Este trabajo fue apoyado por la División de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID), el Instituto Nacional de Salud (NIH), EE.UU.. Todos los ratones fueron mantenidos a una Asociación Americana para la Acreditación de la instalación para animales acreditado Cuidado de Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID) y alojados de conformidad con los procedimientos establecidos en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio bajo los auspicios de un protocolo aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo del NIAID.

1. Aislamiento de células de médula ósea de ratón <ol><li> La eutanasia a los ratones que usan el protocolo de cuidado de animales de la institución comité aprobado y rociar la superficie del animal con 70% de etanol. </li><li> Hacer una incisión de la piel en la mitad del abdomen y quitar la piel de la parte distal del ratón incluyendo la piel que cubre las extremidades inferiores. </li><li> Cortar los músculos de las extremidades inferiores con unas tijeras y dislocar cuidadosamente el acetábulo de la articulación de la cadera, evitando romper la cabeza del fémur. </li><li> Quitar los músculos restantes del fémur y de la tibia con un bisturí y tijeras y separar del fémur de la tibia en la rodilla cuidado de las articulaciones ejercicio para no romper los extremos del hueso. Coloque los huesos en una placa de Petri que contiene medio RPMI enfriado con hielo 1640 1X suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> Continúe con los siguientes pasos bajo una campana de cultivo de tejidos. Tome precauciones adicionales para mantener estrictas técnicas estériles para evitar neutrophiactivación l. </li><li> Enjuague cada hueso con 70% de etanol (en una placa de Petri) seguido de tres lavados posteriores en PBS enfriado en hielo estéril (dentro de placas de Petri) para enjuagar el etanol a partir de la superficie de los huesos. </li><li> Dentro de una caja de Petri estéril limpio, cortar las epífisis de los huesos y mantener a un lado. </li><li> Utilice una aguja de calibre 25 y una jeringa de 12 cc llena con medio RPMI suplementado con 10% de FBS y 2 mM de EDTA, y lavar las células de médula ósea de ambos extremos de los ejes de hueso en un tornillo ml de la tapa del tubo Falcon de 50 equipado con un 100 micras filtrar. Con el fin de eliminar de manera eficiente todas las células, raspar la superficie interna de los huesos usando la aguja de calibre 25. </li></ol> NOTA: El blanqueo de los huesos indica que las células han sido suficientemente raspado. NOTA: Utilice aproximadamente 10 ml de medio para eliminar un fémur / la tibia par. Adición de EDTA para el medio es esencial para evitar la aglutinación de las células. <ol start="9"><li> Cortar las epífisis óseasen pequeños pedazos 0.5-1 mm 3 con un bisturí y aplastar a través del filtro de 100 micras utilizando la parte de atrás de un 2,5 ml Eppendorf Combitip Plus Biopur punta de pipeta. </li><li> Centrifugar a 1400 rpm durante 7 min a 4 ° C. </li><li> Lisar las células rojas de la sangre mediante la resuspensión del sedimento celular en 20 ml de NaCl al 0,2% durante aproximadamente 20 segundos seguido por la adición de 20 ml de 1,6% de NaCl. (Crítica: No exceda 20-30 segundos de lisis hipotónica para evitar la muerte de células de médula ósea se recomienda el uso de NaCl para la lisis hipotónica sobre tampón de lisis ACK ya que este último tiene la posibilidad de activar los neutrófilos.). </li><li> Centrifugar durante 7 min a 1400 rpm a 4 ° C para recoger las células. </li><li> Lavar las células con medio RPMI 1640 suplementado con 1X 10% de FBS y 2 mM de EDTA y se centrifuga como en el paso 1,12. </li><li> El rendimiento de células de médula ósea utilizando este método es aproximadamente un 60-80 millones por no infectada 8-12 semanas de edad C57BL / 6 de ratón. </li></ol> 2. La separación de neutrófilospor centrifugación en gradiente de densidad <ol><li> Contar las células de médula ósea y resuspender en 1 ml de PBS enfriado en hielo estéril. </li><li> Añadir 3 ml de Histopaque 1119 (densidad, 1,119 g / ml) en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Superposición de 3 ml de Histopaque 1077 (densidad, 1,077 g / ml) en el 3 ml de Histopaque 1119. </li></ol> NOTA: Histopaque 1119 y Histopaque 1077 se deben calentar a 18-26 ° C antes de su uso. Paso Crítico: Preparar gradientes inmediatamente antes de su uso como la preparación de la gradiente de antemano dará lugar a la difusión entre las dos capas y la pureza y la recuperación de neutrófilos subóptima. Paso Crítico: Superposición de Histopaque 1077 más de 1.119 necesidades que ser hecho lentamente con el fin de evitar la mezcla de las dos densidades, que se oponen a la separación de células durante la centrifugación. <ol start="4"><li> Superposición de la suspensión de células de médula ósea en la parte superior de la Histopaque 1077. </li></ol> Paso Crítico: overlaying la suspensión de células de médula ósea sobre Histopaque 1077 queda mucho por hacer lentamente con el fin de evitar molestar a la