Bu araştırma NIH İntramural Araştırma Programı, Diş ve Kraniofasial Araştırmalar Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

Bölüm 1: Mikroskop ve Görüntüleme Kur hazırlanması <ol><li> Herhangi bir ters konfokal mikroskop IVM için uygun olmalıdır. Bu çalışmada, Fluoview-1000, konfokal lazer tarama ünitesi ile donatılmış bir Olympus IX81 ters mikroskop kullanılmıştır. Mümkün olan en iyi çözünürlük elde etmek için, bu tür su daldırma UPLSAPO 60x/1.20 NA ve yağ daldırma Plan-Apo 60x/1.42 NA gibi yüksek NA hedeflerinin kullanılması tavsiye edilir. Yağ daldırma hedefleri daha toplama verimliliği vardır ve doku ve hedef arasında bir lamel kullanımını gerektiren ne kadar yüzeyinden 15-20 um olan görüntü alanları için kullanıldığında, daha iyi bir görüntü kalitesi sağlar. Ayrıca, yağ kullanımının daha uzun görüntüleme oturumları sırasında su buharlaşması için endişe ortadan kaldırır. Sıcaklık ve nem muhafaza etmek amacıyla, mikroskop tamamen kapalı olmalıdır ve sıcak ve nemlendirilmiş hava ile birlikte. Alternatif olarak, hayvan, mikroskop sahne veamaç başka yollarla ısıtılmalıdır. Örneğin, kimyasal ısı yastıkları hayvan ve aşama için kullanılabilir ve özel olarak tasarlanmış amacı ısıtıcılar objektif (Şekil 1A) için kullanılabilir. Amaç ısıtıcı prosedürü başlamadan önce 30 dakika açık olmalıdır. Not: ısı pedleri bir gazlı pad ve deri arasındaki yerleştirmek zorundadır sıcak hayvan tutmak için kullanımı zaman. Cilt yanıkları için izlenecek vardır. </li><li> Ticari olarak temin edilebilen confocal mikroskoplar çoğunda, standart aşamaları slaytlar, Petri kapları, ve farklı boyutlarda plakaları uyacak şekilde kullanılan çeşitli sahipleri eklemek için kullanılan bir açıklığa sahiptir. 35 mm Petri kapları için IVM, standart bir sahne ekleme yapmak için, sonra yüksek vakum silikon gres veya maskeleme bandı (Şekil 1A) tarafından güvenli bir 40 mm cam slayt ile kaplı, baş aşağı çevrilir. Özel bir insert da 3 mm kalınlığında alüminyum levha imal edilebilir. Cam yüzeyi daha sonra Cl% 70 etanol ile eaned ve bir Kimwipe ile sildi. </li><li> SGS immobilizasyon (sabitleyici) için özelleştirilmiş bir tutucu imalatı. Sahibinin amacı yerinde SGS ve sahne ve lamel onları katı çift stabilize etmektir. Tutucu bir 60 mm plastik Petri kabı yapılabilir. İlk olarak, çanak alt duvarlardan uzak kırılmış ve yaklaşık 15 x 10 mm&#39;lik dikdörtgen halinde kesilir. Sonra, kenarları ince zımpara ile yuvarlanır ve parlatılır. Dört pulu (1.5-2 mm) 1 ml şırınga plançerleri lastik ipuçları kaldırarak tarafından inşa edilmiştir. Ince zımpara kağıdı, ayırıcıların yüzey ve plastik parçanın dört köşe kullanılarak cilalanır. Ayırıcılar sonra jelatinli superglue kullanılarak yapıştırılmış ve daha sonra düz bir yüzeye ince zımpara kullanarak düzeltti. Yaşlı hayvanlar için, sahiplerinin boyutu ve aralama biraz daha büyük bezleri karşılamak için artırılabilir gerekebilir, dikkat edin. </li><li> Optik bağlaştıncı jel hazırlanması. % 0.3-Carbomer 940 (Tablo 2) jel ultra saf su ve 100 ml kadar ısınma ve D-Sorbitol 5,47 g çözülmesiyle hazırlanır. Daha sonra, Carbomer-940, 0.3 g ilave edilir. Beher kaplanmış ve karıştırılan bir sıcak plaka (en düşük ısı ayarı) üzerine yerleştirilmiş birkaç saat ya da tüm karbomer kümeleri tamamen çözülene kadar olmalıdır. Yaklaşık 7.4 &#39;lik bir pH elde edilinceye kadar son olarak, Trietanolamine, damla damla yavaşça karıştırılarak ilave edilir. Jel 4 ° C&#39;de 13 saklanır. </li></ol> Bölüm 2: Hayvanlar ve Anestezi <ol><li> Hayvanlarla deneylerini önce protokolleri yerel hayvan bakımı ve etik kurul tarafından onaylanmış olması gerekir. Önemlisi, araştırmacılar düzgün cerrahi işlemleri gerçekleştirmek ve prosedür geçmeden önce yerel hayvan bakım komitesi veya kurum veteriner danışmalısınız eğitilmelidir. </li><li> Bu çalışmada, bir fare modeli (GFP / mTomato-fare) çözünür GFP (GFP-fare) eksprese wi FVB fare melezlenerek elde edilenfloresan protein tandem-domates (mTomato-fare) 6 ile ikame edilmiş bir membran-hedefli bir peptidi eksprese eden th C57B6 farenin kullanılmıştır. Not: genellikle tam anestezi ve görüntüleme için prepped olmak hayvan için 20-30 dakika sürer </li><li> Fareler, hayvan barınağında kontrollü bir ortamda tutuldular ve daha önceki deneyden bir hafta boyunca ortama alışmaları sağlanır. Bu adım, gelişmiş salgılama faaliyeti 12 herhangi bir sıkıntı sonuçları yana SGS görüntülenmesi için gereklidir. Su ve gıda ad libitum olarak verilmiştir. 