Este trabajo fue apoyado por el NIH NIDCD Y1-CC-8002-01. Este trabajo se realizó bajo los auspicios del Departamento de Energía de los EE.UU. por el Laboratorio Nacional Lawrence Livermore en virtud de contrato DE-AC52-07NA27344.

1. Asamblea de la sonda de Refuerzo Esta sección del protocolo describe la fabricación de un refuerzo de silicio, y el montaje de una sonda de polímero de película delgada al rigidizador. Figura 1 ilustra una sonda típica neuronal polímero junto con el refuerzo propuesto. Los detalles del diseño de refuerzo se muestran en la Figura 2. La nueva característica de este diseño es la poco profunda &quot;mecha&quot; canal corre a lo largo de su longitud que se utiliza para distribuir adhesivo líquido durante el montaje. La parte más ancha del refuerzo es una ficha para la manipulación durante el montaje y la inserción quirúrgica. El depósito de la ficha se conecta al canal. El componente está fabricado de silicio usando procesos estándar de microfabricación. <ol><li> El refuerzo de silicio con un canal de efecto de mecha se fabrica a partir de un (SOI) oblea de silicio sobre aislante con un espesor de capa de dispositivo igual al espesor deseado del rigidizador ( <strong&gt; Figura 3A). Un rango razonable de espesor de refuerzo es de 20-100 micras. Se recomienda que la anchura del refuerzo sea de 20-30 m menor que la anchura de la sonda, lo que ayuda a evitar el desbordamiento del adhesivo de la interfaz de unión a la parte superior de la sonda. Primero los canales de capilaridad son usando el proceso estándar Bosch (Figura 3B)-grabado en seco. Siguiente, la geometría de refuerzo está definido por una etch ya que se detiene en la capa de óxido enterrada (Figura 3C). Por último, los refuerzos son liberados por la capa de óxido enterrado húmedo grabado en el 49% de ácido fluorhídrico (Figura 3D). Después de aclarar a fondo los refuerzos, remojar en agua desionizada durante 15 min. </li><li> Coloque un pellet de polietilenglicol (PEG) de peso molecular 10.000 g / mol en el depósito (Figura 4). Calentar el rigidizador a 65 ° C, de modo que el PEG se funde y se absorbe en el canal por acción capilar. A continuación, enfriar a temperatura ambiente para solidificar. </li&gt; <li> La Figura 5 muestra un esquema del chip Bonder flip configurado. Coloque el refuerzo de cabeza en el escenario base del dispositivo de unión flip chips, a continuación, recoger el refuerzo con la cabeza de la herramienta. Coloque la sonda en posición invertida sobre el escenario base. Utilizando el dispositivo de unión flip chip alinear el refuerzo y la sonda y luego baje el refuerzo y colocarlo en la sonda. </li><li> La etapa de base del dispositivo de unión flip chip de debe tener un elemento de calentamiento para aplicar calor al sustrato. Después de colocar el refuerzo, calentar el conjunto una vez más a 65 ° C. Deje un minuto para que el PEG de refusión y comenzar a llenar en la interfaz entre la sonda y refuerzo. Enfriar a solidificar. </li><li> Gire el conjunto sobre e inspeccionar desde la parte superior. Vuelva a calentar según sea necesario para permitir que el PEG para llenar completamente la interfaz entre la sonda y el rigidizador. Esto puede ser evaluado visualmente puesto que la sonda es transparente. Cuando el conjunto está sentado en el calentador superior-(sonda) hacia arriba, coloque manualmente 1-3 epellets de xtra de PEG sólido a la lengüeta de manera que se funden sobre la sonda, que proporciona un refuerzo adicional en esta región (Figura 6). Finalmente, deje que el montaje se enfríe para que el PEG se solidifica. En este punto, el conjunto está listo para la inserción quirúrgica. </li></ol> 2. La inserción y extracción <ol><li> Montar el conjunto de sonda de refuerzo a un micromanipulador, como se ilustra en la Figura 7A mediante la adhesión la parte posterior del rigidizador al brazo micromanipulador en la región de pestaña. Esto se puede hacer con la cinta de doble cara o cemento, pero tenga cuidado de no ponerse en contacto con la sonda con adhesivo. Fije temporalmente el extremo del conector de la sonda a la micromanipulador con un pequeño pedazo de masilla adhesiva de tal manera que se puede quitar fácilmente con baja fuerza. </li><li> Coloque el conjunto de la sonda sobre el blanco e inserte la sonda con la velocidad de inserción deseado. Se utiliza una velocidad de inserción de ,13-,5 mm / seg en el desarrollo de