espacio de características, una regresión no lineal se aplica y un grupo-análisis divide el espacio de características en regiones características, permitiendo así la identificación automática de candidatos interesantes de diferentes inmuno-moduladores categorías (anti-inflammatteoría, la lucha contra la resolución, pro-inflamatoria, a favor de la resolución). Todos los compuestos se muestran en la parcela 2-D basado en los parámetros de un 0 y un 1. 13. Manipulación y almacenamiento de datos Nuestros datos rutinas de manejo de crear páginas web para visualizar y representar a las pantallas de este tipo de fármacos que proporcionan una visión rápida de la imagen y procesamiento de datos los resultados de los pasos, así como una vista detallada cuando sea solicitado por el usuario 10. Los enlaces blandos a otros relevantes bases de datos heterogéneas biológicas y químicas se integran también para proporcionar un recurso valioso para los estudios comparativos y la novela 11. Por estas rutinas, normas de datos adecuados y metainformación se establecen para el almacenamiento a largo plazo de estos datos. 14. Los resultados representativos En una pantalla de piloto se analizó una biblioteca que consta de 640 aprobado por la FDA conocidos compuestos bioactivos de los efectos en la iniciación, progresión o resolución de una Granulomatosisrespuesta inflamatoria ocytic. Sobre la base de los efectos observados se clasifican 4 tipos de fenotipos moduladores inmunes que pueden ser indicativos de los diferentes modos de acción: anti-inflamatorios (1), anti-resolución (2), pro-inflamatorias (3) y pro-resolución (4) , que puede ser descrito con los parámetros de un 0 y un 1, que surgen de un ajuste de regresión no lineal monotónica (e ao ​​+ alx -) hacia la inflamación inicial. Un 0 representa la magnitud de la respuesta inflamatoria, mientras que un 1 caracteriza a la pendiente de la curva y, por tanto describe la resolución inflamación. Viendo todos los compuestos en una parcela de 2-D característica espacial (un 1 vs un 0) permite la identificación automática de los candidatos de golpe de las categorías moduladores inmunes diferentes (Figura 3). 45 de 640 compuestos ejercida significativo efecto anti-inflamatorio al reducir el índice inflamatorio inicial a 50% o menos. Dentro de this categoría encontramos 6 compuestos pertenecientes a la clase farmacológica de la no-esteroides anti-inflamatorios no esteroideos (AINE), lo que confirma la validez de nuestro enfoque. Sin embargo, los AINE no clasificado entre los más potentes fármacos antiinflamatorios. Aparte de los AINE se encuentran varias clases adicionales de drogas farmacológicas como, por ejemplo, los bloqueadores de los receptores de angiotensina (ARA II), antibióticos e inhibidores de la bomba de protones. 7 compuestos cumplieron con los criterios mínimos definidos empíricamente para los potenciales resolución a favor de las drogas. 18 drogas que ejerce un efecto proinflamatorio, lo que resulta en el reclutamiento de leucocitos exagerada a neuromastos lesionados en comparación con los controles positivos. Sólo dos compuestos impedido la resolución oportuna de la respuesta inflamatoria. El efecto antiinflamatorio de los candidatos afectados varios (candidatos ejemplares desde arriba mencionadas clases de medicamentos farmacológicos) de la pantalla del piloto de could ser confirmada de manera dosis-dependiente en los sucesivos ensayos de Chin secundarias (datos no mostrados). Una segunda prueba de 4 potenciales resolución a favor de las drogas no ha confirmado el modo indicado de acción como ejercida en la pantalla principal. 