Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del NIH, Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial.

Parte 1: Microscopio y preparación del programa de instalación de imágenes <ol><li> Cualquier microscopio confocal invertido debe ser adecuado para IVM. En este estudio se utilizó un microscopio Olympus IX81 invertido, equipado con una unidad de Fluoview-1000 confocal de barrido láser. Para lograr la mejor solución posible, se recomienda el uso de altos objetivos de NA, como la inmersión en agua UPLSAPO 60x/1.20 NA, y el aceite de inmersión Plan-Apo 60x/1.42 NA. Objetivos de inmersión en aceite tienen eficiencias de recolección más altas y a pesar de que requieren el uso de un cubreobjetos entre el tejido y el objetivo, que proporcionan una mejor calidad de imagen cuando se utiliza para áreas de imagen dentro de 15-20 micras de la superficie. Además, el uso de aceite elimina la preocupación por la evaporación del agua durante las sesiones de formación de imágenes más largos. Con el fin de mantener la temperatura y la humedad, el microscopio debe ser completamente cerrado y se suministra con aire caliente y humidificado. Alternativamente, el animal, la platina del microscopio, y elobjetivo debe ser calentado por otros medios. Por ejemplo, almohadillas de calor química se pueden utilizar para el animal y la etapa, y calentadores de objetivos diseñados específicamente se pueden utilizar para el objetivo (Figura 1A). El calentador objetivo debe estar encendido 30 minutos antes de comenzar el procedimiento. Nota: cuando las almohadillas de calor son el uso de mantener al animal calentar una gasa tiene que poner en entre la almohadilla y la piel. La piel tiene que ser controlada para las quemaduras. </li><li> Las etapas estándar en la mayoría de los microscopios confocales disponibles comercialmente tienen una abertura que se utiliza para insertar varios titulares que se utilizan para ajustarse a las diapositivas, placas de Petri, y placas de diferentes tamaños. Con el fin de realizar la IVM, un inserto de fase estándar para 35 mm de placas de Petri se invierte boca abajo, cubierto con una lámina de vidrio 40 mm, que luego es asegurada por grasa de alto vacío de silicona o cinta adhesiva (Figura 1A). Una inserción personalizado también puede ser fabricada a partir de placas de aluminio de espesor 3 mm. La superficie de vidrio es entonces cleaned con etanol al 70% y escamoteado con un Kimwipe. </li><li> Fabricación de un soporte personalizado para la inmovilización SG (estabilizador). El objetivo del titular es estabilizar las Comisiones de Estudio en el lugar y de forma rígida a pareja para el escenario y el cubreobjetos. El soporte puede estar hecho de un 60 mm placa Petri de plástico. En primer lugar, la parte inferior del plato se rompe lejos de las paredes y se corta en rectángulos de aproximadamente 15 x 10 mm. A continuación, los bordes son redondeados y pulidos por el uso de papel de lija fino. Cuatro espaciadores (1.5-2 mm) se construyen mediante la eliminación de las puntas de goma de 1 ml émbolos de la jeringa. Mediante el uso de papel de lija fina, la superficie de los separadores y las cuatro esquinas de la pieza de plástico se pulen. Los espaciadores se pegan entonces mediante el uso de pegamento gelatinosa, y más tarde suavizadas utilizando papel de lija fino sobre una superficie plana. Nota, que para los animales de más edad, el tamaño de los titulares y los espaciadores pueden tener que ser aumentado para acomodar glándulas ligeramente más grandes. </li><li> Preparación del gel de acoplamiento óptico. 0,3% Carbómero-940 (Tabla 2) gel se prepara por calentamiento de 100 ml de agua ultra-pura y disolviendo 5,47 g de D-sorbitol. A continuación, se añaden 0,3 g de Carbomer-940. El vaso de precipitados debe ser cubierta y se coloca sobre una placa caliente de agitación (calor bajo) durante varias horas o hasta que todos los grupos de carbómero se disuelve completamente. Por último, trietanolamina se añade gota a gota mientras se agita suavemente, hasta que se alcanza un pH de aproximadamente 7,4. El gel se almacena a 4 ° C 13. </li></ol> Parte 2: Los animales y Anestesia <ol><li> Antes de llevar a cabo cualquier experimento con animales, los protocolos deben ser aprobados por el comité local de cuidado de los animales y la ética. Es importante destacar que los investigadores deberían ser capacitados adecuadamente para realizar procedimientos quirúrgicos y deben consultar con su comité de cuidado de los animales o institución