este protocolo. &lt;/ Li&gt; <li> Retire inmediatamente el extremo del conector de la sonda del micromanipulador suavemente y dejarla en una superficie cercana, como un segundo brazo manipulador (Figura 7B). Esto se debe hacer antes de que el PEG comienza a disolverse para evitar el desplazamiento de la sonda. </li><li> Dé tiempo para PEG se disuelva. Esta cantidad de tiempo dependerá de PEG de peso molecular y el área de contacto entre la sonda y de refuerzo. Por ejemplo, con el PEG de peso molecular de 10.000 g / mol, una sonda de microelectrodo de aproximadamente 6 mm y un rigidizador que es coincidente 306 micras de ancho, 15 min se ha encontrado que una cantidad adecuada de tiempo. Sección 3 del protocolo presenta un método para probar el tiempo de disolución requerida. Durante este tiempo, aplicar salina tamponada con fosfato (PBS) usando un cuentagotas alrededor del punto de pestaña y la inserción para disolver cualquier PEG que está por encima del objetivo (Figura 7C). </li><li> El uso de un microposicionador motorizado, comenzar la extracción del rigidizador mediante la aplicación de un desplazamiento de100 micras, con una velocidad de 5 mm / seg. Este movimiento rápido inicial ayuda a superar cualquier fricción estática y minimizar el desplazamiento de la sonda. Luego, completar la extracción de refuerzo a una velocidad más lenta de aproximadamente 0,1 mm / segundo (Figura 7D). </li><li> En el caso de una cirugía real, continúe con los procedimientos normales para aplicar el gel, de silicona, y / o acrílico dental en el sitio de inserción para asegurar y proteger la sonda, como se demuestra en 21. </li></ol> 3. Prueba en gel de agarosa Esta sección del protocolo describe un sistema para arriba y el procedimiento para examinar la extracción del rigidizador en un gel de agarosa al 0,6% que se aproxima a las propiedades mecánicas a granel, el pH, la salinidad y de tejido cerebral 17,22. Dado que el gel es casi transparente a través de distancias cortas, la separación de refuerzo y el desplazamiento de la sonda se puede observar. <ol><li> Preparar una solución de 0,6% de agarosa en tampón fosfato salino (PBS). Mezclar en un elementovada temperatura para disolver completamente el polvo de agarosa. Vierta la solución en una caja de acrílico superficial; gel debe ser 3/4- 1 en profundidad. Permitir al gel establecer a temperatura ambiente durante una hora. </li><li> Asegúrese de que el gel endurecido está saturado con PBS para que no se seque, y calentar el gel a 37 ° C. </li><li> Configurar el micromanipulador, caja de gel de agarosa, y el sistema de cámara microscópica como se muestra en la Figura 8. </li><li> Insertar la referencia fiducial de vidrio en el cuadro de gel de deslizándolo entre el gel y el lado de la caja (Figura 8). Utilice un palillo de dientes para cuadrar las características en el fiducial referencia al campo de visión del microscopio digital. </li><li> Monte el conjunto de la sonda para el micromanipulador como se describe en el paso 2.1. </li><li> Coloque el conjunto de la sonda sobre el gel de 1 mm por detrás del fiducial referencia. </li><li> Insertar la sonda en el gel, usando la cámara para guiar a una profundidad deseada en el campo de visión. &lt;/ Li&gt; <li> Mueva inmediatamente el extremo del conector de la sonda para descansar en una superficie cercana. </li><li> Realice los ajustes necesarios a la imagen de la cámara para centrarse en la sonda (las características fiduciales de referencia pueden ser un poco fuera de foco). Tomar una instantánea de la ubicación de la sonda. </li><li> Permitir PEG para disolver (este tiempo puede variar, y de hecho puede ser un parámetro para ser probado). Aplicar PBS cerca de la pestaña para disolver PEG que está por encima del gel. </li><li> Inicie la captura de vídeo, si lo desea, y comenzar la extracción del refuerzo como se describe en el paso 2.5. Cuando la extracción se completa, tomar una instantánea definitiva de la ubicación de la sonda. </li><li> Utilice las herramientas de procesamiento de imágenes para comparar las imágenes antes y después de la extracción de refuerzo. Utilice las funciones del fiduciario de referencia que son visibles en el campo de visión para registrar (alinear) las imágenes. Calibrar la escala de la imagen basándose en el tamaño de las características conocidas de la sonda. Medir la distancia de desplazamiento de la sonda. </li></ol>