2 de los fármacos tenían un ligero potencial anti-inflamatorio en concentraciones más altas (20 mM). Un tercer fármaco mostraron una marginal no dependiente de la dosis efecto anti-inflamatorio en concentraciones de fármaco que van desde 5 hasta 20 mM. El cuarto fármaco no tuvo efecto sobre la respuesta inflamatoria a las concentraciones ensayadas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" /> Figura 1. Flujo de trabajo de la prueba de la barbilla. Individual compuesto de transgénicos cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 larvas (3 DPF) se distribuyen manualmente en placas de microtitulación de 384 pocillos. Las drogas se añadieron simultáneamente a cada pocillo utilizando una estación de trabajo compacta Zephyr manejo de líquidos. Las placas de ensayo se incuban a continuación durante 1 hora a 29 ° C. El tratamiento con CuSO 4 </sub&gt; - Solución (10 mM de concentración final) durante 1 h inflige las heridas e inicia una respuesta inflamatoria aguda. Por último, la solución de cobre y las drogas son lavados y la adquisición automática de imágenes se inicia (90 minutos después del tratamiento del cobre inicial). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" /> Figura 2. . Vista general del cuadro de imágenes en bruto La figura muestra las imágenes en bruto de 4 planos focales (Z = 0 - 3) a distancias de 50 m en los canales de Cy3 (izquierda) y las buenas prácticas agrarias (derecha), respectivamente. Las flechas (Z = 1,2) indican neuromastos ejemplares, puntas de flecha (Z = 1,2) apuntan a los leucocitos agrupados en torno a neuromastos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" /> Figura 3. Mapas de la inflamación (IMAPS) El éxito de los experimentos individuales pueden ser evaluadas en imaps que reflejan la respuesta inflamatoria (datos brutos) en un código de colores: verde brillante. Refleja una inflación inicial alta<html> la respuesta involucrados en procesos inflamatorios, el negro indica que no hay inflamación en el punto de tiempo imaps 0 (izquierda) y el tiempo-el punto 5 (derecha) indican claramente si un experimento se debe incluir en la información adicional.. Controles de cobre (fila 13 y 24) se muestran en diferentes tonos de verde, mientras que el control de los pozos de DMSO (fila 1 y 12) aparecen en color verde oscuro o negro. A la hora del punto 5, la inflamación está casi resuelto en los controles de cobre, ahora se indica en tonos oscuros de verde o negro. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" /> Figura 4. 2-D característica gráfica de espacio de 320 compuestos de un FDA aprobó la biblioteca y sus respectivos controles. Todos los pozos compuestos se pueden mostrar en una gráfica característica de 2-D el espacio sobre la base de los parámetros de un 0 y un 1, que surgen de una relación no lineal regresión de ajuste (d/4203/4203eq1.jpg &quot;alt =&quot; Ecuación 1 &quot;/&gt;) hacia la inflamación inicial. Esta parcela espacio de características permite la identificación automática de los candidatos interesantes que pertenecen a uno de los siguientes 4 inmuno-moduladores categorías que pueden ser indicativos de las drogas &#39;modo de acción:. anti-inflamatorio (1), anti-resolución (2), pro-inflamatorias (3) y en favor de la resolución (4) <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> .