2 -5 ay arası Erkek görüntüleme deneyleri (20-30 g) için kullanılır. </li><li> Önce anestezi, anestetik uygun dozu belirlemek için hayvanlar tartılır. </li><li> Enjekte edilebilir anestetikler verilmesiyle indüklenen gerilim SGS salgı aktivitesi bozabilir için, anestezik enjeksiyonu takiben, izofluran teneffüs tarafından önceden anestezi neden olur. Bu amaç için, çok yavaşça buharlaştırma odasına fareler yerleştirin veoksijen akışı (800-900 mmHg) açın. Öncesi anestezi indüksiyon başlatmak için% 3 izofluran seviyelerini ayarlayın. </li><li> Hayvanlar bilinçsiz kez, periton boşluğu (25 G iğne) bir 100 mg / kg ketamin karışımı ve 20 mg / kg ksilazin enjekte edilir. Anestetik taze tuzlu su içinde 20 mg / ml ila 100 mg / ml ksilazin seyreltilmesi ve daha sonra ketamin ile karıştırılarak hazırlanır. Bu karışım, daha fazla tuz ile 1:1 seyreltilir ve uygun bir miktar hayvanların ağırlığına göre enjekte edilir. Bu seyreltme yanlışlıkla aşırı dozda önlemede yardımcı olur. Karışım, 20 dakika sonra etkisini kaybeder unutmayın. </li><li> Uyanıklık belirtileri hayvanları gözlemlemek ve onlar (bundan sonra her saat ilk enjeksiyondan sonra 45 dakika içinde ilk dozun yaklaşık% 75 ve% 50) anestezi çıkan ise daha fazla anestezik karışımı enjekte. Pençe kısma ve tepkisini gözlemleyerek her 15 dk anestezi derinliğini kontrol edin. Not: Her zaman önlemek için oftalmik merhem yönetmekgöz kuruluğu. </li><li> Anestezikler deneylerin tekrarlanabilirliği ve hayvan sağlığını etkileyen, hangi hipotermi neden. Bu nedenle, fareler ısı lambası altında ya da deney süresi boyunca ısıtılmış bir yüzey üzerinde tutulmalıdır. Not: ısı lambası yanan önlemek için hayvanın en az 12-18 santim olmalıdır </li><li> Hayvanların vücut sıcaklığı bir rektal sıcaklık probu ile donatılmış bir termometre ile kontrol edilmesi gerekir. </li></ol> Bölüm 3: Intravital Mikroskopi Hayvan Cerrahisi ve Konumlandırma <ol><li> Temiz ve steril olması gereken tüm cerrahi aletlerin (Tablo 1) ile çalışma alanını hazırlayın. </li><li> Elektrikli kesme makinesi ile fare boyun alan tıraş. % 70 etanol ile ıslatılmış bir gazlı bez ile anestezi fare boyun bölgesinde ventral tarafı aşağı silin. Kimwipe ile fazlalığı kurulayın. </li><li> Donuk kavisli cımbız orta hat (yakla de cildin küçük bir parça yukarı kaldırınyaklaxık Masseter kasların alt ucunda) ve küçük bir kesik (Şekil 1 B) tercih. </li><li> Ağzına makas takın ve makas bıçakları açarak uzakta yatan doku cilt ayırmak. Cildin alt doğru makas yukarı doğrultarak yatan glandüler doku zarar kaçının. Cildin daha derin dokulara (Şekil 1 B) ayrılır kadar bu işlemi birkaç kez tekrarlayın. </li><li> Makas kullanırken, yaklaşık 3 mm genişliğinde gevşek cilt ve uzun 10 mm&#39;lik bir şerit kesip. Açılış sinir, kanal ve kan damarları vücudun geri kalanına bezi bağlamak SGS tabanına yakın başlar, böylece deri kesilmelidir. Yara bölgeyi temizledikten sonra, sonuçta açılış oval olması ve yaklaşık 8 x 12 mm ölçer. Hem SGS açıklık (Şekil 1B) sonra görünür olacaktır. </li><li> Bir şırınga ile kesme ortasına optik bağlantı jel uygulamak ve doğru silinsteril gazlı bez ile dışarıda. Her açıkta kalan dokuya saç ya da kan girişini önlemek için silme için temiz bir gazlı bez parçaları kullanılmalıdır. Tüm kan ve gevşek saç kaldırılıncaya kadar bu adımı tekrarlayın. </li><li> 7. cımbız kullanarak, uzak sağ submandibuler bezden bağ dokusu (alternatif olarak bu protokol sol SG-kullanılabilir) bezinin tabanına tüm yol ayırın. İlk olarak, SG ucunu bulmak ve birkaç milimetre bezinin ucu üzerinde bağ dokusu al. Parankimini zarar vermeden bezinin etrafında bağ doku gözyaşı. (Şekil 1B). Bezinin maruz kaldığı zaman, hafifçe bezinden bağ dokusu ayırın. Kanama oluşursa, tuzlu su ile kanı yıkayın. Tüm bağ dokusu ayrılır ve bezi tamamen açık olduğundan emin olun. Düzenli olarak optik kuplaj jel uygulayarak nemli bezi tutun. </li><li> Önce mikroskop hayvan getiren, gazlı bez kalın bir parça ve hea yerleştirint 38 ± 2 ° C&#39;lik bir sıcaklığı korumak için mikroskop sahneye paketi Kimyasal ısı paketinin sıcaklığı atmosfere iç kese maruz kesim büyüklüğüne göre ayarlanabilir. Gazlı bez metal aşamasından ısı paketinin bir izolasyon sağlar. Hem gazlı ince bir parça ile ısı paketinin üst kapağı. </li><li> Yan (sağ bezi için sağ tarafı) ve gazlı bez üzerine hayvan yerleştirin. Lamel (Şekil 1C) ortasına yerleştirilen submandibuler tükürük bezi ile hayvan yerleştirin. </li><li> Hayvan bezi hareketsiz önce sabitlenir ve bu pozisyonda stabilize edilmelidir. Farenin sağ ön pençe ventral tarafta maskeleme bandı bir parça yerleştirin. Bir ipek sütür (Şekil 1C, inset) tarafından fare kesici dişler kanca. Ipek iplik ve pençe arasında bazı gerginlik oluşturmak ve maskeleme bandı ile sahneye ekleyebilirsiniz. SG ortasında doğal istirahat edilmelidirlamel. Kafa ve göğüs ek aşamasına akuple edilebilir plastik kamalar ile stabilize edilmelidir. </li><li> Bezi (Şekil 1C) üzerinde dokuların temizlenmesi lens küçük bir parça yerleştirin. Biraz bezi uzatmak ve bezi üzerinde özelleştirilmiş bir tutucu yerleştirin. Maskeleme bandı ile sahneye sıkıca çift sabitleyici. Kavrama aşama (Şekil 1C) bağlı bir metal kelepçe ile geliştirilebilir. Onlar kan akımını bozabilir olarak gerilim ve keskin açılar kaçınılmalıdır. Stabilizasyon (pembe renk muhafaza edilmelidir) görsel bezi inceleyerek veya epifluoresan yoluyla kan akışını incelemek hemen sonra. Kan damarları ve kan hücrelerinin çeşitli de m-domates ile etiketlenmiş çünkü GFP / m-domates fare olarak, kan akımının bütün değişiklikler kolayca değerlendirilebilir. </li><li> Gazlı bez ve ısıtmalı ped ile hayvan örtün. W teçhiz edilmiş bir termometre kullanarak maruz bezinin sıcaklığını ölçmekith maruz bezinin bir tarafı ile temas halinde yerleştirilmiş olan küçük bir esnek termokupl sondası. </li></ol> Bölüm 4: Görüntüleme Parametreleri <ol><li> GFP veya RFP filtre kümesini kullanarak ya bezinin yüzeyi üzerinde epifloresans aydınlatma odak kullanma. SG yüzeyini bulun ve kılcal kan akışını ve doku genel morfolojisi değerlendirmek. Doku hasarı belirtileri, zann kabarmasıyla veya büyük hücre arası boşlukların görünümünü içerir. </li><li> Ya epifluoresan ile ya da seçilen alan ön tarama ile doku stabilitesini değerlendirmek. Hareket eserler çoğu post-processing veri analizinde kaldırıldı veya düzeltilmiş olamaz beri istikrarlı bir hazırlık esastır. Hazırlık kararlı değilse, ayarlamalar gereklidir. </li><li> Uygun odak düzlemi görüntüyü ön-tarama modu (1X zum) olarak bezleri bulmak ve yavaş yavaş asiner yapılar, salgı granülleri ve p kadar lamel doğru hedefe taşımak içinLasma zar (Şekil 2) açık bir şekilde görünür hale gelir. </li><li> Geçen zaman için görüntüleme parametreleri, bireysel deneye bağlıdır. Görüntü salgı granülleri dinamikleri 0.5-2 saniye / kare bir tarama hızı kullanmak ve bir 0.2 mm / piksel mekansal ölçek (yaklaşık 50 mikron x 50 mikron görüş alanında) ile 256 x 256 piksel. Optimal olarak granüller ve plazma membranını görselleştirmek amacıyla, optik kalınlık 0,9-1,2 um arasında ayarlanmalıdır. GFP ve tandem-domates tahrik etmek için, bir sırası ile, 488 nm ve 561 nm arasında bir dalga boyuna kullanabilir. Tepe gücü 488 nm ve 561 nm için 1 mW için yaklaşık 0,5 mW ayarlanır. Bu minimal photobleaching sağlar. </li><li> Detektör ayarları dinamik aralıkta muhafaza sinyali ve numune parlaklığına bağlı ayarlanması gerekir. </li><li> Tüm parametreleri ayarlandıktan sonra, görüntüleme başlamış olabilir. İlk olarak, bir referans noktası olarak kullanılacak görüş alanının bir fotoğrafını çeker. Sürezaman atlamalı görüntüleme, X, Y ve Z doku sürüklenen oluşabilir. Bu manuel olarak tarama alanı ve Z konumunu ayarlayarak telafi edilebilir. Ayarlamaları ve yavaş yavaş, küçük artışlarla eserler önlemek için yapılmalıdır. Ayrıca, referans resim ışıkla ağartma meydana olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Önemli photobleaching (floresan fazla% 15-20 azalma) tespit edilirse, 0.1 mW ile lazer gücünü azaltır. </li><li> Tuzlu su içinde, izoproterenol taze hazırlanmış bir solüsyonu enjekte deri altından 0.1 mg / kg, eksositosizini teşvik etmek. Ekzositoz enjeksiyondan sonra yaklaşık 1 dakika tetiklenir. Plazma membranı ile füzyonu granülleri tanelerin çevresinde GFP floresan bir artış ve sınırlayıcı membran içine tandem-Domates peptidlerin difüzyon (Şekil 3) tarafından tespit edilecektir. Biz aynı bölgede 3-4 time-lapse dizileri, 10 dakika her edinme öneririz. </li><li> Görüntüleme oturumundan sonra, ane euthanizeötenazi odasında CO 2 inhalasyon (10 dakika için 10-12 mmHg) tarafından hayvan sthetized. </li></ol>