local veterinario antes de continuar con el procedimiento. </li><li> En este estudio, un modelo de ratón (GFP / mTomato-ratón) deriva por el cruce de ratones FVB que expresan GFP soluble (GFP-ratón) wiSe utilizaron ratones C57B6 th que expresan un péptido de la membrana orientada fusionado con la proteína fluorescente tándem-Tomate (mTomato-ratón) 6. Nota: por lo general toma 20 a 30 minutos para que el animal convertido en totalmente anestesiado y preparada para la imagen </li><li> Los ratones se alojaron en un entorno controlado en las instalaciones de animales y se les permitió aclimatarse durante una semana antes del experimento. Este paso es necesario para obtener imágenes del SGS desde ningún resultado de socorro en una mayor actividad secretora 12. El agua y los alimentos son proporcionados ad libitum. Los varones de 2 -5 meses de edad se utilizan para los experimentos de imagen (20-30 g). </li><li> Antes de la anestesia, pesar los animales para determinar la dosis apropiada de anestésico. </li><li> Dado que la tensión inducida por la administración de anestésicos inyectables puede afectar a la actividad secretora de la SG, inducir la pre-anestesia por inhalación de isoflurano, seguido por la inyección de anestésicos. Para este objetivo, colocar los ratones muy suavemente en la cámara de vaporizador, yencender el flujo de oxígeno (800-900 mmHg). Ajuste los niveles de isoflurano al 3% para iniciar la inducción preanestésica. </li><li> Una vez que los animales son inconscientes, inyectar una mezcla de 100 mg / kg de ketamina y 20 mg / kg de xilazina en la cavidad peritoneal (25 g de la aguja). Anestésicos se preparan por dilución de 100 mg / xilazina ml a 20 mg / ml en solución salina y luego se mezcla con la ketamina. Esta mezcla se diluyó adicionalmente 1:01 con solución salina y una cantidad apropiada se inyecta basado en el peso del animal. Esta dilución ayuda en la prevención de sobredosis accidental. Tenga en cuenta que la mezcla pierde su eficacia después de 20 min. </li><li> Observar a los animales en busca de signos de la vigilia e inyectar la mezcla más anestésico si están saliendo de la anestesia (aproximadamente el 75% de la dosis inicial en un plazo de 45 minutos después de la primera inyección, y el 50% cada hora a partir de entonces). Comprobar la profundidad de la anestesia cada 15 min pellizcando la pata y la observación de la respuesta. Nota: administrar Siempre pomada oftálmica para prevenirsequedad ocular. </li><li> Anestésicos inducir la hipotermia, que puede afectar a la reproducibilidad de los experimentos y la salud del animal. Por lo tanto, los ratones deben mantenerse bajo la lámpara de calor o en una almohadilla de calefacción para toda la duración del experimento. Nota: la lámpara de calor debe ser de al menos 12 a 18 centímetros de la de los animales para evitar la quema de </li><li> La temperatura corporal de los animales tiene que ser controlada con un termómetro equipado con una sonda de temperatura rectal. </li></ol> Parte 3: Animal Cirugía y Posicionamiento de Microscopia intravital <ol><li> Prepare el área de trabajo con todos los instrumentos quirúrgicos (Tabla 1) que deben estar limpios y estériles. </li><li> Afeitar el área del cuello del ratón con una maquinilla eléctrica. Limpiar por el lado ventral de la zona del cuello del ratón anestesiado con una esponja de gasa empapado en etanol al 70%. Seque el exceso con un Kimwipe. </li><li> Con unas pinzas curvas aburridos levantan un pequeño trozo de piel en la línea media (aproximadamentedamente en el extremo inferior de los músculos maseteros), y hacer una pequeña incisión (fig. 1B). </li><li> Insertar las tijeras en la abertura y separar la piel lejos del tejido subyacente mediante la apertura de las cuchillas de la tijera. Evite dañar el tejido glandular subyacente señalando las tijeras hacia la parte inferior de la piel. Repita este paso varias veces hasta que la piel se separa de los tejidos más profundos (Figura 1B). </li><li> Con unas tijeras, corte una tira de piel suelta alrededor de 3 mm de ancho y 10 mm de largo. La piel debe ser cortada de manera que la apertura se inicia cerca de la base de las SGS en donde el nervio, el conducto y los vasos sanguíneos conectan la glándula con el resto del cuerpo. Después de limpiar el área de la herida, la abertura resultante será de forma oval y medir aproximadamente 8 x 12 mm. Ambas Comisiones de Estudio serán visibles después de la apertura (Figura 1B). </li><li> Con una jeringa de aplicar el gel