<ol>
	<li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish.">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).</li><li>Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+advance:+pharmacological+manipulation+of+inflammation+resolution+during+spontaneously+resolving+tissue+neutrophilia+in+the+zebrafish.">Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).</li><li>Martin, J. S., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+in+vivo+zebrafish+models+to+understand+the+biochemical+basis+of+neutrophilic+respiratory+disease.">Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).</li><li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).</li><li>Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophage+chemotaxis+in+vivo:+studies+of+microtubule+function+in+zebrafish+wound+inflammation.">Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).</li><li>D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+chemically+induced+inflammation+assay+in+zebrafish.">A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish.</a> BMC Biol. 8, 151 (2010).</li><li>Haas, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+signaling+mediates+self-organizing+tissue+migration+in+the+zebrafish+lateral+line.">Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line.</a> Dev Cell. 10, 673-680 (2006).</li><li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciencenet'+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge.">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li><li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvester':+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources.">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

<p class="jove_content"&gt; A continuación les presentamos un sistema totalmente automatizado de alto rendimiento de estrategia de cribado que permita la identificación de compuestos moduladores de la inmunidad en un contexto animal. Lo que permite el seguimiento de una respuesta inflamatoria aguda<em&gt; En vivo</em&gt; Y en tiempo real.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Ofrecemos un protocolo para aplicar el pez cebra como modelo útil para el descubrimiento de fármacos o drogas esfuerzos replanteamiento, ya que los efectos del fármaco sobre el reclutamiento de leucocitos a las heridas pueden ser estudiados con relativa facilidad en el contexto de un completo y funcional del sistema inmune innato. La única ventaja de nuestro enfoque es el hecho de que la herida química hace que la manipulación manual de las larvas obsoleto, lo que permite la automatización y detección en un formato de alto rendimiento.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Por otra parte, efectos adversos del fármaco o tóxico, así como fuertes efectos fuera del objetivo pueden ser fácilmente evaluados con la propuesta de puesta en marcha. La biblioteca aprobado por la FDA sin embargo, no contiene compuestos tóxicos a las concentraciones de cribado. Sin embargo, se propone para el aparentes compuestos tóxicos para comparar el conjunto de datos disponibles (por ejemplo, el fenotipo modulador inmune, la concentración de fármaco) entre los miembros de la misma clase de sustancias farmacológicas presentes en la biblioteca de la prueba. Miembros tóxicos de una familia de sustancias, que de otra forma ejerce un fenotipo prometedor modulador inmune, podría ser sometido a prueba con concentraciones más bajas, si es necesario.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Hemos demostrado la posibilidad de clasificar las drogas de forma automática de acuerdo a su sistema inmune modulador que ejerce efecto. Las drogas que pertenecen a la categoría de compuestos anti-inflamatorios puede ser validado en experimentos independientes, la mayoría de los compuestos que ejercen su efecto de manera dosis-dependiente. Cuatro compuestos identificados como potenciales resolución pro-fármacos así podría no lejos se confirmó como tal. Asimismo, indica que esta categoría especial modulador inmune es difícil de describir, ya que no sólo afectan a las drogas de resolución hasta la fecha han sido descritos en la literatura. Sin embargo, 3 de los 4 medicamentos reanalizada mostró una tendencia anti-inflamatorio en altas concentraciones molares. La optimización de los criterios mínimos definidos empíricamente debería ayudar a reducir el número de falsos positivos.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Además, la técnica presentada ofrece la posibilidad de ser utilizados para la identificación de las mutaciones en los genes que afectan al comportamiento migratorio de leucocitos<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; En conclusión, el método propuesto puede facilitar y acelerar el descubrimiento de fármacos o drogas reutilización de los esfuerzos de obtención de potenciales estructuras de plomo nuevas con la información disponible sobre la tolerancia a las drogas, la toxicidad, la dosis, así como los posibles efectos off-target. Por lo tanto, servir como una estrategia sencilla, económica y ahorro de tiempo en las primeras etapas de desarrollo de fármacos.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td> Cobre (II) sulfato anhidro </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> Aprobado por la FDA biblioteca de drogas </td><td> Enzo Ciencias de la Vida </td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384 placas de micropocillos no vinculante, μClear </td><td> Greiner </td><td> 781906 </td><td> negro </td></tr><tr><td> Olympus exploración R ^ </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zephyr Liquid Compact Manejo de estación de trabajo </td><td> Caliper </td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

facilitating drug discovery: an automated high-content inflammation assay in zebrafish