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Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

El método descrito aquí proporciona un proceso bien controlado para conectar sondas de polímero de película delgada para refuerzos separados con un adhesivo biodissolvable. También se presenta el procedimiento quirúrgico recomendado para implementar estos rigidizadores extraíbles y una técnica para validar el procedimiento in vitro para una configuración de la sonda-rigidizador dado. Desde el rigidizador puede hacerse arbitrariamente rígida, el método puede facilitar la inserción de sondas relativam...

Arrays de microelectrodos son una herramienta esencial en la neurociencia, así como nuevas aplicaciones clínicas como prótesis. En particular, las sondas de penetración de micro-electrodos permiten la estimulación y registro de la actividad neuronal a través de un estrecho contacto con las células en el cerebro, la médula espinal y los nervios periféricos. Un reto importante para las sondas nerviosas implantados es la estabilidad y la longevidad de las funciones de estimulación y registro. Modelado y experimentales estudios de la interacción entre sondas de microelectrodos y tejido neural han sugerido que un mecanismo para la degradación es de micro-desgarro de tejido neural debido a la ligera movimiento relativo entre la sonda y el tejido 1-3. Una solución consiste en fabricar sondas flexibles que responden más a las propiedades de rigidez mayor parte del tejido neuronal con el fin de minimizar los micromovimientos relativa. Como tales, los polímeros de película delgada biocompatibles tales como poliamida y parileno se han adoptado como sustratos favorables para MICROELECtrodo sondas 4-8. Una desventaja de las sondas flexibles es que son difíciles de insertar en el tejido neural. Los investigadores han adoptado diversos enfoques para facilitar la inserción de sondas flexibles mientras que preserva las propiedades mecánicas deseables. Una clase de diseños modifica la geometría de la sonda de polímero para aumentar la rigidez en ciertas secciones o ejes, manteniendo el cumplimiento de otras partes. Esto se ha logrado mediante la incorporación de costillas o capas de otros materiales de 9,10. Otro enfoque integra un canal de 3-D en el diseño de la sonda de polímero que se llena con material biodegradable 11. Esta sonda puede ser reforzada temporalmente, y después de la inserción del material en el que se disuelve el canal y se drena por la. Sin embargo, los métodos tales como estos que modifican de forma permanente la geometría del dispositivo implantado final, pueden comprometer algunas de las características deseables de la sonda flexible. Un método que tiene not alterar la geometría final sonda es encapsular el dispositivo de polímero con material biodegradable para endurecer temporalmente el dispositivo de 12 a 14. Sin embargo, los materiales típicos biodegradables tienen órdenes de módulos de Young de magnitud menor que la del silicio y se lo que exigen una mayor espesor para conseguir la misma rigidez. Adecuadamente el recubrimiento de la sonda puede resultar en una punta más redondeada o roma, lo que hace más difícil la inserción. Además, dado que los recubrimientos solubles están expuestos, hay un riesgo de que la disolución inmediatamente después del contacto, o incluso muy cerca, con el tejido. Otra clase de métodos utiliza materiales de sustrato nueva sonda que reducen la rigidez después de ser implantado en el tejido. Tales materiales incluyen polímeros con memoria de forma 15 y un nanocompuesto mecánicamente adaptativo 16. Estos materiales son capaces de disminuir en el módulo elástico significativamente después de la inserción, y pueden dar lugar a que sondas más estrechamente MatCh las propiedades mecánicas del tejido neural. Sin embargo, el intervalo alcanzable de la rigidez es todavía limitada, por lo que puede no ser capaz de proporcionar muy alta rigidez equivalente a la de silicio o de tungsteno cables. Así, en el caso de sondas flexibles que son muy largo (por ejemplo&gt; 3 mm) o que tienen muy baja rigidez, puede