de acoplamiento óptico en el centro de la corte y limpie haciael exterior con una gasa estéril. Trozos limpios de gasa se deben utilizar para cada pasada para evitar la introducción de cabello o sangre en el tejido expuesto. Repita este paso hasta que se quite toda la sangre y el pelo suelto. </li><li> Usando # 7 pinzas, separar el tejido conectivo lejos de la glándula submandibular derecha todo el camino a la base de la glándula (alternativamente, este protocolo se puede utilizar en la SG izquierda). En primer lugar, encontrar la punta de la SG y agarrar el tejido conectivo de unos pocos milímetros por encima de la punta de la glándula. Rompa el tejido conectivo que rodea la glándula sin lesionar el parénquima. (Figura 1B). Una vez que la glándula está expuesto, separar suavemente el tejido conectivo de la glándula. Si se produce una hemorragia, lavar la sangre con solución salina. Asegúrese de que todos los tejidos conectivos se separan y la glándula es totalmente expuestos. Mantener la glándula húmedo mediante la aplicación de gel de acoplamiento óptico regularmente. </li><li> Antes de llevar el animal al microscopio, coloque un pedazo grueso de gasa y la Ley de Educación Superiort mochila a la platina del microscopio para mantener una temperatura de 38 ± 2 ° C. La temperatura del bloque de calor química se puede ajustar por el tamaño de los cortes que exponen la bolsa interior a la atmósfera. Gasa proporciona cierto aislamiento del paquete del calor desde el escenario de metal. Cubra la parte superior de la bolsa con agua caliente con un trozo de gasa también. </li><li> Colocar el animal en su lado (lado derecho de la glándula derecha) y sobre la gasa. Coloque el animal con la glándula salival submandibular colocado en el centro del cubreobjetos (Figura 1C). </li><li> El animal debe ser fijado y estabilizado en esta posición antes de inmovilizar la glándula. Coloque un pedazo de cinta adhesiva en la parte ventral de la pata delantera derecha del ratón. Enganche los incisivos del ratón por una sutura de seda (Figura 1C, recuadro). Crea una cierta tensión entre el hilo de seda y de las garras que se adjuntarán a la escena con cinta de enmascarar. La SG debe descansar de forma natural en el medio de lacubreobjetos. La cabeza y el tórax se deben estabilizar adicionalmente por las cuñas de plástico que se pueden acoplar a la etapa. </li><li> Coloque un pequeño trozo de limpieza de lentes de tejido sobre la glándula (Figura 1C). Extienda la glándula ligeramente y colocar un soporte personalizado a través de la glándula. Estrechamente acoplar el estabilizador en el escenario con cinta de enmascarar. El acoplamiento puede ser mejorado por una abrazadera de metal conectado a la etapa (Figura 1C). Ángulos de tensión y afilados deben ser evitados, ya que pueden comprometer el flujo sanguíneo. Inmediatamente después de la estabilización de inspeccionar el flujo de sangre, ya sea mediante el examen de la glándula visualmente (debe retener coloración rosa) o por epifluorescencia. En el ratón GFP / m-tomate, alteraciones graves de la circulación de la sangre se pueden evaluar con facilidad ya que tanto los vasos sanguíneos y de varias de las células de la sangre son etiquetados con el m-Tomate. </li><li> Cubra el animal con una gasa y una almohadilla caliente. Mida la temperatura de la glándula expuesta utilizando un termómetro equipada wITH una pequeña sonda termopar flexible que se coloca en contacto con un lado de la glándula expuesta. </li></ol> Parte 4: Parámetros de imágenes <ol><li> El uso de epifluorescencia foco de iluminación en la superficie de la glándula, ya sea usando la GFP o el conjunto de filtros RFP. Encontrar la superficie de la SG, y evaluar el flujo de sangre en los capilares y la morfología general del tejido. Los signos de daño en los tejidos incluyen blebbing membrana o la aparición de grandes vacuolas. </li><li> Evaluar la estabilidad del tejido, ya sea a través de epifluorescencia o por escaneado previamente el área seleccionada. Una preparación estable es esencial, ya que la mayoría de los artefactos de movimiento no puede ser retirada o corregida en el análisis de datos post-procesamiento. Si la preparación no es estable, es necesario realizar ajustes. </li><li> Para encontrar la imagen del plano focal adecuada las glándulas en el modo de pre-exploración (1X zoom), y avanzar gradualmente hacia el objetivo del cubreobjetos hasta que las estructuras acinares, los gránulos de secreción y el pmembrana LASMA convertirse claramente