Nos gustaría reconocer que esta técnica fue descrita originalmente por Esparta et al., 2012, y ha sido fácilmente adaptado para su uso en nuestro laboratorio.

* Todos los materiales, junto con los respectivos fabricantes y / o proveedores se enumeran a continuación el protocolo. 1. Asamblea de los implantes <ol><li> Preparar una mezcla de epoxi curable por calor de fibra óptica mediante la adición de 100 mg de catalizador a 1 g de resina. </li><li> Mida y corte aproximadamente 35 mm de fibra óptica de 125 micras con núcleo de 100 micras al anotar con un escribano de cuña punta de carburo. Coloque el escribano perpendicular a la fibra óptica y la puntuación en un movimiento único, unidireccional. Cortar la fibra completamente dañará el núcleo de la fibra. </li><li> Inserte un casquillo cerámico LC con un 127 micras llevaban en el vicio, con el lado convexo hacia abajo. </li><li> Insertar la fibra óptica en el casquillo. La fibra óptica debe deslizarse suavemente y ligeramente sobresale más allá del extremo convexo de la férula (Figura 1a). </li><li> Aplique una gota de epoxi fibra termocurable óptico hasta el extremo plano y el calor con una pistola de calor hasta que se vuelve negro epoxy. El epoxi debellenar la férula medida que se calienta y curado antes. El epoxi se cura dentro de ~ 1 min de la aplicación de calor constante. </li><li> Limpiar cualquier epoxi a lo largo de los lados de la virola, como se obstruirá interfaz con el acoplador. </li><li> Pulir el extremo convexo de la férula utilizando un disco de pulido LC fibra óptica (FOPD) en hojas de óxido de aluminio de pulido sobre la almohadilla de pulido (Figura 1b). Haga movimientos circulares de rotación y pulir en cuatro grados en el siguiente orden: 5, 3, 1 0,3 micras grano. </li><li> Cortar la fibra óptica en el extremo plano a la longitud adecuada de manera que se dirige a la región de interés. La longitud puede ser determinada usando el atlas estereotáxico. </li><li> Probar el implante mediante la conexión al láser a través del cable del acoplador se describe a continuación. El extremo pulida del implante se inserta en el manguito del acoplador y debe estar en contacto directo con el casquillo opuesto. El implante debe ser capaz de mantener 10 mW de salida de luz, medida en la punta de the implante de fibra. Un implante mal tendrá un punto focal débil cerca de la punta de la fibra óptica. </li><li> La tienda de los implantes acabados (Figura 1c) en la espuma hasta su uso. </li></ol> 2. Asamblea de cable de fibra óptica acoplador <ol><li> Preparar una mezcla de epoxi curable por calor de fibra óptica como anteriormente. </li><li> Medir y cortar una longitud apropiada de fibra óptica 220 micras con núcleo de 200 micras al anotar con una punta trazadora de cuña punta de carburo. La longitud de la fibra debe permitir el ratón para mover libremente alrededor de la vivienda, pero no permiten el ratón para masticar a través de la fibra. </li><li> Insertar la fibra óptica en una longitud de tubería de bifurcación ligeramente más largo que la longitud de la fibra óptica. El tubo debe tener un diámetro interior ligeramente mayor que el de fibra óptica. </li><li> Franja de ~ 25 mm en un extremo de la fibra óptica y la inserta en el extremo metálico de un multimodo MM FC Ferrule Asamblea con 230 micras llevaba hasta el tope. La fibra óptica debe sobresalir a través de la ferrufinal le (Figura 2a). </li><li> Asegurar la conexión con cianoacrilato (pegamento) en el extremo de metal. Cubra la conexión con un conector de arranque y pulir el final con una férula FOPD FC. Haga movimientos circulares de rotación y pulido en cuatro grados en el siguiente orden: 5, 3, 1, 0,3 m de grano (Figura 2b). </li><li> Pelar y el otro extremo de la fibra óptica en un LC de casquillo cerámico (230 micras Identificación del orificio de fijación) con el extremo distal convexa. Aplique una gota de epoxi para el extremo plano y el calor hasta que esté curado. </li><li> Pulir el extremo convexo de la férula utilizando un FOPD FC en hojas de