aún necesario un método para unir temporalmente un refuerzo más rígido. Otro método más prometedor reportado es recubrir un servicio de transporte de refuerzo con un auto-montaje permanente monocapa (SAM) para personalizar la interacción superficial entre el transbordador y la sonda flexible 17. Una vez seco, la sonda se adhiere a la lanzadera revestimiento electrostática. Después de la inserción, el agua migra sobre la superficie hidrófila, que separa la sonda de la lanzadera de modo que la lanzadera se puede extraer. Extracción de traslado con reducida desplazamiento de la sonda se demostró (85 micras). Sin embargo, con sólo interacciones electrostáticas que sostiene la sonda de tél lanzadera, hay un cierto riesgo de deslizamiento de la sonda con respecto a la lanzadera antes y durante la inserción. Hemos desarrollado un método en el que la sonda flexible está unido a un refuerzo con un material adhesivo biodissolvable temporal que sujeta firmemente la sonda durante la inserción. Las sondas utilizadas eran de poliimida, que tiene un módulo elástico del orden de 2-4 GPa. El refuerzo se fabrica a partir de silicio, con un módulo elástico de ~ 200 GPa. Cuando se conecta, la rigidez de la silicio domina, facilitar la inserción. Una vez insertado en el tejido, el material adhesivo se disuelve y el rigidizador se extrae para restaurar la sonda a su flexibilidad inicial. Hemos seleccionado polietilenglicol (PEG) como el material adhesivo biodissolvable. PEG se ha usado en aplicaciones implantados, como sondas neuronales, la ingeniería de tejidos, y 11,18,19 de administración de fármacos. Alguna evidencia sugiere que el PEG puede atenuar la respuesta neuroinflamatoria en el cerebrotejidos 18,20. En comparación con otros materiales posibles, incluyendo sacarosa, láctico-co-glicólico de ácido poli (PLGA), y el alcohol de polivinilo (PVA), el PEG tiene un tiempo de disolución en los fluidos biológicos que es de una escala adecuada para muchas cirugías de implantes (en el orden de los decenas de minutos, dependiendo del peso molecular). Además, es sólido a temperatura ambiente y líquida a temperaturas que van desde 50 hasta 65 ° C. Esta propiedad hace que sea especialmente adecuado para nuestro proceso de montaje de precisión. Por otra parte, similar a la SAM descrita en 17, el PEG disuelto es hidrófila, lo que facilita la extracción del rigidizador. Este enfoque ventajoso está habilitado de un nuevo diseño de refuerzo y metódico proceso de montaje que aseguran la cobertura adhesiva uniforme y una alineación precisa y repetible. Además del proceso de montaje, se presenta el método de aplicación del rigidizador extraíble durante la cirugía, así como un procedimiento in vitro para evaluar la extracción de la ITSffener. El protocolo presentado en el presente documento se supone que el usuario posee una sonda de microelectrodo de polímero flexible. La parte del protocolo en relación la fabricación del rigidizador y el montaje de esta sonda a un rigidizador asume acceso a las herramientas comunes que se encuentran en un centro de microfabricación. El protocolo relativo a la inserción y extracción probablemente se llevaría a cabo en un laboratorio de neurociencia de lucro.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Polyethylene glycol, 10,000 g/mol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>309028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flexible Sub-micron Die Bonder</td>
			<td>Finetech</td>
			<td>Fineplacer lambda</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1760-61</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digital Microscope</td>
			<td>Hirox</td>
			<td>KH-7700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dual Illumination Revolver Zoom Lens</td>
			<td>Hirox</td>
			<td>MXG-2500REZ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Precision Motorized Actuator</td>
			<td>Newport</td>
			<td>LTA-HS</td>
			<td>w/ CONEX-CC controller</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

insertion of flexible neural probes using rigid stiffeners attached with biodissolvable adhesive