visible (Figura 2). </li><li> Los parámetros de imagen para el lapso de tiempo depende de la experiencia individual. A la imagen de la dinámica de los gránulos secretores utilizan una velocidad de barrido de 0,5 a 2 segundos / fotogramas y 256 x 256 píxeles con un (campo de visión de aproximadamente 50 micras x 50 micras) 0,2 m / pixel escala espacial. Con el fin de visualizar de manera óptima los gránulos y la membrana plasmática, el espesor óptico se debe establecer entre 0,9-1,2 micras. Para excitar la GFP y el tándem de tomate, se puede usar una longitud de onda de 488 nm y 561 nm, respectivamente. La potencia máxima se encuentra alrededor de 0,5 mW para la 488 nm y 1 mW para la 561 nm. Esto asegura fotoblanqueo mínima. </li><li> Los ajustes del detector tienen que ser ajustada para mantener la señal dentro del rango dinámico y dependerá del brillo de la muestra. </li><li> Una vez que todos los parámetros se establecen, de formación de imágenes se puede iniciar. En primer lugar, tomar una instantánea del campo de visión para ser utilizado como punto de referencia. Mientrasimágenes en lapso de tiempo, se puede producir la deriva del tejido en XY y Z. Esto puede ser compensado manualmente ajustando el área de escaneado y la posición Z. Los ajustes deben realizarse de forma gradual y en pequeños incrementos para evitar artefactos. Por otra parte, la imagen de referencia se puede utilizar para determinar si se produce fotoblanqueo. Si fotoblanqueo significativa se detecta (reducción de más del 15-20% de la fluorescencia), reduzca la potencia del láser de 0,1 mW. </li><li> Para estimular la exocitosis, inyecta por vía subcutánea 0,1 mg / kg de una solución recién preparada de isoproterenol en solución salina. La exocitosis se activa aproximadamente 1 minuto después de la inyección. Gránulos secretores de fusión con la membrana plasmática se detectaron por un aumento de la fluorescencia de GFP alrededor de los gránulos y la difusión de los péptidos en tándem de tomate en sus membranas limitantes (Figura 3). Recomendamos la adquisición de 3-4 secuencias de lapso de tiempo en la misma zona, a 10 minutos cada una. </li><li> Después de la sesión de imágenes, la eutanasia a la anesthetized animales mediante inhalación de CO2 en una cámara de eutanasia (10-12 mm de Hg durante 10 min). </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Dunn, K. 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Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li><li>Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+exocytosis:+novel+insights+from+intravital+microscopy.">Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy.</a> Traffic. 13, 627-634 (2012).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).</li><li>Sramkova, M., Najman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. , (2012).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Everything+you+need+to+know+about+intravital+microscopy:+A+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals.">Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, (2012).</li><li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+image+membrane+trafficking+in+live+rats.">Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats.</a> Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).</li><li>Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+intravital+microscopy+of+hepatic+transport.">Quantitative intravital microscopy of hepatic transport.</a> Intravital. 1, 44-53 (2012).</li><li>Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+excitation+microscopy+in+intact+animals.">Multi-photon excitation microscopy in intact animals.</a> J. Microsc. 222, 58-64 (2006).</li><li>Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+morphology+and+functional+dynamics+of+vital+murine+intestinal+mucosa+revealed+by+autofluorescence+2-photon+microscopy.">Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).</li><li>Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. 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Hasta ahora estructuras subcelulares han sido fotografiados en su mayoría en in vitro (es decir, los cultivos de células) o en ex vivo (es decir, las orga-culturas, rebanadas de tejidos, preparaciones acinares) sistemas de modelos que a menudo no recapitulan las características de los tejidos vivos intactos 6. En este sentido, el enfoque presentado aquí representa un avance importante ya que permite imágenes de las dinámicas de un paso el tráfico de membrana específico (es decir,...