aluminio pulido de óxido como se ha descrito anteriormente. </li><li> Deslizar un manguito LC collar sobre el extremo convexo de la férula hasta el punto medio del manguito. </li><li> Lugar de calor tubo retráctil sobre el tubo de bifurcación y el manguito y el calor para asegurar y proteger la conexión (figura 2c). </li><li> Pruebe el acoplador mediante la conexión a la fuente de láser y la medición de la luz Sal.ut a través del acoplador con un espectrofotómetro. La pérdida de luz entre la salida del láser y la salida del acoplador medido no debe exceder de 30%. </li></ol> 3. Implantación quirúrgica * Este es un procedimiento puntas de sólo. Los instrumentos son estériles pero los guantes no necesitan ser debido a la manipulación constante entre los instrumentos y el equipo. <ol><li> Se anestesia el ratón con una inyección intraperitoneal de ketamina / xilazina mezcla de 100 y 10 mg / kg, respectivamente, utilizando una aguja de calibre 30. </li><li> Afeitar el cuero cabelludo con las tijeras. Limpie el cuero cabelludo con un 70% de alcohol isopropílico seguido de Betasept limpiar (4% de solución de clorhexidina) durante dos minutos, repitiendo una vez. </li><li> Coloque el ratón en la plataforma sterotaxic y asegurar la cabeza, asegurando que el cráneo es plano. Aplique ungüento oftálmico de los ojos para evitar la sequedad y el dolor postoperatorio. Mantenga la anestesia con isoflurano volatilizado (1-3% diluido con oxígeno en función del estado fisiológico del mouse, que deben ser controlados continuamente por la respuesta a un pinzamiento del rabo). </li><li> Hacer una incisión a través de la línea media del cuero cabelludo, el cráneo de la exposición de las órbitas de los ojos de lambda. Empujar a un lado del tejido conectivo como sea necesario. </li><li> Utilice abrazaderas Serafin para contener la piel y mantener un acceso al cráneo (Figura 3a). </li><li> Etch un patrón de cuadros a lo largo de la superficie del cráneo con un palillo de dientes. Lave los residuos lejos con solución salina estéril. Secar bien. </li><li> Aplicar el peróxido de hidrógeno (3%) en el cráneo expuesto con un bastoncillo de algodón para ~ 2-3 seg para crear microporos. Lavar varias veces y secar bien. Alternativamente, las anclas pueden ser atornillado en el cráneo, como se describe en Sparta et al. (2012). </li><li> Una vez más, grabar un patrón de cuadros en todo el cráneo con un palillo de dientes y lavar los restos con solución salina. Secar bien. </li><li> Uso de una herramienta rotativa, hacer un pequeño agujero de Burr craneotomía (&lt;1 mm de diámetro) con una broca estéril(Autoclave) por encima de la región de interés, determinado por el atlas estereotáxico calibrado a bregma y lambda. Tenga cuidado de no romper la dura o dañar ningún tejido. Lavar y secar bien los residuos. </li><li> Insertar la férula de fibra óptica (implante) en el soporte de la sonda y conectar con el brazo estereotáxica. </li><li> Posicionar el implante en su sitio directamente encima de la región de interés utilizando el brazo estereotáxico (Figura 3b). Si la inserción de la fibra óptica en el tejido cerebral, la fibra debe avanzar lentamente a una velocidad de ~ 2 mm / min. La férula debe descansar en el cráneo restante. </li><li> Preparar una mezcla de cemento dental. La mezcla debe tener una viscosidad lo suficientemente baja como para aplicar fácilmente a través del cráneo. Mezcla será utilizable durante 2-4 min. </li><li> Usando un palillo de dientes estéril, aplicar una capa fina y uniforme de cemento dental a través del cráneo y sobre la parte inferior del implante. La capa de base de cemento dental debe cubrir la superficie tanto en el cráneo comoposible. No dejar que el cemento dental entrar en contacto con la piel del ratón. Esto conducirá a una mayor dificultad en la sutura, así como irritación para el ratón. Si el cemento dental entra en contacto con la piel, dejar que se seque parcialmente de tal manera que toda la capa de cemento se puede desprender antes de la configuración. </li><li> Deje