Se espera que las matrices de microelectrodos para dispositivos de interfaz neural que están hechos de polímero de película delgada han extendido biocompatible para toda la vida funcional porque el material flexible puede minimizar la respuesta adversa del tejido causada por el micromovimiento. Sin embargo, su flexibilidad evita que sean insertados correctamente en el tejido neural. Este artículo muestra un método para unir temporalmente una sonda microelectrodo flexible a un refuerzo rígido usando polietilenglicol biodissolvable (PEG) para facilitar la inserción precisa, quirúrgica de la sonda. Un diseño único de refuerzo permite una distribución uniforme del adhesivo de PEG a lo largo de la longitud de la sonda. Unión flip-chip, una herramienta común utilizada en la microelectrónica de envasado, permite la alineación y el acoplamiento de la sonda precisa y repetible al rigidizador. La sonda y el rigidizador se implantan quirúrgicamente juntos, entonces el PEG se deja que se disuelva de manera que el refuerzo se puede extraer dejando la sondaen su lugar. Finalmente, un método de ensayo in vitro se utiliza para evaluar la extracción de refuerzo en un modelo en gel de agarosa de tejido cerebral. Este enfoque de la implantación ha demostrado ser particularmente ventajoso para las sondas más largas flexibles (&gt; 3 mm). También proporciona un método factible para implantar sondas flexibles de doble cara. Hasta la fecha, la técnica se ha utilizado para obtener diversos datos de la grabación en vivo de la corteza de rata.

Esta técnica de inserción se utiliza en conjunción con LLNL sondas de poliamida de película fina, que han pasado la norma ISO 10993 normas de biocompatibilidad y están destinados a la implantación crónica. Una sonda típica de poliimida de película delgada se ilustra en la Figura 1 junto con un refuerzo de silicio que es de aproximadamente 10 mm de largo en la región estrecha. Este refuerzo tiene un canal de efecto de mecha a lo largo de su longitud, como se muestra en la Figura 2. Figu...

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Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

La inserción de sondas flexibles de microelectrodos neurales está activada uniendo sondas para refuerzos rígidos con polietilenglicol (PEG). Un proceso de montaje único asegura uniforme y repetible de fijación. Después de la inserción en el tejido, el PEG se disuelve y el rigidizador se extrae. Un método de ensayo in vitro evalúa la técnica en gel de agarosa.

La inserción de sondas Flexible Neural Usando refuerzos rígidos adjuntos con Biodissolvable Adhesivo

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

insertion-flexible-neural-probes-using-rigid-stiffeners-attached-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.6K vistas.  Lawrence Livermore National Laboratory.  La inserción de sondas flexibles de microelectrodos neurales está activada uniendo sondas para refuerzos rígidos con polietilenglicol (PEG). Un proceso de montaje único asegura uniforme y repetible de fijación. Después de la inserción en el tejido, el PEG se disuelve y el rigidizador se extrae. Un método de ensayo in vitro evalúa la técnica en gel de agarosa. 

