This work was funded by a Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellowship to Y. F. 100104/Z/12/Z.
We would like to thank Dr. Carl Tucker and the team of the fish facility at the Queen&#8217;s Medical Research Institute, University of Edinburgh. We like to thank Michael Millar of the immunohistology and imaging facility of the MRC Centre for Reproductive Medicine, University of Edinburgh for support.
We thank Prof. Dr. Matthias Hammerschmidt and Dr. Heiko Loehr of the Institute of Developmental Biology, University of Cologne for providing the p5E-krt4 entry vector. We also would like to thank Dr. Dirk Sieger of the Centre of Neuroregeneration, Univerity of Edinburgh for providing the pDestTol2CG destination vector.

Los siguientes procedimientos experimentales se llevaron a cabo en estricta conformidad con la Ley de 1986 Animales (Procedimientos Científicos). 1. Preparación de ADN de plásmido para la microinyección <ol><li> Se purifica el plásmido pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP con un kit de purificación de ADN plasmídico comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante y diluir el ADN del plásmido a una concentración de la solución madre final de 100 ng / l. </li><li> Linealizar la transposasa contiene pT3TS plásmido / Tol2 14 por digestión de restricción BamHI, siguiendo el protocolo del fabricante. Este paso se puede extender durante la noche. Precipitar el ADN linealizado por una extracción con fenol / cloroformo, siguiendo el protocolo estándar. </li><li> In vitro transcribir el ARNm transposasa a partir del plásmido linealizado con un kit de transcripción comercial para grandes cantidades de ARN tapado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para diluir y alícuotauna concentración de solución madre final de 100 ng / l en agua libre de nucleasa. Asegurar la calidad de la ARN purificado con un nativo 1-2% TAE (Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, EDTA 1 mM) electroforesis en gel de agarosa (80-120 V). Guarde el ARN a -80 ° C. </li></ol> 2. La microinyección de ADN plásmido de la expresión génica transitoria <ol><li> Preparar una placa de agarosa inyección para sostener los huevos fertilizados durante la inyección. Verter el líquido 3% de agarosa en una placa de Petri de 90 mm. Deje enfriar la agarosa a 40-50 ° C y añadir el molde microinyección en forma de cuña TU-1 en la parte superior de la agarosa líquida. Después del endurecimiento a temperatura ambiente, dejar que el resto de agarosa a 4 ° C durante 30 min antes de retirar el molde. Moldes de microinyección Almacenar a 4 ° C y la reutilización. </li><li> Preparar una parte alícuota de la solución inyectable. Realice los siguientes pasos en el hielo. Pipetear 1 l de ADN de plásmido (concentración final de 10 ng / l), 2 l de ARNm transposasa (concentración final de 20 ng / l), 2l de 10 mg / l de rodamina B isotiocianato-dextrano, 2 l de solución de 5x Danieau (NaCl 290 mM, KCl 3,5 mM, 2 mM MgSO 4, 3 mM Ca (NO 3) 2, 25 mM de HEPES, pH 7,6) a una volumen final de 10 l de agua libre de nucleasa. </li><li> Preparar las agujas de los capilares de vidrio de borosilicato de 1 mm de diámetro que contienen un filamento interior tirando del capilar en direcciones opuestas con una micropipeta extractor. Utilice el siguiente programa: calentar 530, tire 200, la velocidad y el tiempo de 80 a 150. </li><li> Rellena una aguja con 2 l de la solución de inyección (conservado en hielo). Evitar las burbujas retirando cuidadosamente la punta microloader mientras que la liberación de la solución en el capilar. Romper cuidadosamente la punta de la aguja con un fórceps. </li><li> Regular el tamaño de la gota con una bomba neumática pico. Mida el diámetro de la gota / volumen (V = 4/3 πr 3) y ajustar el tamaño de la gota con un micrómetro ocular en un estereoscopio en dimetilpolisiloxano. Recomendamos100 micras, correspondiente a 0,5 nl. Esto asegura concentraciones uniformes y reproducibles por cada embrión inyectado. Valorar la concentración inyectada y ajustar para cada preparación y construcción del plásmido. </li><li> Coloque los cigotos (Figura 1A) obtenidos a partir de una cruz de Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 15 con Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg 16 en los moldes de la placa de inyección por el uso de un pastette 3 ml. Mientras tanto, mantener la punta de la aguja de inyección pre preparado en dimetilpolisiloxano para evitar la solución de la desecación y coagulación. </li><li> Inyectar la caída previamente medida (100 micras correspondiente a 0,5 nl) bajo un estereoscopio a través del corion en el blastodisco 