que se seque por completo. </li><li> Aplicar incluso capas de cemento dental para formar un pequeño montículo sobre el cráneo y alrededor del implante, permitiendo que cada capa se seque por completo (Figura 3c). Deja ~ 3-5 mm del extremo convexo de la férula limpia de cemento para permitir una conexión sin problemas y sin obstrucciones. </li><li> Suture el cuero cabelludo sobre el montículo de cemento dental y alrededor del implante mediante estériles de un solo uso suturas de seda trenzadas (6-0) con una aguja C22. Quitar después de 7 días. Opcional: Bond Uso Veterinario para la unión adicional después de la sutura. Asegúrese de usar Bond Vet mínimo. El exceso puede causar daño grave en la piel debido a las ralladuras. </li><li> INMEDIATAMy después de la cirugía, el ratón debe ser inyectada por vía subcutánea con Ketprophen (5 mg / kg) para disminuir el dolor postoperatorio. Esto se debe repetir 24 horas más tarde. Aplicar analgésicos tópicos (bupivicaína) y antibióticos (Neosporin) a la piel se sutura y alrededor de la base del implante. </li><li> Coloque el ratón en una jaula sobre una manta de calefacción para la recuperación de la anestesia. Coloque el ratón en una jaula estéril, la recuperación postoperatoria. La jaula de recuperación no debería contener la ropa de cama con el fin de mantener la temperatura y evitar la asfixia. El ratón puede ser devuelto a la jaula original, o una nueva jaula una vez despierto. </li></ol> Ensamblaje correcto del implante de fibra óptica y los resultados del acoplador en una mínima pérdida de fotones entre la fuente de luz y el extremo de la fibra óptica en la región de interés. Bien pulido fibra óptica debe transmitir la luz de manera uniforme, concéntrico círculo (Figura 2d). Con la implantación cuidadosa y la sutura, el implante no causa irritación visible ael ratón y puede permanecer en su lugar para estudios a largo plazo (Figura 3D,&gt; 1 mes, observaciones no publicadas) sin ninguna degradación significativa de la fibra óptica o de la cantidad de luz transmitida. Implantación inadecuada o la sutura puede causar irritación y puede resultar en el ratón rascado a través de su cuero cabelludo, dejando al descubierto el cemento dental, o rotura de la virola del cemento dental debido a la manipulación persistente. Un diagrama esquemático del sistema ensamblado se puede ver en la Figura 4. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig1.jpg" /> Figura 1. Asamblea de la fibra óptica implantables. (A) La fibra óptica se inserta en el casquillo, que sobresale ligeramente más allá del extremo convexo indicado por la punta de flecha. (B) El extremo convexo de la férula se pule con un FOPD en grados progresivamente más finos de hojas de pulido. (C) El opt acabado de fibra implantableic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50004/50004fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig2.jpg" /> Figura 2. Asamblea de acoplador de fibra óptica utilizada para atar la fibra óptica de la junta rotativa al implante. (A) La fibra óptica se pegue a través del conjunto casquillo. (B) La parte del conjunto de casquillo se inserta en los grados FOPD y pulido utilizando progresivamente más finos de papel de pulido. (C) El manguito de casquillo está montado sobre el casquillo y se fija con tubo termocontráctil. (D) El acoplador de fibra óptica terminado debe producir una luz concéntrica con pérdida mínima de fotones. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig3.jpg" /> Figura 3. Implantación quirúrgica de las fibras ópticas. (A) La superficie entera de la cranium está expuesta y el tejido conectivo se borra. (B) El implante de fibra óptica se mantiene en posición con el brazo estereotáxica. (C) el cemento dental se aplica la fijación del implante de fibra óptica en el cráneo. (D)&gt; 1 mes después de la implantación, la piel se ha curado alrededor del implante y no hay signos de irritación. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig4.jpg" /> Figura 4. Diagrama esquemático del sistema funcional