<ol>
	<li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy.">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li><li>Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+exocytosis:+novel+insights+from+intravital+microscopy.">Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy.</a> Traffic. 13, 627-634 (2012).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).</li><li>Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+microscopy+for+studying+the+uptake+and+trafficking+of+fluorescently+conjugated+molecules+in+live+rodents.">Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents.</a> Traffic. 9, 1801-1810 (2008).</li><li>Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasmid+DNA+in+the+salivary+gland+epithelium:+novel+approaches+to+study+dynamic+cellular+processes+in+live+animals.">Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).</li><li>Sramkova, M., Najman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. , (2012).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Everything+you+need+to+know+about+intravital+microscopy:+A+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals.">Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, (2012).</li><li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+image+membrane+trafficking+in+live+rats.">Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats.</a> Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).</li><li>Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+intravital+microscopy+of+hepatic+transport.">Quantitative intravital microscopy of hepatic transport.</a> Intravital. 1, 44-53 (2012).</li><li>Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+excitation+microscopy+in+intact+animals.">Multi-photon excitation microscopy in intact animals.</a> J. Microsc. 222, 58-64 (2006).</li><li>Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+morphology+and+functional+dynamics+of+vital+murine+intestinal+mucosa+revealed+by+autofluorescence+2-photon+microscopy.">Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).</li><li>Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degranulation+of+rat+salivary+glands+following+treatment+with+receptor-selective+agonists.">Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).</li></ol>