17, antes de la primera escisión (Figura 1A). La inyección en la fase de una célula aumenta el potencial de una distribución uniforme de la plásmido de ADN y ARN en la masa celular en desarrollo y la posibilidad de transmisión de la línea germinal. Esnotable que la expresión de las construcciones más a menudo tiende a ser de mosaico. </li></ol> 3. condicional transformación celular de la piel por 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) <ol><li> La transferencia de los embriones inyectados en solución 0.3x Danieau y mantenerlos a 28,5 ° C en una incubadora. Retire los huevos no fecundados desde el plato en la esfera etapa 17. La co-inyección de rodamina B isotiocianato-dextrano se puede utilizar como un control de la inyección en un estereoscopio fluorescente. </li><li> Embriones de pantalla en 24 HPF (post fertilización hr) para la expresión cardiaca de eGFP. Seguir aumentando CMLC: eGFP embriones de pez cebra positivos hasta 72 HPF. Es importante vigilar cuidadosamente la calidad del agua (0.3x Danieau). </li><li> Retire el corion de aquellos embriones que no han eclosionado con pinzas a 72 HPF. Empujar con cuidado el corion con 1 pinza y tire de ella aparte utilizando el otro. Seleccionar embriones para lysC: expresión DsRed2 utilizando un estereoscopio fluorescente. </li><li> Añadir 10 l de una 10 mMStock de (Z) -4-hidroxitamoxifeno a 20 ml de solución de 0.3x Danieau (concentración final de 5 mM). Utilice la inducción solución de 4-OHT para una placa de Petri estándar (90 mm) en un lote de 40-60 embriones. </li><li> La transferencia de los embriones en una nueva placa de Petri que contiene 20 ml de inducción solución recién hecha. 4-OHT tiene que ser almacenado y manipulado en la oscuridad. Los primeros signos de expresión se pueden detectar 2 hr inicio después de la inducción. La inducción a paso se puede extender durante la noche, teniendo en cuenta que la célula huésped inicial: las interacciones de células preneoplásicas ya puede ocurrir unas pocas horas después del tratamiento. </li></ol> 4. Montaje e imágenes en vivo del pez cebra larvas <ol><li> Preparar una placa de Petri de 60 mm mediante la introducción de un agujero con un diámetro de 18-20 mm. Utilice grasa de silicona de alto vacío para cubrir y sellar el agujero en la parte inferior exterior de la placa de Petri con una tapa de vidrio 25 mm (Figura 1B). </li><li> Preparar 1% de bajo punto de fusión (LMP) de agarosa. Mantenga un tubo de 1,5 mlde LMP agarosa a 37 ° C en un calentador. </li><li> Preselección Tg (krt4: KalTA4-ER T2; UAS: eGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) larvas de verde fluorescente de células de piel y positivo innato de expresión de células inmunes DsRed2, en un estereoscopio fluorescente. Anestesie larvas por la adición de 1 ml de 0,4% tricaína 18 a la solución de inducción 20 ml. </li><li> Transferencia de las larvas preseleccionado con un pastette en la agarosa LMP líquido. Deje que las larvas se hunden en la LMP agarosa y transferirlos a la cubierta de vidrio (Figura 1B). Orientar los embriones en un estereoscopio. Las larvas tienen que ser colocados directamente sobre el cristal para reducir la distancia de trabajo (hasta 6 larvas). </li><li> Cubra la agarosa LMP con el tricaína que contiene la solución de inducción después de que se haya endurecido (Figura 1B flecha). </li><li> Image las larvas incrustado utilizando un fluorescente invertida, de escaneo láser o disco giratorio microscopio confocal. Use un 40X o 63Xobjetivo como objetivos con distancias largas jornadas de trabajo habilitación centrándose toda la larva. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Durante la embriogénesis y el desarrollo de las larvas, la piel embriones de pez cebra se compone de dos capas epiteliales, la capa superficial llamada peridermis y una capa de queratinocitos basales que están unidos a la membrana basal subyacente 19 (Figura 1C, a). El protocolo que se presenta aquí describe un método directo para inducir condicionalmente transformación de células preneoplásicas en la capa superficial de la piel de las larvas de pez cebra, y permite el análisis de la interacción posterior con células inmunes innatas por imágenes en vivo. Las metodologías básicas en nuestro protocolo siguen las técnicas de pez cebra bien establecidos 9-13, y el protocolo se pueden adaptar y modificar fácilmente. El promotor krt4 5 utilizado aquí impulsa KalTA4-ER expresión T2 específicamente en la capa más externa de la piel (Figura 1C, b). Sin embargo, el modular MultiSite pasarelaestrategia de clonación, utilizado para generar la krt4: KalTA4-ER T2 constructo (Figura 1D, a), ofrece