Video: Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

Colocación de sondas biológicas de biosensores ópticos de silicio mediante agentes de acoplamiento de silano

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Investigación

Bioingeniería

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

Aspiración Micropipeta de células adheridas a sustratos para estimar la rigidez Celular

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Creación de degradados adhesivas y soluble para la migración celular con imágenes de microscopía de fluorescencia

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an area of productive research with over 1,400 published animal studies in just the last 5 years. Numerous techniques have been developed for quantifying smooth muscle activity of the stomach, small intestine, and colon. In vitro and ex vivo techniques offer powerful tools for mechanistic studies of GI function, but outside the context of the integrated systems inherent to an intact organism. Typically, measuring in vivo smooth muscle contractions of the stomach has involved an anesthetized preparation coupled with the introduction of a surgically placed pressure sensor, a static pressure load such as a mildly inflated balloon or by distending the stomach with fluid under barostatically-controlled feedback. Yet many of these approaches present unique disadvantages regarding both the interpretation of results as well as applicability for in vivo use in conscious experimental animal models. The use of dual element strain gages that have been affixed to the serosal surface of the GI tract has offered numerous experimental advantages, which may continue to outweigh the disadvantages. Since these gages are not commercially available, this video presentation provides a detailed, step-by-step guide to the fabrication of the current design of these gages. The strain gage described in this protocol is a design for recording gastric motility in rats. This design has been modified for recording smooth muscle activity along the entire GI tract and requires only subtle variation in the overall fabrication. Representative data from the entire GI tract are included as well as discussion of analysis methods, data interpretation and presentation.

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

The in vivo measurement of smooth muscle contractions along the gastrointestinal tract of laboratory animals remains a powerful, though underutilized, technique. Flexible, dual element strain gages are not commercially available and require fabrication. This protocol describes the construction of reliable, inexpensive strain gages for acute or chronic implantation in rodents.

Fabricación e Implantación de miniatura Galgas Extensiométricas Dual-elemento de medición<em&gt; En Vivo</em&gt; Gastrointestinal contracciones en los roedores.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

El uso de adhesivo Patrones para construir dispositivos de microfluidos de papel 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing the complicated multi-bracket appliances to a simple two-bracket system for the purpose of force system evaluation will be the first step in this direction. However, much of the orthodontic biomechanics in this regard is confined to 2D experimental studies, computer modeling/analysis or theoretical extrapolation of existing models. The objective of this protocol is to design, construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the forces and moments generated by an archwire with a V-bend placed between two brackets. Additional objectives are to compare the force system generated by different types of archwires among themselves and to previous models. For this purpose, a 2 x 4 appliance representing a molar and an incisor has been simulated. An orthodontic wire tester (OWT) is constructed consisting of two multi-axis force transducers or load cells (nanosensors) to which the orthodontic brackets are attached. The load cells are capable of measuring the force system in all the three planes of space. Two types of archwires, stainless-steel and beta-titanium of three different sizes (0.016 x 0.022 inch, 0.017 x 0.025 inch and 0.019 x 0.025 inch), are tested. Each wire receives a single vertical V-bend systematically placed at a specific position with a predefined angle. Similar V-bends are replicated on different archwires at 11 different locations between the molar and incisor attachments. This is the first time an attempt has been made in vitro to simulate an orthodontic appliance utilizing V-bends on different archwires.

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

The method presented here is designed to construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the force system generated by different archwires with V-bends placed between two brackets. Additional objectives are to compare this force system with different types of archwires and to previous models.

Sistema Vertical V-se dobla la fuerza: una evaluación 3D In Vitro de arcos rectangulares rígidos y elásticos

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

Rat Model of Adhesive Capsulitis of the Shoulder

This proposal aims to create an in vivo rat model of adhesive capsulitis for researching potential treatment options for this condition and other etiologies of comparable arthrofibrosis. The model includes extra-articular fixation of the shoulder in rats via scapular to humeral suturing, resulting in a secondary contracture without invading the intra-articular space and resulting in decreased rotational ROM and increased joint stiffness.
We used 10 Sprague-Dawley rats for the purpose of this study. Baseline ROM measurements were taken before glenohumeral immobilization. The rats were subjected to 8 weeks of immobilization before the fixation sutures were removed and changes in ROM and joint stiffness were evaluated. To evaluate whether immobilization resulted in a significant reduction in ROM, changes in kinematics were calculated. ROM was measured at each time point in the follow-up period and was compared to the baseline internal and external ROM measurements. In order to evaluate the stiffness, joint kinetics were calculated by determining the differences in torque (text and tint ) needed to reach the initial external rotation of 60&#176; and initial internal rotation of 80&#176;.
After the removal of the extra-articular suture fixation on follow-up day 0, we found a 63% decrease in total ROM compared to baseline. We observed continuous improvement until week 5 of follow-up, with the progress slowing down around a 19% restriction. On week 8 of follow-up, there was still an 18% restriction of ROM. Additionally, on follow-up day 0, we found the torque increased by 13.3 Nmm when compared to baseline. On week 8, the total torque was measured to be 1.4 &#177; 0.2 Nmm higher than initial measurements. This work introduces a rat model of shoulder adhesive capsulitis with lasting reduced ROM and increased stiffness.