En las últimas dos décadas el advenimiento de la microscopía en vivo y el uso de proteínas fluorescentes han dado lugar a grandes avances en cada proceso celular imaginable, avanzando así en nuestra comprensión de la biología de las células 1. Este campo se ha beneficiado enormemente de la utilización de cultivos de células de mamíferos que son sistemas modelo extremadamente potentes, en particular cuando se trata de manipulaciones experimentales. Sin embargo, a menudo no proporcionan una verdadera representación de la biología de los organismos multicelulares complejos 2. Este problema ha empezado a abordarse por el desarrollo de la microscopía intravital (IVM), que ha abierto la puerta a la investigación de cuestiones biológicas fundamentales en campos como la neurobiología, la inmunología y la biología del tumor 3. Hasta ahora, la mayoría de los estudios sobre la base de IVM se han realizado a nivel de los tejidos y las células individuales, sin proporcionar ninguna información sobre la dinámica de los compartimentos subcelulares. Recientemente, nuestro laboratorio y otross han desarrollado técnicas de MIV capaz de obtener imágenes de estructuras subcelulares en roedores vivos 4-7, 13-15 y permitiendo las manipulaciones farmacológicas y genéticas en vivo. Este enfoque ha sido utilizado por nosotros para estudiar el tráfico de membrana in vivo, y más específicamente la endocitosis y exocitosis regulada 6,7. Nuestro sistema modelo experimental se basa en la exposición, de estabilización y de imágenes de las glándulas salivales submandibulares (SGS) de roedores anestesiados. La elección de la SGS como un órgano modelo para la IVM es debido al hecho de que las glándulas son fácilmente accesibles mediante la realización de una cirugía menor, se puede exterioriza sin comprometer su fisiología, y estabilizado para reducir los artefactos de movimiento debido al latido del corazón y la respiración. Además, SGS puede ser manipulada genéticamente de forma selectiva mediante la inyección de vectores basados ​​ya sea virales o no virales a través del conducto salival 8,9. Por último, SGS son glándulas exocrinas compuestas de epith polarizadocélulas Elial, que forman los acinos y los conductos, células mioepiteliales, y una población compleja de células del estroma. Por esta razón, son un modelo excelente para estudiar la exocitosis, endocitosis, la entrega de genes, y el citoesqueleto de actina, como se destaca en nuestros estudios recientes 10, y ofrecer la oportunidad de estudiar los aspectos de la biología celular, tales como la polaridad celular, la división celular, célula- uniones de las células, y los canales de iones. En este trabajo se describe en detalle un protocolo de formación de imágenes para lograr la resolución subcelular en el epitelio de las Comisiones de Estudio de un ratón vivo. Específicamente, mostramos cómo reproducir los gránulos de secreción en las células acinares de las Comisiones de Estudio durante la exocitosis regulada. Como se indica anteriormente, a la estimulación con agonistas del receptor beta-adrenérgico, los gránulos secretores se fusionan con la membrana plasmática apical y el colapso gradualmente, liberando su contenido en los canalículos acinares 6. Nuestro objetivo es proporcionar las herramientas básicas para investigadores con minimal experiencia en procedimientos quirúrgicos y manipulación de los animales, de modo que puedan realizar con éxito IVM con una resolución subcelular. Desde la parte más difícil de IVM es la preparación del animal, aquí nos centramos en la descripción de los procedimientos quirúrgicos básicos que se utilizan para exponer e inmovilizar las Comisiones de Estudio, sin comprometer su función. En cuanto a los procedimientos para etiquetar estructuras subcelulares, varias estrategias, tales como la administración sistémica de sondas fluorescentes, el uso de animales transgénicos, o una combinación de ambos, se han descrito en otra parte 7,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflourane (Forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>101936-40</td>
			<td>Handle under chemical hood</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine (ketaved)</td>
			<td>Fort Dodge Animal Health</td>
			<td>57457-034-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine (Anased)</td>
			<td>Akorn, Decatur</td>
			<td>61311-481-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neomycin/Polymyxin B</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>24208-785-55</td>
			<td>Use to lubricate the eye of the mouse</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carbomer-940</td>
			<td>Ashalnd, Inc.</td>
			<td>4607-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td>Add drop wise to prevent the solution to solidify</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoproternol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16504</td>
			<td>Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 &deg;C</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflurane V 1.9 (Vaporizer)</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>190AF</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Portable Downdraft table equipped with HEPA filter</td>
			<td>Hazard Technology</td>
			<td>PDDT</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Heat lamp, Model HL1</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>HL-1 US</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MicroTherma 2T Thermometer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TW2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Operating Scissors (11.5 cm straight</td>
			<td>World Precision Instruments </td>
			<td>5003708-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#7 curved tip tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14187</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503365</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black Braided Silk suture #4.0</td>
			<td>George &amp; Tiemann &amp; Co</td>
			<td>160-1219-4</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gauze sponges 2" x 2"</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td>9022</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lens cleaning tissue</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CL-TISSUE (M97) AX6476</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins

Aquí se describe un procedimiento para obtener imágenes de estructuras subcelulares en roedores vivos que se basa en el uso de microscopía intravital confocal. Como un modelo de órgano, utilizamos las glándulas salivales de ratones vivos, ya que proporcionan una serie de ventajas. En primer lugar, pueden ser fácilmente expuestos a permitir el acceso a la óptica, y se estabilizan para facilitar la reducción de los artefactos de movimiento debido a latido del corazón y la respiración. Esto facilita significativamente de formación de imágenes y el seguimiento de las pequeñas estructuras subcelulares. En segundo lugar, la mayor parte de las poblaciones de células de las glándulas salivales son accesibles desde la superficie del órgano. Esto permite el uso de microscopía confocal que tiene una resolución espacial más alta que otras técnicas que se han utilizado para la formación de imágenes in vivo, tales como la microscopía de dos fotones. Por último, las glándulas salivales pueden ser fácilmente manipulados genéticamente y farmacológicamente, proporcionando así un sistema robusto para investigar los procesos biológicos a nivel molecular. En este estudio nos centramos en un protocolo diseñado para seguir la cinética de la exocitosis de los gránulos secretores de las células acinares y la dinámica de la membrana plasmática apical donde los gránulos de secreción se fusionan a la estimulación de los receptores beta-adrenérgicos. Específicamente, se utilizó un ratón transgénico que co-expresa GFP citosólica y un péptido membrana orientada fusionado con la proteína fluorescente tándem de tomate. Sin embargo, los procedimientos que utilizamos para estabilizar y la imagen de las glándulas salivales se pueden extender a otros modelos de ratón y acoplados a otros enfoques para etiquetar in vivo componentes celulares, lo que permite la visualización de varias estructuras subcelulares, tales como los endosomas, lisosomas, mitocondrias, y el citoesqueleto de actina.