la posibilidad de clonar cualquier promotor de interés en frente de KalTA4-ER T2 en una sola etapa de clonación. Una adaptación del método presentado en el presente documento tanto, es posible para la mayoría de los tejidos durante la embriogénesis y estadios larvarios. La disponibilidad de secuencias de promotor es por la presente el factor limitante. Además, casi cualquier gen de interés clonado detrás de una UAS puede ser sobreexpresada condicionalmente en diferentes etapas de desarrollo mediante el uso de la expresión KalTA4-ER T2 espacial y temporalmente controlada. Por lo tanto, nuestro protocolo se puede adaptar para llevar a cabo la expresión génica condicional en cualquier tejido de interés en larvas de pez cebra, en una forma de mosaico. También se puede optimizar la configuración para vivir imagen tejidos más profundos tales como el hígado o el páncreas microscopio. Hemos descrito una aplicación que utiliza el protocolo de élRe, de manera similar, se puede sobreexpresan otros moduladores de la inflamación usando este protocolo para el estudio de la regulación de las respuestas inflamatorias, como se puede neutrófilos imagen fácilmente en directo y los cambios de comportamiento de los macrófagos después de la inducción y la detención en la expresión de un modulador inflamatoria candidato. Además, el protocolo adaptado también sería beneficioso para aquellos que quieren rastrear el movimiento celular y el cambio de comportamiento durante las diferentes etapas de la morfogénesis de tejidos y la formación de órganos y, finalmente, la imagen en vivo de la interacción de células inmunes innatas interacciones con otros linajes celulares específicos que se pueden orientar por el sistema de expresión T2 / UAS KalTA4-ER inducible. Se utilizó el vector pDestTol2CG del Tol2kit pez cebra 20-23 que contiene una cmlc2: eGFP-pA casete (Figura 1D, a) que permite la posterior selección de embriones por verdes fluorescentes corazones positivos como semarcador lección 20 que simplifica el proceso de selección F0. Una inserción estable del gen de transposón flanqueado de interés en el genoma se ve facilitada por co-inyección del ADN plásmido junto con ARNm transposasa. La preparación de plásmido de ADN y el ARNm transposasa para la microinyección sigue protocolos estándar. Sin embargo, una integración exitosa de la construcción en el genoma depende de la transposición a base de Tol2 14. Esto pone de relieve la especial atención que se pagará a trabajar en el hielo en condiciones estériles para evitar contaminaciones y degradaciones por RNasas y DNasas. La microinyección en embriones de fase de una célula es una técnica sólida y bien establecida para la ganancia y la pérdida de los estudios de función en 9,10 pez cebra. Aunque una persona bien entrenada puede inyectar fácilmente en la yema de más de 1.000 embriones en 1 h, la inyección en el blastodisco (Figura 1A, asterisco) requiere más experiencia y formación. Crítico durante este procedimiento is el manejo de las agujas. La aguja tiene que ser muy delgada para penetrar en la célula sin daño y por lo tanto tiene que ser roto sólo de su punta. Es importante para controlar y medir regularmente el tamaño de la gota durante la inyección para garantizar una inyección uniforme en cada embrión. Cuidadosamente manipula, la aguja se puede utilizar para girar el embrión. Esto es a menudo necesaria para encontrar el blastodisco y el ángulo óptimo de penetración. La concentración de ADN y ARNm transposasa usada para la inyección es casi seguro que influye en la eficacia de la expresión. Dosis más altas pueden conducir a un aumento de la proporción de células que expresan el transgén pero con mayores concentraciones de ADN (&gt; 50 ng / l) y transposasa mRNA (&gt; 100 ng / l) también se plantea la posibilidad de efectos tóxicos entre los embriones inyectados. Estamos a favor de la utilización de 10 ng / l de ADN y 20 ng / l transposasa mRNA para inyección, que corresponde a 50 pg de ADN de plásmido y 100 pg de ARN por emb inyectadoryo. 