interfaz entre las células y Histopaque 1077. NOTA: La resuspensión células de médula ósea de un ratón no infectado en 1 ml de PBS produce neutrófilos pureza de&gt; 90%. Sin embargo, la puesta en común muchas muestras de médula ósea compromete la pureza de los neutrófilos, por ejemplo, resuspendiendo x 10 6 células 300 en 3 ml de PBS reduce la pureza de neutrófilos a partir de&gt; 90% a ~ 80%. Por lo tanto, los investigadores deben realizar experiencias piloto para identificar las condiciones de conteo / volumen celular ideal para sus experimentos específicos <ol start="5"><li> Centrifugar durante 30 min a 2000 rpm a 25 ° C sin freno. </li></ol> NOTA: La centrifugación del gradiente a temperatura ambiente es crítica y esencial para la separación eficaz de los neutrófilos. <ol start="6"><li> Recoger los neutrófilos en la interfaz de la Histopaque 1119 y Histopaque 1077 capas. </li&gt; <li> Lavar los neutrófilos recogidos dos veces con medio RPMI 1640 suplementado con 1X 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina y se centrifuga a 1400 rpm durante 7 min a 4 ° C. </li><li> Cuente los neutrófilos y determinar su viabilidad. </li></ol> NOTA: Los neutrófilos son típicamente&gt; 95% viable y&gt; 90% puro según se determina por análisis FACS. El rendimiento típico de neutrófilos desde la médula ósea (es decir, 2 fémur y la tibia 2 huesos) de una no infectada 8-12 semanas de edad C57BL / 6 del ratón es ~ células 6-12.000.000. Este número es sustancialmente mayor cuando se cosechan los neutrófilos desde la médula ósea de los animales infectados. Por lo tanto, ~ 30-40 millones de neutrófilos / ratón se recuperaron cuando se utilizaron ratones infectados por Candida para la cosecha de 6 celdas. 3. Etiquetado de los neutrófilos con colorantes CellTracker <ol><li> Resuspender los neutrófilos a 5 x 10 6 células / ml en PBS precalentado a 37 º C. </li><li> Añadir un tinte CellTracker a una concent definitivaración de 5 mM. </li></ol> NOTA: CellTracker Green (CMFDA (5 Chloromethylfluorescein Diacetate) y CellTracker Orange (CMTMR (5 - (y-6)-4-clorometil tetrametilrodamina Amino benzoilo) fue utilizada en este protocolo para etiquetar diferencialmente neutrófilos de tipo salvaje y el gen deficiente ratones. NOTA: Se prepara una solución madre de 10 mM de CellTracker verde y CellTracker Orange, alícuota y almacenar a -80 ° C hasta el día del experimento. <ol start="3"><li> Incubar los neutrófilos con 5 M del colorante CellTracker correspondiente durante 10 min a 37 ° C en un baño de agua con agitación en la oscuridad. </li><li> Lavar las células dos veces con helado de medio RPMI 1640 suplementado con 1X 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina. </li></ol> NOTA: un lavado eficaz de las células después es esencial el paso marcado con el colorante CellTracker para evitar la contaminación cruzada de tinte antes de mezclar poblaciones de neutrófilos diferencialmente etiquetados para amortizacionesestudios de repoblación competitivos tream. 4. La transferencia adoptiva de neutrófilos en ratones y análisis de neutrófilos transferidos mediante citometría de flujo <ol><li> Volver a suspender las neutrófilos en PBS enfriado en hielo a una concentración de 25 x 10 6 células / ml e inyectar 200 l de la suspensión en la vena lateral de la cola de manera que 5 x 10 6 neutrófilos se transfieren por ratón. Para los estudios de neutrófilos repoblación competitivos, mezcle los neutrófilos de tipo salvaje y el gen deficiente en una proporción de 1:1 y se inyecta un total de 5 x 10 6 neutrófilos por ratón como arriba. </li></ol> NOTA: Por lo menos hasta 10 x 10 6 neutrófilos pueden adoptiva transferidos por ratón sin toxicidad evidente inmediato a los animales. <ol start="2"><li> En diferentes momentos después de la transferencia adoptiva (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 horas después de la transferencia), la eutanasia a los ratones y la sangre de la cosecha, y / o la médula ósea y / o de otro órgano diana (s) de interés. </li><li> Preparar sisuspensiones de células NGLE de estos tejidos para el análisis cuantitativo y cualitativo de los neutrófilos transferidas adoptivamente etiquetados utilizando protocolos publicados 6,15. </li><li> Tras la tinción vivo / muerto viabilidad y bloqueo Fc, marcar células con CD45 (clon 30-F11), Ly6G (clon 1A8) y CD11b (clon M1/70) y la puerta en vivo + CD45 + CD11b + Ly6G neutrófilos. Los neutrófilos en esta puerta incluyen neutrófilos nativas del ratón receptor, así como los neutrófilos marcados adoptivamente transferidas, que son FITC + (si etiquetado con CellTracker verde) o PE + (si etiquetado con la célula Rastreador de naranja). </li></ol> NOTA: Los neutrófilos pueden ser rastreados en la sangre, la médula ósea y el riñón de los ratones infectados con Candida durante al menos 4 horas después de la transferencia. NOTA: La fijación con 2% de paraformaldehído en PBS no afecta adversamente a la intensidad de fluorescencia media de los neutrófilos marcados con Gr. CellTrackereen o CellTracker naranja durante al menos 48 horas.