Şimdiye kadar hücre içi yapılar daha çok in vitro (örneğin, hücre kültürleri,) ya da sık sık olduğu gibi canlı dokuların 6&#39;nın özelliklerini özetlemek olmayan ex vivo (örneğin, organ kültürleri, doku dilimleri, asinar preparatlar) model sistemlerinde de görüntülenmiştir edilmiştir. Bu fareler yaşayan belirli bir membran kaçakçılığı adım (yani regüle ekzositoz) dinamiklerini görüntüleme sağlayan bu yana, bu anlamda, burada sunulan yaklaşı...

Geçtiğimiz iki yıl içinde canlı mikroskobu gelişi ve floresan proteinlerin kullanımı, böylece hücre biyolojisi 1 anlayışımızı ilerleyen, akla gelebilecek her hücresel süreç üzerinde büyük atılımlar yol açmıştır. Bu alan deneysel manipülasyonlar konusunda özellikle son derece güçlü modeli sistemleri, memeli hücre kültürlerinin kullanılması büyük faydalar vardır. Ancak, genellikle karmaşık çok hücreli organizmaların 2 biyoloji gerçek temsilini vermemektedir. Bu sorun, nörobiyoloji, immünoloji ve tümör biyolojisi 3 gibi alanlarda önemli biyolojik soruları soruşturma için kapıyı açtı intravital mikroskobu (IVM) geliştirilmesi ele başlanmıştır. Şimdiye kadar, IVM göre çalışmaların çoğu hücre içi bölmelerin dinamikleri hakkında herhangi bir bilgi vermeden, doku ve tek tek hücrelerin düzeylerinde ifa edilmiştir. Son zamanlarda, laboratuvar ve diğers canlı kemirgenler 4-7, 13-15 ve in vivo olarak farmakolojik ve genetik manipülasyonlar izin görüntüleme hücre içi yapıların sahip IVM teknikleri geliştirmiştir. Bu yaklaşım, in vivo membran ticaretini incelemek için bizim tarafımızdan kullanılan ve daha spesifik endositoz ve ekzositoz olayları 6,7 düzenlenmiştir. Bizim deneysel model sistem, teşhir stabilize ve anestezi kemirgenler submandibular tükürük bezleri (SGS) görüntüleme dayanmaktadır. IVM için bir model organı olarak SG-seçimi bezleri küçük bir ameliyat ile kolayca erişilebilir olması nedeniyle, kendi fizyolojisini ödün vermeden dışsallaştırılabileceği ve kalp atışı ve solunum nedeniyle hareket eserler azaltmak için stabilize edilebilir. Buna ek olarak, SGS seçici tükürük kanal 8,9 ile viral veya non-viral vektörlerin ya da bazlı püskürtülmesiyle genetik olarak manipüle edilebilir. Son olarak, SGS polarize epith oluşan salgı bezleri vardırasinüsü ve kanalları, miyoepitelial hücreler ve stromal hücrelerin karmaşık bir populasyonu oluşturmak Elial hücreleri. Bu nedenle, onlar bizim son çalışmalarda 10 vurgulandığı gibi, ekzositoz, endositoz, gen teslimi ve aktin iskeletinin çalışma, ve bu hücre polarite, hücre bölünmesi, hücre-hücre biyolojisi gibi yönlerini çalışma fırsatı sunmak için mükemmel bir model vardır hücre kavşaklar ve iyon kanalları. Bu yazıda detaylı olarak canlı bir fare SG-epitelinde subselüler çözünürlük elde etmek için bir görüntüleme protokol açıklar. Özellikle, biz nasıl regüle ekzositoz sırasında SGS asiner hücrelerinde görüntü salgı granülleri göstermek. Daha önce gösterildiği gibi, beta-adrenerjik reseptör agonistleri ile uyarılması üzerine, salgı granüller apikal plazma membranı ile füzyon ve kademeli olarak daraltmak için asinar kanalcık 6 içine içeriklerini serbest bırakır. Amacımız m araştırmacılara temel araçları sağlamak içincerrahi prosedürler ve hayvan kullanımı konusunda inimal deneyim, başarılı bir hücrealtı çözünürlükte IVM gerçekleştirmek böylece. IVM de en zorlu kısmı hayvanın hazırlık olduğundan, burada biz onların işlevini ödün vermeden SGS ortaya çıkarmak ve hareketsiz için kullanılmaktadır temel cerrahi prosedürlerin açıklaması odaklanın. Sistemik floresan probları teslimi, transgenik hayvanların kullanılması ya da her ikisinin bir kombinasyonu gibi alt-hücresel yapılar, çeşitli stratejiler, etiketlemek için işlemler için olduğu gibi, başka bir yerde 7,11 tarif edilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflourane (Forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>101936-40</td>
			<td>Handle under chemical hood</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine (ketaved)</td>
			<td>Fort Dodge Animal Health</td>
			<td>57457-034-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine (Anased)</td>
			<td>Akorn, Decatur</td>
			<td>61311-481-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neomycin/Polymyxin B</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>24208-785-55</td>
			<td>Use to lubricate the eye of the mouse</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carbomer-940</td>
			<td>Ashalnd, Inc.</td>
			<td>4607-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td>Add drop wise to prevent the solution to solidify</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoproternol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16504</td>
			<td>Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 &deg;C</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflurane V 1.9 (Vaporizer)</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>190AF</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Portable Downdraft table equipped with HEPA filter</td>
			<td>Hazard Technology</td>
			<td>PDDT</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Heat lamp, Model HL1</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>HL-1 US</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MicroTherma 2T Thermometer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TW2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Operating Scissors (11.5 cm straight</td>
			<td>World Precision Instruments </td>
			<td>5003708-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#7 curved tip tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14187</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503365</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black Braided Silk suture #4.0</td>
			<td>George &amp; Tiemann &amp; Co</td>
			<td>160-1219-4</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gauze sponges 2" x 2"</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td>9022</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lens cleaning tissue</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CL-TISSUE (M97) AX6476</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins

Burada konfokal mikroskopi intravital kullanımına dayanan, canlı kemirgenlerde görüntü hücre içi yapılarda hiç bir yöntem tarif eder. Onlar çeşitli avantajlar sağlamak beri bir model organ olarak, biz canlı farelerin tükürük bezleri kullanın. İlk olarak, kolayca optik erişim sağlamak maruz bırakıldı ve kalp atışı ve solunum nedeniyle hareket eserler azaltılmasını kolaylaştırmak için stabilize edilebilir. Bu durum görüntü ve küçük hücre içi yapıları izleme kolaylaştırır. İkinci olarak, tükürük bezlerinin hücre popülasyonlarının çoğu organın yüzeyinden erişilebilir. Bu, iki foton mikroskopi gibi in vivo görüntüleme için kullanılmış olan diğer teknikler, daha yüksek bir uzamsal çözünürlüğe sahip konfokal mikroskopi kullanımına izin verir. Son olarak, tükürük bezleri kolayca böylece moleküler düzeyde biyolojik süreçleri araştırmak için güçlü bir sistem sağlayarak, farmakolojik ve genetik olarak manipüle edilebilir. Bu çalışmada akinar hücrelerinde salgılama granüllerin Ekzositoz ve salgı granüller beta-adrenerjik reseptörlerin stimülasyonu üzerine sigorta apikal plazma zarının dinamiklerinin kinetiğini takip etmek için tasarlanmış bir protokol üzerinde odaklanır. Özellikle, sitosolik GFP floresan protein ve tandem-domates ile ikame edilmiş bir membran-hedefli bir peptit birlikte-ifade eden transgenik bir fare kullanılmıştır. Ancak, tükürük bezleri stabilize etmek ve görüntü için kullanılan prosedürler, diğer fare modellerinde uzatıldı ve bu endozomlarda, lizozomlarda, mitokondri gibi çeşitli hücre içi yapıların görselleştirme sağlayan, in vivo hücre bileşenleri etiketlemek için diğer yaklaşımlar akuple edilebilir ve aktin hücre iskeleti.