100% de los embriones inyectados con estas concentraciones se desarrollan normalmente, y entre 40-70% muestran eGFP-HRAS expresión G12V, después de 4-OHT inducción, dependiendo de la eficacia de la inyección en la celda individual. Entre embriones positivos que normalmente encontramos aproximadamente el 30% que tiene 1-10 clones, el 40% que tiene 10 a 50 clones y el 30% tiene más de 50 clones. Debido a nuestros objetivos de investigación, estamos a favor de la utilización de embriones con menos clones que expresan eGFP-HRAS G12V. Seleccionamos los embriones con 10-50 clones para nuestros experimentos transitorios. Para la generación de los peces fundador transgénico, se recomienda sólo para seleccionar embriones con tanto el marcador cardíaco positivo eGFP y un gran número de clones eGFP-HRAS G12V positivos en sus epidermis. (Z) -4-hidroxitamoxifeno sufre un cis-trans (EZ) interconversión cuando se expone a la luz 24. Se encontró que el isómero cis (E) es 100 veces menos anti-estrogénica que su contraparte trans 25,26. Exposure a la luz, por lo tanto tiene que ser evitado. La solución madre de 4-OHT disuelto en etanol se puede almacenar a -20 ° C en la oscuridad durante un largo período de tiempo. Se recomienda el uso de una caja para proteger las placas de Petri de la luz durante la inducción de genes diana dentro de la incubadora y el transporte. Aunque el área de la imagen es muy pequeña y la exposición de 4-OHT a la luz UV se reduce a un mínimo, un intercambio constante de solución de inducción cada 2 horas mientras se recomienda de formación de imágenes durante períodos de tiempo más largos para mantener los niveles máximos de expresión. 4-OHT permeabiliza eficazmente a través del corion y las capas más externas de la piel durante la embriogénesis pez cebra, por lo tanto puede inducir la expresión de genes muy rápidamente. Podemos observar fácilmente emisión eGFP después de 2 horas de la inducción y se ha informado de que los primeros signos de la expresión de genes diana pueden ser observados después de 1 hora y la meseta después de 3 horas de tratamiento 8. Las diferencias pueden deberse a la diferente promotor usado en nuestro estudio. Como ha sido previously informó que el 4-OHT tratamiento depende de la dosis 8,27, se optó por utilizar la concentración más alto reportado de 5 M a alcanzar los niveles de expresión robustas y reproducibles en nuestro enfoque transitorio. Esto debería garantizar que todas las células que llevan el transgén se inducir la expresión del gen diana. Tiene que tenerse en cuenta que el enfoque que aquí se presenta transitoria podría dar lugar a diferentes niveles de expresión debido a la posibilidad de múltiples y aleatorias eventos de inserción del genoma. Además, el uso del ARNm transposasa en el fondo transgénico Tol2 de Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 puede conducir a posibles transposiciones del transgén UAS que podría resultar en el silenciamiento de genes o interrupción. Sin embargo, como el método presentado aquí representa un enfoque transitoria, la pre-selección de embriones posteriores a la inyección es obligatorio. Muchos laboratorios han encontrado que las secuencias UAS tienden a ser silenciado en la descendencia transgénica, por lo tanto, enproyecta la pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP construir en Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 embriones podría no ser tan eficaz como la inyección de un UAS construir en Tg (krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: GFP ), los embriones. El uso de la línea transgénica estable Tg (krt4: KalTA4-ER T2) cruzó con Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 permitirá un seguimiento preciso de los / apagado en la cinética de la época-dosis activación de genes 4-OHT dependiente . Un paso crítico durante el montaje de las larvas es la transferencia en la agarosa LMP y sobre la cubierta de vidrio (Figura 1B). Hay solamente un marco de tiempo corto para la temperatura de agarosa LMP líquido que permite una transferencia segura y la orientación de las larvas preseleccionado sin dañar a los peces por cualquiera de choque térmico o endurecimiento del gel. Las larvas debe orientarse directamente sobre la cubierta de vidrio para reducir la distancia de trabajo para el Analy microscópica posteriorsis. Como esto puede ser un factor limitante durante la microscopía de la elección de los objetivos adecuados es obligatorio. Una vez montada, la larva se puede mantener desde horas hasta días. La condicionalidad del sistema modelo que se presenta en este documento permite la transformación repetida por la activación de 4-OHT del transgén. El sistema de expresión depende de la presencia de 4-OHT y por lo tanto la expresión KalTA4 controlada de un gen de interés es reversible (Figura 1D, b). En contraste con el / Lox sistema Cre-ER T2, lo que facilita un evento de recombinación genómica irreversible 28, KalTA4-ER T2 / UAS puede ser activado y desactivado después de la adición o eliminación de 4-OHT y este potencial para la inducción repetida es una ventaja de la técnica sobre el sistema de T2 / Lox Cre-ER. Sin embargo, el requisito de niveles constantes de 4-OHT es una limitación si el experimento tiene que ser prolongado de días a semanas.