Larvas de pez cebra son particularmente susceptibles de animal entero pequeña molécula 1,2 pantallas debido a su pequeño tamaño y relativa facilidad de manipulación y observación, así como el hecho de que los compuestos simplemente se puede añadir al agua de baño y se absorben fácilmente cuando se administra en una &lt;1% de DMSO solución. Debido a la claridad óptica de las larvas de pez cebra y la disponibilidad de las líneas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes en los leucocitos, el pez cebra ofrece la ventaja única de seguimiento de una respuesta inflamatoria aguda in vivo. En consecuencia, utilizando el pez cebra de alta contenido pantallas pequeñas moléculas destinadas a la identificación de compuestos inmuno-moduladores con un alto rendimiento se ha propuesto 3-6, lo que sugiere escenarios inflamación de inducción, por ejemplo, muescas localizadas en el tejido de la aleta, el daño láser dirigido a la superficie de la yema embriones de 7 o amputación tailfin 3,5,6. El principal inconveniente de estos métodos sin embargo fueel requisito de la manipulación manual de larvas para inducir la herida, evitando así la selección de alto rendimiento. Introducción de la inflamación inducida químicamente (Chin) ensayo de ocho eliminados estos obstáculos. Desde que se inflige heridas químicamente el número de embriones que pueden ser tratados al mismo tiempo es virtualmente ilimitada. El tratamiento temporal de larvas de pez cebra con sulfato de cobre induce selectivamente la muerte celular en las células ciliadas del sistema de línea lateral y los resultados en la contratación rápida de granulocitos a neuromastos heridos. La respuesta inflamatoria se puede seguir en tiempo real mediante el uso de compuestos transgénicos cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 6,9 larvas de pez cebra que expresan una proteína verde fluorescente en las células neuromast, así como una roja granulocitos fluorescentes etiquetado de proteínas. Con el fin de diseñar una estrategia de cribado que permita a los dos análisis de alto contenido y de alto rendimiento se introdujo el manejo robótico de líquido y micr automatizado combinadooscopy con un guión de software a medida desarrollado. Este script permite la cuantificación automática de la respuesta inflamatoria al anotar el porcentaje de área ocupada por los leucocitos de color rojo fluorescente dentro de un área definida empíricamente que rodea heridos neuromastos fluorescentes verdes. Además, el procesamiento automatizado de datos, el manejo, visualización y almacenamiento de todos ellos basados ​​en la costumbre desarrollada MATLAB y scripts de Python. En resumen, presentamos un sistema automatizado de HC / HT pantalla que permite realizar pruebas de compuestos químicos por su efecto sobre la iniciación, progresión o resolución de una respuesta inflamatoria granulocítica. Este protocolo sirve un buen punto de partida para más análisis en profundidad de los mecanismos de drogas y rutas implicadas en la orquestación de la respuesta inmune innata. En el futuro, puede ayudar a identificar los intolerables efectos tóxicos o desviado-en las primeras fases de descubrimiento de fármacos y por lo tanto reducir los riesgos del procedimiento y los costes de desarrollo de fármacos.

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Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Aquí se describe una novela de alto contenido de ensayo de la inflamación inducida químicamente con miras a la identificación de moduladores bioactivos inmune. Hemos combinado con éxito con la microscopía automatizada de scripts de software desarrollado que permite la cuantificación automática de la respuesta inflamatoria, así como el procesamiento de datos aún más, el análisis, la minería, y el almacenamiento.

Facilitar el descubrimiento de fármacos: Un sistema automatizado de alta el contenido del ensayo La inflamación en el pez cebra

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

facilitating-drug-discovery-an-automated-high-content-inflammation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.0K vistas.  Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany. Aquí se describe una novela de alto contenido de ensayo de la inflamación inducida químicamente con miras a la identificación de moduladores bioactivos inmune. Hemos combinado con éxito con la microscopía automatizada de scripts de software desarrollado que permite la cuantificación automática de la respuesta inflamatoria, así como el procesamiento de datos aún más, el análisis, la minería, y el almacenamiento.

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Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

Con óvulos de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Como un<em&gt; En vivo</em&gt; Modelo de la inflamación pulmonar inducida por helmintos

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Investigación

Inmunología e Infección

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Los ensayos para la identificación de nuevos antivirales contra la fiebre catarral ovina Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

De Alto Rendimiento Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayo para determinar los perfiles de expresión de los tipos I y III de interferón subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Un método optimizado para aislar y expandir Invariante Natural Killer células T de ratón Bazo

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

La inducción de una respuesta inflamatoria en la Primaria hepatocitos culturas de ratones

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseosa Ensayo de unión que permite predecir la penetración de fármacos en la tuberculosis lesiones

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Un alto rendimiento, alto contenido líquido y basada en C. elegans patosistema

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...