GFP / mTomato fare, acininin sitozolik GFP ve membran hedefli tandem-Domates peptid (Şekil 2, kırık çizgi) ifade açıkça farklı yapıları, görünür. Bireysel asinüs olarak, asiner hücreler tandem-Domates peptid tarafından betimlenir. GFP, aynı zamanda açık bir şekilde (Şekil 2, oklar) acinar hücreleri içinde görebilir çekirdeklerinde tespit edilir. Sitozolik GFP çapı yaklaşık 1-1.5 mikron koyu dairesel veziküllerini (Şekil 2, inset, ok uçlar...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins at JoVE.com

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital mikroskopi canlı hayvanlarda çeşitli biyolojik süreçleri görüntüleme sağlayan güçlü bir araçtır. Bu yazıda, canlı farelerde tükürük bezlerinde bu salgılama granüller gibi alt-hücresel yapıların, dinamiklerini görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz.

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

intravital-microscopy-for-imaging-subcellular-structures-live-mice

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K Görüntüleme.  National Institutes of Health.  Intravital mikroskopi canlı hayvanlarda çeşitli biyolojik süreçleri görüntüleme sağlayan güçlü bir araçtır. Bu yazıda, canlı farelerde tükürük bezlerinde bu salgılama granüller gibi alt-hücresel yapıların, dinamiklerini görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. 

Video: Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Floresan üzerinden F-aktin Dynamics Canlı Hücre Görüntüleme speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Biyoloji

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

VE Floresan Etiketleme Drosophila Kalp Yapıları

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Canlı Hücre Görüntüleme için SNAP-tag Fusion Proteinler ifade COS-7 Floresan Etiketleme

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Transplantasyon GFP of-Kimerik Zebra balığı Embriyolar Retina ve Beyin Gelişimi Canlı Görüntüleme blastomer ifade

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of fluorescence can be changed by exposure to light of a specific wavelength. Optical highlighting allows noninvasive marking of a subpopulation of fluorescent molecules, and is therefore ideal for tracking single cells or organelles.
Critical parameters for efficient photoconversion are the intensity and the exposure time of the photoconversion light. If the intensity is too low, photoconversion will be slow or not occur at all. On the other hand, too much intensity or too long exposure can photobleach the protein and thereby reduce the efficiency of photoconversion.
This protocol describes a general approach how to set up a confocal laser scanning microscope for pc-FP photoconversion applications. First, we describe a procedure for preparing purified protein droplet samples. This sample format is very convenient for studying the photophysical behavior of fluorescent proteins under the microscope. Second, we will use the protein droplet sample to show how to configure the microscope for photoconversion. And finally, we will show how to perform optical highlighting in live cells, including dual-probe optical highlighting with mOrange2 and Dronpa.

This protocol describes a general approach to perform photoconversion of fluorescent proteins on a confocal laser scanning microscope. We describe procedures for the photoconversion of puried protein samples, as well as for dual-probe optical highlighting in live cells with mOrange2 and Dronpa.

Canlı Hücrelerde Floresan Proteinleri ve Çift prob Optik Vurgulama Saf, Fotoçevrim

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Photobleaching, sarı floresan Protein etiketli p62 indüklenen Aggresome benzeri yapılarda sonra Floresans kurtarma

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Hücre Altı Yapıların Süper Çözünürlüklü Canlı Hücre Görüntülemesi

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...