El crecimiento excesivo de una progenie de células preneoplásicas dentro de una hoja epitelial de otro modo normal depende en gran medida de una interacción con su microambiente. La interacción con su tejido del huésped es probable que sea el principal determinante de si una célula preneoplásicas es capaz de establecer un nicho clonal para seguir desarrollando en un cáncer completo soplado. A pesar de su importancia en el desarrollo, esta fase inicial de la progresión del cáncer es inaccesible en sistemas modelo más comúnmente utilizados, in vivo. El pez cebra, Danio rerio, es un organismo modelo bien establecido para los estudios de imagen en vivo debido a su transparencia durante todo el desarrollo, la posibilidad de que la manipulación genética y la accesibilidad de los medicamentos solubles en agua. Estudios recientes utilizando un modelo de larvas de pez cebra, que sobreexpresan el oncogén humano HRAS G12V para transformar las células epiteliales, mostraron que la célula huésped señales de deriva, en particular, H 2 O 2 originanel reclutamiento de células inmunes innatas. Curiosamente, los reclutados células inmunes, neutrófilos y macrófagos, se demostrado tener un papel trófico en el apoyo a la proliferación de células preneoplásicas 2,3. Con el fin de entender los eventos tempranos de la iniciación y progresión del tumor, así como la contribución de una respuesta inflamatoria, uno tiene que ser capaz de imagen estos eventos desde el punto de tiempo más temprano en adelante. Por lo tanto, es necesario controlar las transformaciones de células de una manera específica temporal y de tejido. Utilizamos el sistema / UAS Gal4 que ha sido adaptado con éxito a partir de Drosophila 4 para expresar condicionalmente el oncogén humano HRAS G12V bajo el control del promotor específico de la piel queratina 4 (krt4) 5. La versión modificada del activador transcripcional Gal4, a saber KalTA4 6, permite la expresión de HRAS G12V bajo el control de la secuencia de activación aguas arriba (UAS). Para inducir la expresión condicional activador transcripcional, KalTA4 se ha fusionado con el dominio de unión a ligando mutante de los α del receptor de estrógenos humanos (ER T2) 7 que se une específicamente 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) 1. A falta de 4-OHT la ER T2 está ligada en el citoplasma de las proteínas de choque térmico. Tras 4-OHT la unión del choque térmico se disocian proteínas, lo que permite una translocación nuclear de KalTA4-ER T2 y la activación subsiguiente de los UAS gen de interés controladas 8 (Figura 1C, b). Como este sistema de expresión depende de la presencia de 4-OHT, la expresión KalTA4 controlada de un gen de interés es reversible. En contraste con el / Lox sistema Cre-ER T2, lo que conduce a un evento de recombinación irreversible, la inducción de la activación transcripcional por KalTA4-ER T2 es reversible mediante la adición o eliminación de 4-OHT. El siguiente protocolo allo<html> ws una transformación condicional de células de la piel en las larvas de pez cebra y un posterior seguimiento de la interacción con las células inmunes innatas de expresión de la proteína fluorescente. Las metodologías básicas empleadas en este protocolo son similares a algunas de las técnicas de uso común dentro de la comunidad de pez cebra 9-13. La generación y el uso combinatoria de líneas transgénicas junto con la microinyección de construcciones transgénicas permite un enfoque transitoria sólo para transformar células individuales en forma de mosaico. La permeabilidad al oxígeno de la piel del pez cebra embrionario y larval plantea la posibilidad de time-lapse estudios de imagen en vivo de alta resolución de la microscopía de horas a días. Por otra parte, su accesibilidad a las drogas solubles en agua permitirá que los futuros estudios mecanicistas y el seguimiento de los eventos biológicos de células in vivo que podrían conducir a una mejor comprensión de las etapas más tempranas del desarrollo del cáncer. _content &quot;&gt; Este protocolo puede ser adaptado para realizar la expresión génica condicional en cualquier tejido de interés en larvas de pez cebra, en una forma de mosaico. También se puede optimizar la configuración para vivir imagen tejidos más profundos distintos de piel microscopio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1104">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:197px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:467px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(Z)-4-Hydroxytamoxifen&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H7904</td>