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	<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neuronal+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Trangenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2.">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 (2007).</li><li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 165-16 (2010).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy.">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits:+technology+for+probing+mammalian+brain+structures.">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li><li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons.">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450, 420-424 (2007).</li><li>Sparta, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits.">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).</li><li>Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+transmission+from+the+amygdala+to+nucleus+accumbens+facilitates+reward+seeking.">Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking.</a> Nature. 475, 377-380 (2011).</li><li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+a+hippocampal+engram+activates+fear+memory+recall.">Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall.</a> Nature. 484, 381-385 (2012).</li></ol>

Optogenética es una técnica nueva y potente que permite un control sin precedentes sobre determinados subtipos neuronales. Esto puede explotarse para modular los circuitos neuronales con precisión anatómica y temporal, evitando al mismo tiempo la indiscriminada de tipo celular y efectos invasivos de la estimulación eléctrica a través de un electrodo. La implantación de la fibra óptica permite la estimulación consistente, crónica de los circuitos neuronales en varias sesiones en despierto, comportándose raton...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo o equipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> LC Ferrule manga </td><td> Precision Products fibra (PFP) </td><td> SM-CS125S </td><td> 1,25 mm ID </td></tr><tr><td> FC MM Pre-ensamblado Conector </td><td> PFP </td><td> MM-CON2004-2300 </td><td> 230 m Ferrule </td></tr><tr><td> Miller FOPD-LC Disc </td><td> PFP </td><td> M1-80754 </td><td> Para el LC casquillos </td></tr><tr><td> Bifurcación tubo </td><td> PFP </td><td> FF9-250 </td><td> 900 m OD, ID 250 micras </td></tr><tr><td> MM LC Memory Ferrule 1,25 mm </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-1270 </td><td> ID 127 micras Diámetro </td></tr><tr><td> MM LC Memory Ferrule 1,25 mm </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-2300 </td><td> 230 mID Bore </td></tr><tr><td> Heat epoxi curable, el endurecedor y la resina </td><td> PFP </td><td> ET-353ND-16OZ </td><td></td></tr><tr><td> FC / PC y SC / PC Conector de disco de pulido </td><td> Thorlabs </td><td> D50-FC </td><td> Por FC casquillos </td></tr><tr><td> Potencia óptica digital y medidor de energía </td><td> Thorlabs </td><td> PM100D </td><td> Espectrofotómetro </td></tr><tr><td> Polishing Pad </td><td> Thorlabs </td><td> NRS913 </td><td> 9 &quot;x 13&quot; 50 Durómetro </td></tr><tr><td> Óxido de aluminio Pulido (pulido) Hojas: 0,3, 1, 3, 5 sémola micras </td><td> Thorlabs </td><td> LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P </td><td></td></tr><tr><td> La fibra multimodo estándar Revestimiento Duro </td><td> Thorlabs </td><td> BFL37-200 </td><td> Bajo OH, 200 Core micras, 0,37 NA </td></tr><tr><td> Herramienta pelacables de fibra </td><td> Thorlabs </td><td> T10S13 </td><td> Clad / Coa: 200 micras / 300 micras </td></tr><tr><td> SILICA / sílice de fibra óptica </td><td> Polymicro Tecnologías </td><td> FVP100110125 </td><td> High-OH, UV mejorada, 0,22 NA </td></tr><tr><td> 1x1 junta rotativa con fibra óptica </td><td> lentes dóricas </td><td> FRJ_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> Mono con fibra óptica Patchcord </td><td> lentes dóricas </td><td> MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> Tubo termorretráctil, 1/8 pulgadas </td><td> Allied Electronics </td><td> 689-0267 </td><td></td></tr><tr><td> Heat gun </td><td> Allied Electronics </td><td> 972-6966 </td><td> 250 W, 750-800 ° F </td></tr><tr><td> Aplicadores con punta de algodón </td><td> Puritan Medical Products Company </td><td> 806-WC </td><td></td></tr><tr><td> Adhesivo de tejido Vetbond </td><td> Fischer Scientific </td><td> 19-027136 </td><td></td></tr><tr><td> Flash dentadura acrílica de base </td><td> Yates Motloid </td><td> ColdPourPowder + Liq </td><td></td></tr><tr><td> BONN miniatura Iris Scissors </td><td> Miltex Integra </td><td> 18-1392 </td><td> 3-1/2 &quot;(8,9 cm), hojas rectas, 15 mm </td></tr><tr><td> Johns Hopkins Bulldog Clamp </td><td> Miltex Integra </td><td> 7-290 </td><td> 1-1/2 &quot;(3,8 cm), curvada </td></tr><tr><td> MEGA-Torque eléctrico Motor Lab </td><td> Vector </td><td> EL-S </td><td></td></tr><tr><td> Panther Burs-Ball # 1 </td><td> Clarkson Laboratorio </td><td> 77,1006 </td><td></td></tr><tr><td> Violet Blue Laser System </td><td> CrystaLaser </td><td> CK473-050-S </td><td> Longitud de onda: 473 nm </td></tr><tr><td> Fuente de alimentación del laser </td><td> CrystaLaser </td><td> CL-2005 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 2 Pinzas laminectomía </td><td> Fine Ciencia Herramientas </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sonda </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 10140-02 </td><td></td></tr><tr><td> 5 &quot;Straight Hemostat </td><td> EXCELTA </td><td> 35-PH </td><td></td></tr><tr><td> Vise con base pesada </td><td> Altex Electronics </td><td> PAN381 </td><td></td></tr></tbody></table>

fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue

Elucidar los patrones de conectividad neuronal ha sido un reto tanto para la neurociencia básica y clínica. Electrofisiología ha sido el estándar de oro para el análisis de los patrones de conectividad sináptica, pero emparejados registros electrofisiológicos puede ser a la vez engorroso y limitar experimentalmente. El desarrollo de optogenética ha introducido un método elegante para estimular las neuronas y circuitos, tanto in vitro como in vivo 1 y 2,3. Mediante la explotación de células de tipo actividad promotora específica para conducir la expresión de opsina en poblaciones neuronales discretas, uno precisamente puede estimular genéticamente definidos subtipos neuronales en circuitos distintos 4-6. Métodos bien descritos para estimular las neuronas, incluyendo la estimulación eléctrica y / o manipulaciones farmacológicas, son a menudo de tipo celular indiscriminada, invasiva, y puede dañar los tejidos circundantes. Estas limitaciones podrían alterar la función normal sináptica y / o comportamiento del circuito. Además, debidoa la naturaleza de la manipulación, los métodos actuales son a menudo aguda y terminal. Optogenética proporciona la capacidad de estimular las neuronas de una manera relativamente inocuo, y en las neuronas genéticamente dirigidos. La mayoría de los estudios que implican en optogenética in vivo actualmente utiliza una fibra óptica de guía a través de una cánula implantada 6,7, sin embargo, las limitaciones de este método incluyen tejido dañado cerebro con la inserción repetida de una fibra óptica, y la rotura potencial de la fibra en el interior de la cánula. Dado el creciente campo de la optogenética, un método más fiable de la estimulación crónica es necesario para facilitar estudios a largo plazo con el mínimo daño tisular colateral. Aquí nos proporcionan nuestro protocolo modificado como un artículo de vídeo para complementar el método eficaz y elegantemente descrito en Sparta et al. 8 para la fabricación de un implante de fibra óptica y su fijación permanente en el cráneo de ratones anestesiados, así como el montaje de la fibraacoplador óptico de conectar el implante a una fuente de luz. El implante, conectado con fibras ópticas a un láser de estado sólido, permite un método eficiente para photostimulate crónicamente circuitería neuronal funcional con menos daño al tejido 9, usando pequeñas correas desmontables,. Fijación permanente de los implantes de fibra óptica proporciona coherente, a largo plazo in vivo en estudios optogenético de los circuitos neuronales en ratones despiertos, comportándose 10 con el daño tisular mínima.