This protocol presents an in vivo rat model of adhesive capsulitis. The model includes an internal fixation of the glenohumeral joint with extra-articular suture fixation for an extended time, resulting in a decreased rotational range of motion (ROM) and increased joint stiffness.

Modelo de la rata de Capsulitis adhesiva del hombro

This proposal aims to create an in vivo rat model of adhesive capsulitis for researching potential treatment options for this condition and other ...

Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high cell isolation and a controlled environment. However, the survival of hippocampal cells in vitro is compromised: most cells die during the first week of culture. It is therefore of great importance to identify ways to increase the durability of neural cells in culture.
Calcium carbonate in the form of crystalline aragonite derived from the skeleton of corals can be used as a superior, active matrix for neural cultures. By nurturing, protecting, and activating glial cells, the coral skeleton enhances the survival and growth of these cells in vitro better than other matrices.
This protocol describes a method for cultivating hippocampal cells on a coralline matrix. This matrix is generated by attaching grains of coral skeletons to culture dishes, flasks, and glass coverslips. The grains assist in improving the environment of the cells by introducing them to a fine three-dimensional (3D) environment to grow on and to form tissue-like structures. The 3D environment introduced by the coral skeleton can be optimized for the cells by grinding, which enables control over the size and density of the grains (i.e., the matrix roughness), a property that has been found to influence glial cells activity. Moreover, the use of grains makes the observation and analysis of the cultures easier, especially when using light microscopy. Hence, the protocol includes procedures for generation and optimization of the coralline matrix as a tool to improve the maintenance and functionality of neural cells in vitro.

Dissociated hippocampal cell culture is a pivotal experimental tool in neuroscience. Neural cell survival and function in culture is enhanced when coralline skeletons are used as matrices, due to their neuroprotective and neuromodulative roles. Hence, neural cells grown on coralline matrix show higher durability, and thereby are more adequate for culturing.

Aumento de la durabilidad de cultivos de células neurales disociadas utilizando matriz coralina biológicamente activa

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

Análisis espaciotemporal bidimensional automatizado de sondas MÓVILES FRET de una sola molécula

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many biological and biomedical applications. However, long-term time-lapse SRS imaging of live cells has not been widely adopted. SRS microscopy often uses a high numerical aperture (NA) water-immersion objective and a high NA oil-immersion condenser to achieve high-resolution imaging. In this case, the gap between the objective and the condenser is only a few millimeters. Therefore, most commercial stage-top environmental chambers cannot be used for SRS imaging because of their large thickness with a rigid glass cover. This paper describes the design and fabrication of a flexible chamber that can be used for time-lapse live-cell imaging with transmitted SRS signal detection on an upright microscope frame. The flexibility of the chamber is achieved by using a soft material - a thin natural rubber film. The new enclosure and chamber design can be easily added to an existing SRS imaging setup. The testing and preliminary results demonstrate that the flexible chamber system enables stable, long-term, time-lapse SRS imaging of live cells, which can be used for various bioimaging applications in the future.

We report a stage-top, flexible environmental chamber for time-lapse imaging of live cells using upright stimulated Raman scattering microscopy with transmitted signal detection. Lipid droplets were imaged in SKOV3 cells treated with oleic acid for up to 24 h with a 3 min time interval.

Una cámara flexible para imágenes de células vivas de lapso de tiempo con microscopía de dispersión Raman estimulada

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...