			<td>dilute in ethanol and store in the dark at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>20x/0,5 Ph2 &#8734;/0,17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>40x/1,2W Korr &#8734;/0,14-0,18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">63x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>63x/1.4 Oil Ph3 &#8734;/0,17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 510 META</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0171</td>
			<td>Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DMPSV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dow Corning high-vacuum silicone grease&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MKBL4135V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Program: heat 530, pull 200, velocity 80 and time 150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent stereoscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>M205 FA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjection mold TU-1</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microloader tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axiovert 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE mMACHINE Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic pico pump</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>PV820&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic pico pump</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-90A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B isothiocyanate-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8881</td>
			<td>10mg/&#956;l in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>M80</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BMC developmental biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PloS one 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine/MS-222</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Low Melting Point Agarose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td>25:24:1, v/v</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of innate immune and preneoplastic cell interactions using an inducible gal4/uas expression system in larval zebrafish skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Los cigotos de un cruce entre Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 y Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg se recogieron 10 a 15 min después de la fertilización (Figura 1) para obtener 1 embriones en fase celular. Después de la inyección los embriones fueron criados hasta 3 dpf, antes de la inducción con 4-OHT y el montaje de imágenes en vivo (Figura 1B). 2-6 h después de la inducción de los embriones montados fueron, bien bajo un microscopio de fluorescencia invertida (Figura 2A) o un microscopio invertido confocal (Figura 2B-C) y la imagen durante 2-3 horas con intervalos de 1,5 min. Las células superficiales de la piel preneoplásicas pueden ser identificados por su morfología más redondeada en comparación con los queratinocitos normales, así como la emisión fluorescente verde de la membrana localizada eGFP-HRAS G12V. Áreas de formación de imágenes se seleccionaron para la co-localización de células de la piel preneoplásicas y las células inmunitarias innatas (Figura 2A punta de flecha). Debido a la rápida migproceso ración de los neutrófilos se eligieron los intervalos de lapso de tiempo para estar entre 1-1,5 min con tamaños de paso Z pila de 0,7 a 1,7 micras para obtener proyecciones de máxima intensidad (Figura 2, Video 1). Hay una amplia gama de comportamientos que se pueden observar mientras que las imágenes en directo: los neutrófilos migran al lado y debajo de las células preneoplásicas (Figura 2C, Video 1), forman contactos directos a las células (Figura 2 B y C), retire los restos de células preneoplásicas que se someten a apoptosis (Video 1), o activamente engullen partes de las células preneoplásicas (no mostrados). Para capturar el espectro completo de las interacciones, es recomendable seguir sus comportamientos por imágenes en vivo de lapso de tiempo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" width="700px" /> Figura 1: Esquema para la transformación de células de piel condicional en larvas de pez cebra. (A) Una imagen de un cigoto de Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; LysC: DsRed2) pez cebra a los 10 minutos después de la fertilización (MPF). El óvulo fertilizado se encuentra rodeado por el corion (punta de flecha). El sitio para la inyección es el blastodisco (asterisco), formado por corrientes citoplasmáticas de la yema (flecha) que define el polo animal del embrión. (B) Montaje de las larvas de pez cebra. 