En el ratón GFP / mTomato, los acinos aparecen como estructuras claramente diferentes, que expresan GFP citosólica y el péptido en tándem de tomate membrana orientada (Figura 2, línea de trazos). En acinos individual, las células acinares son delineados por el péptido en tándem de tomate. También se detectó GFP en los núcleos que son claramente visibles dentro de las células acinares (Figura 2, flechas). GFP citosólica se excluye de los gránulos secretores que aparecen ves...

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Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Microscopía intravital es una poderosa herramienta que permite obtener imágenes diferentes procesos biológicos en los animales vivos. En este artículo, presentamos un método detallado para obtener imágenes de la dinámica de las estructuras subcelulares, tales como los gránulos de secreción, en las glándulas salivales de ratones vivos.

Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

23.6K vistas.  National Institutes of Health.  Microscopía intravital es una poderosa herramienta que permite obtener imágenes diferentes procesos biológicos en los animales vivos. En este artículo, presentamos un método detallado para obtener imágenes de la dinámica de las estructuras subcelulares, tales como los gránulos de secreción, en las glándulas salivales de ratones vivos. 

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Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Imágenes de células vivas de la F-actina Dynamics a través de Microscopía Fluorescente Speckle (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Investigación

Biología

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

Marcaje fluorescente de Drosophila Estructuras del Corazón

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Marcaje fluorescente de COS-7 Expresando etiqueta SNAP-proteínas de fusión de imágenes de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

El trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa Blastómeros de imágenes en vivo del desarrollo de la retina y el cerebro en embriones de pez cebra quiméricos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of fluorescence can be changed by exposure to light of a specific wavelength. Optical highlighting allows noninvasive marking of a subpopulation of fluorescent molecules, and is therefore ideal for tracking single cells or organelles.
Critical parameters for efficient photoconversion are the intensity and the exposure time of the photoconversion light. If the intensity is too low, photoconversion will be slow or not occur at all. On the other hand, too much intensity or too long exposure can photobleach the protein and thereby reduce the efficiency of photoconversion.
This protocol describes a general approach how to set up a confocal laser scanning microscope for pc-FP photoconversion applications. First, we describe a procedure for preparing purified protein droplet samples. This sample format is very convenient for studying the photophysical behavior of fluorescent proteins under the microscope. Second, we will use the protein droplet sample to show how to configure the microscope for photoconversion. And finally, we will show how to perform optical highlighting in live cells, including dual-probe optical highlighting with mOrange2 and Dronpa.

This protocol describes a general approach to perform photoconversion of fluorescent proteins on a confocal laser scanning microscope. We describe procedures for the photoconversion of puried protein samples, as well as for dual-probe optical highlighting in live cells with mOrange2 and Dronpa.

Fotoconversión purificada de proteínas fluorescentes y de doble sonda óptica destacar en células vivas

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los ovocitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo de amarillo fluorescente proteína Tagged p62 en estructuras Aggresome inducida por

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Super-Resolución De Imágenes De Células Vivas De Estructuras Subcelulares

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...