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Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

En este documento se presenta un protocolo fiable, sencillo, rápido y económico para el aislamiento de un gran número de neutrófilos desde la médula ósea de ratones con alta pureza y la viabilidad utilizando un enfoque de centrifugación en gradiente de densidad. Cuando este protocolo se lleva a cabo correctamente, ~ 6-12 × 10 6 neutrófilos pueden ser recuperados de un ratón no infectado y un máximo de ~ 30-40 × 10 6 neutrófilos pueden aislarse a partir de un ratón después de la infec...

Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en los seres humanos. Ellos son el principal componente celular del sistema inmune innato y actúan como una primera línea de defensa contra los microorganismos invasores. Los pacientes con neutropenia adquirida y las inmunodeficiencias primarias que afectan el número de neutrófilos y / o la función de desarrollar infecciones bacterianas y fúngicas invasoras que amenazan la vida, destacando la importancia de estas células en la defensa de acogida 1. El reconocimiento inmune de patógenos invasores en el sitio de la infección por sus receptores de reconocimiento de patrones resultados análogos en la inducción de una respuesta inmune innata orquestada, lo que conduce a la secreción de factores quimiotácticos que generan un gradiente quimiotáctico capaz de reclutar neutrófilos de la circulación sanguínea en el tejido inflamado 2 . Después de neutrófilos entran en el sitio de la infección, que se activan, lo que conduce a la producción de citoquinas y quimioquinas, la absorción de patógeno, y matar a través de mí oxidativo y no oxidativocanismos 3. Además de su papel bien conocido en la inmunidad innata, los neutrófilos también se ha demostrado recientemente para desempeñar papeles importantes como iniciadores de la respuesta inmune adaptativa eficaces 4. Por otro lado, además de sus funciones de protección en la inmunidad, los neutrófilos también pueden mediar la lesión tisular e inmunopatología debido a la acumulación excesiva y / o la activación a sitios de inflamación, como se muestra en una variedad de enfermedades infecciosas y autoinmunes 5-7. A pesar del papel indispensable de los neutrófilos en el montaje de la respuesta inmune innata eficaces y sus funciones efectoras pleiotrópicos en varias enfermedades infecciosas y afecciones inflamatorias, dificultades técnicas con el manejo de estas células y la falta de protocolos experimentales fiables ha dificultado la investigación con los neutrófilos en las últimas décadas. Por lo tanto, el uso de ensayos reproducibles para el aislamiento de los neutrófilos debería facilitar aún más la investigación sobre los neutrófilos mediada por inmunofunciones de lógica ex vivo e in vivo. Hasta la fecha, varios métodos han sido descritos para el aislamiento de neutrófilos, tales como centrifugación en gradiente de densidad de la sangre humana y la sangre o la médula ósea del ratón 8,9, enriquecimiento inmunomagnética positivo o negativo de los neutrófilos de la sangre o la médula ósea del ratón 10,11, y la cosecha de los neutrófilos de la cavidad peritoneal de los ratones después de la inyección intraperitoneal de tioglicolato o otros agentes inflamatorios 12. Aunque los neutrófilos pueden ser fácilmente aislados en grandes cantidades a partir de sangre humana, este método es subóptima en ratones debido al volumen limitado de sangre de ratón que se opone a aislamiento de neutrófilos suficientes para estudios funcionales o experimentos de transferencia adoptiva 13. Además, aunque el rendimiento de tioglicolato-suscitó las células de la cavidad peritoneal es mayor en comparación con la de la sangre del ratón, la pureza de los neutrófilos en el lavado peritoneal inflamatoria varía entre60-90%, y los neutrófilos aislados exhiben un fenotipo activado. Por lo tanto, las células recogidas usando este método sólo se puede utilizar para llevar a cabo estudios funcionales de activado, pero no de los neutrófilos no estimulados, como la cavidad peritoneal del ratón tiene pocos neutrófilos en el estado estacionario 12. En su lugar, la médula ósea es un depósito conveniente para la recolección de un gran número de neutrófilos no estimulados o activados ya sea 11,14, que luego se pueden utilizar para los estudios funcionales aguas abajo tales como la fagocitosis, la desgranulación y la matanza, o para la transferencia adoptiva en ratones receptores. Aquí se describe un protocolo simple y rápido (~ 2 h), que proporciona un alto rendimiento (~ 6-12 × 10 6 neutrófilos / ratón no infectado, o hasta 30-40 × 10 6 neutrófilos / ratón infectado) puro de (80 -95%) los neutrófilos con&gt; 95% de viabilidad de la médula ósea. Este método utiliza Histopaque disponibles comercialmente, que son la densidad de separación celular gradientemedios de racionamiento que consisten de Ficoll y diatrizoato de sodio, para separar los neutrófilos desde la médula ósea de los ratones. Este método produce un número significativamente mayor de neutrófilos por ratón en comparación con la sangre o la cavidad peritoneal, que puede ser utilizado para recoger los neutrófilos de ratones, tanto en estado estacionario