60 mm placa de Petri con un orificio de 18-20 mm (punta de flecha) que está sellado por una cubierta de vidrio 25 mm. Las larvas de pez cebra se inmovilizan y se monta en la cubierta de vidrio en un 1% de agarosa LMP. Solución 0.3x Danieau (flecha) que contiene 5 mM 4-OHT se utiliza para cubrir la agarosa LMP. (C) 4-OHT transformaciones de las células superficiales de la piel. (A) del perfil en sección transversal esquemática de la piel de las larvas inducida. La piel embrionario y larval se compone de dos capas de células epiteliales, una capa celular superficial y una capa de células basales de los queratinocitos que están conectados a la membrana basal subyacente (BM). (B) La expresión transitoria del sistema to inducir un clon de células preneoplásicas entre las células superficiales de la piel. KalTA4-ER T2 se expresa exclusivamente en la capa más externa de la piel dirigido por el promotor krt4 (amarillo). Mosaico de expresión KalTA4-ER T2 activa UAS controlada (azul) eGFP-HRAS expresión G12V en las células superficiales, dando lugar a un clon de células preneoplásicas (verde). (D) Esquema del sistema de expresión transitoria. (A) de la casete Tol2 pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: vector de expresión eGFP utilizado transitoriamente (b) la inducción de la expresión condicional activador transcripcional.. KalTA4 se fusiona con el dominio de unión a ligando mutante del receptor α estrógeno humano (ER T2) que se une específicamente 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT). A falta de 4-OHT la ER T2 está ligada en el citoplasma de las proteínas de choque térmico (Hsp90). A 4-OHT vinculante Hsp90 se disocia, lo que permite una translocación nuclear de KalTA4-ERT2 y la posterior activación de los UAS controlados expresión eGFP-HRAS G12V. Barra de escala A = 500 micras. <a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" width="700px" /> Figura 2: Imágenes en vivo de la interacción de las células inmunitarias preneoplásica e innata. (AC) Imágenes de un 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) embrión, que ha sido inyectado con pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP y ARNm transposasa en una etapa celular. Las imágenes fueron tomadas después de 6 horas de 4-OHT inducción (A) Vista lateral de la región tailfin a las 6 horas después del tratamiento, mostrando manchas de eGFP-HRAS G12V que expresan las células de la piel (flecha), y lysC:. DsRed2 + neutrófilos (punta de flecha). (AC) Imágenes representativas taken de una película time-lapse confocal, mostrando neutrófilos (rojo) las interacciones con células de la piel eGFP-HRAS G12V expresan (verde). (B) Una célula preneoplásica forma una extensión filopodial corto con el recuento de neutrófilos en contacto (punta de flecha). (C) Los neutrófilos (rojo) está en estrecho contacto con un clon de células de la piel preneoplásicas (verde). La barra de escala en A = 100 m; B / C = 50 micras. <a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52107/Video_1.mov" target="_blank">Video 1</a> : Time-lapse de imágenes en vivo de la interacción de las células inmunitarias preneoplásica e innata. Time-lapse de un 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) embriones, inyectado con pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP y ARNm transposasa en una etapa de células. Confocal fotografía de intervalo 6-9 hours después de 4-OHT inducción mostrando lysC: DsRed2 + neutrófilos (rojo) las interacciones con células de la piel eGFP-HRAS G12V expresan (verde). Los neutrófilos migran al lado y debajo de las células preneoplásicas y eliminar los restos de una célula preneoplásicas que sufre apoptosis. Intervalos de Time-lapse de 1,5 min durante 3 horas con tamaños de paso Z pila de 1,3 micras.