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Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

El desarrollo de optogenética ahora proporciona el medio para estimular las neuronas precisamente definidos genéticamente y circuitos, ambos<em&gt; In vitro</em&gt; Y<em&gt; In vivo</em&gt;. Aquí se describe el montaje y la implantación de una fibra óptica para la fotoestimulación crónica del tejido cerebral.

La implantación de fibra óptica para la estimulación optogenético crónica en el tejido cerebral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

fiber-optic-implantation-for-chronic-optogenetic-stimulation-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

44.4K vistas.  Baylor College of Medicine (BCM). El desarrollo de optogenética ahora proporciona el medio para estimular las neuronas precisamente definidos genéticamente y circuitos, ambos In vitro Y In vivo. Aquí se describe el montaje y la implantación de una fibra óptica para la fotoestimulación crónica del tejido cerebral.

Video: Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful rest."1,2,3 It is thought the default mode network corresponds to self-referential or "internal mentation".2,3
It has been hypothesized that, in humans, activity within the default mode network is correlated with certain pathologies (for instance, hyper-activation has been linked to schizophrenia 4,5,6 and autism spectrum disorders 7 whilst hypo-activation of the network has been linked to Alzheimer's and other neurodegenerative diseases 8). As such, noninvasive modulation of this network may represent a potential therapeutic intervention for a number of neurological and psychiatric pathologies linked to abnormal network activation. One possible tool to effect this modulation is Transcranial Magnetic Stimulation: a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.9
In order to explore the default mode network's propensity towards and tolerance of modulation, we will be combining TMS (to the left inferior parietal lobe) with functional magnetic resonance imaging (fMRI). Through this article, we will examine the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools.

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the combination of TMS and fMRI to examine the effects of brain stimulation on the default network.

La combinación de Estimulación Magnética Transcraneal y fMRI para examinar la red en modo por defecto

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

Investigación

Neurociencias

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Uso del protocolo Theta-Burst para explorar Mechasnism de plasticidad en los individuos con el síndrome de X frágil y el autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

La dependencia estatal Efectos sobre la EMT: Una mirada a la conducta motriz fosfeno

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

El dispositivo de TMS NeuroStar: Realización de la FDA aprobó el Protocolo para el tratamiento de la depresión

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Transducción viral selectiva de adultos nacidos en las neuronas olfativas de las enfermedades crónicas En vivo Estimulación Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenético estimulación de comportamiento de escape en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Estimulación Optogenética del nervio auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, dystonia or tremor. DBS is based on the delivery of electrical stimuli to specific deep anatomic structures of the central nervous system. However, the mechanisms underlying the effect of DBS remain enigmatic. This has led to an interest in investigating the impact of DBS in animal models, especially in rats. As DBS is a long-term therapy, research should be focused on molecular-genetic changes of neural circuits that occur several weeks after DBS. Long-term DBS in rats is challenging because the rats move around in their cage, which causes problems in keeping in place the wire leading from the head of the animal to the stimulator. Furthermore, target structures for stimulation in the rat brain are small and therefore electrodes cannot easily be placed at the required position. Thus, a set-up for long-lasting stimulation of rats using platinum/iridium electrodes with an impedance of about 1 M&#937; was developed for this study. An electrode with these specifications allows for not only adequate stimulation but also recording of deep brain structures to identify the target area for DBS. In our set-up, an electrode with a plug for the wire was embedded in dental cement with four anchoring screws secured onto the skull. The wire from the plug to the stimulator was protected by a stainless-steel spring. A swivel was connected to the circuit to prevent the wire from becoming tangled. Overall, this stimulation set-up offers a high degree of free mobility for the rat and enables the head plug, as well as the wire connection between the plug and the stimulator, to retain long-lasting strength.

A method for implanting electrodes into the subthalamic nucleus (STN) of rats is described. Better localization of the STN was achieved by using a microrecording system. Furthermore, a stimulation set-up is presented that is characterized by long-lasting connections between the head of the animal and the stimulator.

Microelectrodos guiada implantación de electrodos en el Subtalámico Núcleo de ratas de largo plazo estimulación cerebral profunda

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo Optogenética Disección de circuitos del miedo en rodajas de cerebro

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...