o después de la infección, y es más fácil a la capa en comparación con el método de centrifugación en gradiente de densidad discontinuo que utiliza gradientes de Percoll que consisten de 55% / 65% / 75% de Percoll en PBS 9. Además, el tiempo y los recursos necesarios para recoger los neutrófilos puras se redujo significativamente en comparación con el uso de aislamiento de neutrófilos activados por fluorescencia de clasificación de células. También, ya que este método no implica una etapa de enriquecimiento inmunomagnética, es más rentable, y que evita la exposición de las células a la columna magnética y anticuerpos, disminuyendo así la probabilidad de activación de neutrófilos. Además de realizar estudios funcionales de neutroph aisladoILS ex vivo y la transferencia adoptiva de células en ratones receptores, este protocolo también describe un método para el etiquetado de los neutrófilos aislados utilizando diferentes colorantes CellTracker. Etiquetado diferencial de los neutrófilos de ratones de diferentes orígenes genéticos se puede adaptar en los estudios de repoblación competitivos para el seguimiento de los neutrófilos transferidos en los tejidos de los ratones receptores usando citometría de flujo, que puede proporcionar una visión mecanicista sobre el papel directo de los genes específicos en el tráfico de neutrófilos de la sangre en órganos diana inflamadas 6.

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 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES</td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>10-041-CV</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)</td>
 <td>GemCell</td>
 <td>100500</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>15140</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5 M EDTA</td>
 <td>Quality Biological Inc</td>
 <td>351-027-101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.2% and 1.6% sodium chloride</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>3624</td>
 <td>Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile filtered Histopaque 1077</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>10771</td>
 <td>Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 &deg;C before use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile filtered Histopaque 1119</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>11191</td>
 <td>Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 &deg;C before use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium</td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>210-40-CV</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl Alcohol (200 proof)</td>
 <td>The Warner Graham Company</td>
 <td>64-17-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C-7025</td>
 <td>Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C-2927</td>
 <td>Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>170451-82</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>551461</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>560599</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>47-0112-82</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>553141</td>
 <td>Use at 1:100 dilution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td>L-23105</td>
 <td>Use at 1:1000 dilution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>67-68-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
 <td>USB Corporation</td>
 <td>19943</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6 mice</td>
 <td>Taconic</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml centrifuge tubes</td>
 <td>Corning</td>
 <td>430053</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml centrifuge tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229225B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229210B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229205B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes (3 ml)</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>357575</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12 ml syringes</td>
 <td>Kendall monoject</td>
 <td>512878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)</td>
 <td>BD</td>
 <td>305122</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 mm cell strainers</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352360</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bactericidal Petri dishes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>351029</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Combitips Plus Biopur</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>2249608-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)</td>
 <td>Biomedical Research Instruments</td>
 <td>10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000</td>
 <td>Instruments sterilized prior to use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture hood</td>
 <td>The Baker Company</td>
 <td>SG403</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated centrifuge</td>
 <td>Thermo Fischer Scientific</td>
 <td>75004521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>37 &deg;C shaking water bath</td>
 <td>Thermo Fischer Scientific</td>
 <td>3166721</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments

Los neutrófilos son las células efectoras críticas del sistema inmune innato. Ellos son reclutados rápidamente en sitios de inflamación aguda y ejercen efectos protectores o patógenos dependiendo del medio inflamatorio. No obstante, a pesar de la función indispensable de los neutrófilos en la inmunidad, la comprensión detallada de los factores moleculares que median efectos efectoras y inmunopatogénico neutrófilos &#39;en diferentes enfermedades infecciosas y condiciones inflamatorias que aún falta, en parte debido a su corta vida media, las dificultades con la manipulación de estos las células y la falta de protocolos experimentales fiables para la obtención de un número suficiente de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo y los experimentos de transferencia adoptiva. Por lo tanto, los métodos simples, rápidos, económicos y fiables son muy deseables para la recolección de un número suficiente de los neutrófilos de ratón para evaluar funciones como la fagocitosis, la matanza, la producción de citoquinas, degranulación y la trata. Para ese fin,se presenta un protocolo basado en centrifugación de gradiente de densidad reproducible, que se puede adaptar en cualquier laboratorio para aislar un gran número de neutrófilos desde la médula ósea de ratones con alta pureza y viabilidad. Por otra parte, se presenta un protocolo simple que utiliza colorantes CellTracker para etiquetar los neutrófilos aislados, que pueden entonces ser transferidos de manera adoptiva en ratones receptores y rastreados en varios tejidos durante al menos 4 horas después de la transferencia usando citometría de flujo. El uso de este enfoque, el etiquetado diferencial de los neutrófilos de ratones de tipo salvaje y deficiente en el gen con diferentes colorantes CellTracker se puede emplear con éxito para llevar a cabo estudios de repoblación competitivos para evaluar el papel directo de los genes específicos en el tráfico de los neutrófilos de la sangre a los tejidos diana in vivo .

Este protocolo se ha optimizado para la cosecha de células de médula ósea de los ratones y la posterior separación de los neutrófilos de estas células por centrifugación en gradiente de densidad utilizando Histopaque medios de separación de células disponibles comercialmente. Los neutrófilos aislados utilizando este método se puede utilizar para una variedad de estudios de aguas abajo funcional ex vivo y para los experimentos de transferencia adoptiva en ratones receptores. <p class="jove_content...

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Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Se describe un protocolo para el aislamiento y purificación de los neutrófilos de médula ósea de ratón por centrifugación en gradiente de densidad y para el etiquetado de neutrófilos usando colorantes CellTracker. Esto representa un método sencillo, rápido, reproducible y económico para la obtención de un gran número de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo o experimentos de transferencia adoptivos y seguimiento.

Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

isolation-purification-labeling-mouse-bone-marrow-neutrophils-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

61.3K vistas.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH. Se describe un protocolo para el aislamiento y purificación de los neutrófilos de médula ósea de ratón por centrifugación en gradiente de densidad y para el etiquetado de neutrófilos usando colorantes CellTracker. Esto representa un método sencillo, rápido, reproducible y económico para la obtención de un gran número de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo o experimentos de transferencia adoptivos y seguimiento.

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Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

La metástasis experimentales y CTL Modelo inmunoterapia adoptiva de transferencia de ratón

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Investigación

Inmunología e Infección

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Generación y Etiquetado de murino médula ósea procedentes de células dendríticas con nanocristales Qdot de Estudios de seguimiento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos<em&gt; En Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murino Hind Limb largo Bone La disección y el aislamiento de médula ósea

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

Aislamiento y caracterización de micropartículas de neutrófilos derivado de estudios funcionales

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that antigen-presenting dendritic cells (DCs) can sense elevated extracellular sodium leading to the activation of the NADPH oxidase and formation of isolevuglandin (IsoLG)-protein adducts. These IsoLG-protein adducts react with self-proteins and promote an autoimmune-like state and hypertension. We have developed and optimized state-of-the-art methods to study DC function in hypertension. Here, we provide a detailed protocol for isolation, in vitro treatment with elevated sodium, and adoptive transfer of murine splenic CD11c+ cells into recipient mice to study their role in hypertension.

Here, we present a protocol to isolate dendritic cells from murine spleens by magnetic cell sorting and subsequent adoptive transfer into na&#239;ve mice. The model of high-salt activated dendritic cells was chosen to explain the step-by-step procedures of adoptive transfer and flow cytometry.