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Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin | Developmental Biology | Video

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

El estudio de los primeros eventos de la progresión de células preneoplásicas y la interacción célula inmune innata es fundamental para entender y tratar el cáncer. Aquí se describe un método para inducir condicionalmente transformaciones de células epiteliales y la formación de imágenes en directo posterior de la interacción de células inmune innato con HRAS G12V expresando células de la piel en las larvas de pez cebra.

Imágenes en vivo de inmune innata y preneoplásicas Interacciones de celda que utilizan un sistema de expresión / UAS Inducible Gal4 en larvas de pez cebra de la piel

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

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Video: Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D organotípicos Co-cultura de apoyo medular tímica epitelial proliferación celular, la diferenciación y la Expresión Génica Promiscuo Modelo

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

El seguimiento de las células en el pez cebra transgénico GFP-Uso del sistema de fotoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Cultivo de óvulos para la proyección de imagen de cigoto polarización de Live-celular y patrones del embrión en Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Establecimiento de pez cebra Larval como modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidad En Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

Cuantificación del tamaño del hígado en el pez cebra larvario mediante la microscopía Brightfield

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Preparación de pruebas de larvas y pupales de Drosophila para el análisis de la división celular en vivo, tejido intacto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control over gene expression timing, location, and amplitude using light as the inducing agent. In this protocol, an optogenetic expression system is used to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos. This system relies on an engineered transcription factor called TAEL based on a naturally occurring light-activated transcription factor from the bacterium E. litoralis. When illuminated with blue light, TAEL dimerizes, binds to its cognate regulatory element called C120, and activates transcription. This protocol uses transgenic zebrafish embryos that express the TAEL transcription factor under the control of the ubiquitous ubb promoter. At the same time, the C120 regulatory element drives the expression of a fluorescent reporter gene (GFP). Using a simple LED panel to deliver activating blue light, induction of GFP expression can first be detected after 30 min of illumination and reaches a peak of more than 130-fold induction after 3 h of light treatment. Expression induction can be assessed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and by fluorescence microscopy. This method is a versatile and easy-to-use approach for optogenetic gene expression.

Optogenetics is a powerful tool with wide-ranging applications. This protocol demonstrates how to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos using the blue light-responsive TAEL/C120 system.

Expresión de GFP inducida por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema optogenético TAEL/C120

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...